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一种用于研究多种深度烧伤创面愈合过程的猪烧伤模型

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DOI：

10.3791/66362

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2024年2月23日

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1Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children’s Boston, 3Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Rennes University, 4SITI Laboratory, UMR, INSERM, Université de Rennes, 5Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 6Innovative Therapies in Haemostasis, INSERM UMR-S, University of Paris

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在尤卡坦微型猪中可重复的多深度烧伤伤口模型。

摘要

烧伤创面愈合是一个复杂而漫长的过程。尽管已有丰富的临床经验，整形外科医生及烧伤中心的专业团队仍面临诸多挑战。其中，烧伤后早期软组织损伤范围可能持续演变，使得保守治疗与坏死组织清除之间的决策变得尤为微妙。热力烧伤是最常见的类型，其烧伤深度受温度、接触时间等多种因素影响。烧伤深度亦随时间动态变化，继发性加重的 "阴影区" 仍是一种 poorly understood phenomenon。针对这些挑战，已有若干创新疗法被研究，更多疗法尚处于早期开发阶段。现代伤口敷料和人工皮肤中的纳米颗粒即为目前仍在评估中的现代疗法示例。总体而言，烧伤诊断与烧伤治疗均需重大进展，研究团队亟需一种可靠且相关的模型以测试新工具和新疗法。在动物模型中，猪因其皮肤结构与人类高度相似而成为最相关的模型。更具体而言，尤卡坦小型猪（Yucatan minipigs）具有黑色素色素沉着和生长缓慢等有趣特征，可用于研究高光型皮肤及长期愈合过程。本文旨在描述一种可靠且可重复的实验方案，用于在尤卡坦小型猪中研究多深度烧伤创面，实现长期随访，并为诊断与治疗研究提供相关模型。

引言

烧伤是一个重大的公共卫生问题，根据国家烧伤登记库的数据，每年在美国影响超过48万名患者1,2。这导致每年有超过5万名患者因非致命的复杂病例而住院，需要深入治疗2。此外，烧伤是军事人员死亡和伤病的根本原因之一，占军事伤亡人数的10%至30%3,4。尽管烧伤对患者的影响广泛而多样，涵盖身体、心理和情绪等多个方面，但其治疗方式在很长一段时间内几乎未发生改变5。

烧伤损伤的初步诊断和评估需根据烧伤类型（一度、二度和三度）或受损组织的深度（表浅、部分皮层和深层烧伤）进行基础分类6,7,8。部分皮层厚度烧伤（即一度和二度烧伤）累及表皮及真皮不同深度（浅层或深层真皮，即浅二度和深二度烧伤）9。特别是，深层真皮中附属器的损伤排除了来自附属器上皮再上皮化的可能性10。根据定义，全层厚度烧伤累及皮下脂肪、筋膜和/或深层肌肉（三度烧伤），有时甚至累及骨骼（亦称为四度烧伤）11,12。

住院后，烧伤患者需要接受特殊护理，其治疗策略在于精细地平衡组织清创与组织保留之间的关系。需要逐步清除受损和/或继发感染的软组织，直至暴露出健康组织，从而可使用特定敷料和皮肤移植来促进愈合过程13,14,15,16。然而，手术过程中必须谨慎操作，以避免意外切除正在愈合的组织，并减少并发症，实现最佳康复。从生物学角度看，烧伤区域表现为中央坏死区，周围环绕着一个“阴影区”或“淤滞区”，提示存在可逆性缺血的可能。该区域可能恶化，导致坏死范围扩大，也可能通过逆转凋亡过程而实现自我修复17,18。烧伤严重程度的这种变异性给外科医生的准确评估带来挑战，也使保守治疗与手术切除之间的权衡更加复杂19。迄今为止，尚无有效的工具可用于表征烧伤恶化前的这一"阴影区"。开发此类工具对于优化这一精细平衡至关重要。

已有多种治疗方法被测试以帮助减少继发性烧伤恶化，但目前临床尚无特定疗法18。烧伤治疗领域的其他进展还包括现代伤口敷料和纳米材料的开发20,21、组织工程皮肤22,23以及新型表皮培养技术24,25。此外，现代重建手术和筋膜皮瓣技术已改善了长期后遗症的管理，特别是关节屈曲部位病理性愈合后所导致的烧伤挛缩26,27。这些进步为烧伤患者带来了令人鼓舞的前景，显著改善了治疗策略和生活质量，但近期研究结果表明，其功能影响在身体和心理层面仍然显著28。综上所述，烧伤诊断与治疗领域对创新性进展的需求十分迫切。

总体而言，目前有许多方法致力于改善复杂烧伤病例的诊断、管理和治疗，研究人员需要一种可重复且相关的模型来测试这些新方法。由于烧伤涉及多个器官和全身性反应，具有较高的生物学复杂性，因此迄今尚无体外模型被证实适用于研究烧伤创面的病理过程29。啮齿类动物模型因在生物学、皮肤结构、弹性以及与深层组织粘附性方面与人类存在显著差异，导致其与人类情况存在重大偏差29。相比之下，猪模型因其皮肤结构与人类皮肤高度相似而被证实具有良好的相关性30,31,32。猪皮肤具有类似的血管分布、弹性纤维组成以及表皮更新周期。此外，其毛囊和顶泌汗腺附属器支持岛状再上皮化，这与临床观察到的浅表烧伤愈合过程相似33,34。特别是尤卡坦微型猪模型具有一些独特优势，使其成为研究色素性皮肤35以及长期预后且体貌变化最小化的理想模型36。

本文旨在描述一种在尤卡坦猪中建立的可靠的多度烧伤模型，可在同一受试动物身上研究多种二度和三度烧伤。该模型为烧伤诊断与治疗新技术的研究提供了相关且可重复的实验平台。此外，该模型具备不同类型的烧伤及其严重程度、可进行长期随访以研究烧伤挛缩及病理性愈合过程，并具有色素性皮肤的差异化反应特征，而后者已被证实具有特定的生物学特性。

方案

所有动物实验均按照 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）清单37 进行，并符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）第 #2021N000271 号方案的要求。动物福利遵循《实验动物护理与使用指南》38。本实验共使用了五只30 kg的雌性尤卡坦小型猪，动物来源于商业供应商（见材料表）。

1. 术前护理与麻醉

  1. 实验前禁食动物12小时 全身麻醉
  2. 通过肌肉注射2-4 mg/kg盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮以及1-2 mg/kg赛拉嗪启动麻醉，随后吸入异氟烷（氧气中浓度2-3%）（参见 材料表用于在手术过程中维持麻醉。

2. 烧伤创面设计与随机分组

  1. 为了在同一动物身上研究部分厚度烧伤和全层烧伤，并设置阴性对照（避免个体间差异），在每只猪背部旁正中区域制造八个伤口。其中三个为全层厚度伤口，三个为部分厚度伤口，两个为对照伤口。
  2. 将伤口编号为1至8，并进行随机化分配，以将不同烧伤程度（部分厚度、全层厚度、对照）分配至背部不同的解剖位置。
    注意：对每个伤口（深度和位置）进行随机化是为了提高实验的显著性：已知猪的真皮层在厚度和胶原组成上存在差异39。因此，在每只动物身上进行随机化可减少潜在的偏差。

3. 纹身伤口边界界定

注意：第一个步骤包括在猪的背部制作圆形纹身，以定位并编号随机分布的伤口（图1）。该步骤在首次烧伤操作前两天进行，以利于动物更好地适应环境，但也可在烧伤操作当天进行。

  1. 麻醉后（见步骤1） ，在仰卧位进行经口插管40，然后将猪转为俯卧位，并在动物身下放置软楔形垫（床单），以提高其舒适性和稳定性（置于前肢、脐部区域和后肢下方）41。在动物头部和颈部覆盖暖风毯，以维持适当的体温。
  2. 在猪背部中央画一条直线，以便对称绘制标记。
  3. 使用皮肤标记笔（见材料表）在中央线两侧各6.5 cm处画两条垂直线。这两条侧线将用于确定圆心位置。
  4. 对称绘制四对直径为4.5 cm的圆，不同圆之间的最小间距应保持在4 cm以上（图1A）。
  5. 完成绘图后，进行单步皮肤准备（使用7.5%聚维酮碘），以减少皮肤表面的细菌菌群。
  6. 使用纹身针机、无菌黑色墨水和已灭菌的五点针头（见材料表），对八个直径4.5 cm的圆进行纹身操作42。最终效果如图1B所示。
  7. 若延迟进行烧伤造模操作，需在纹身处涂抹三种抗生素软膏，并用透明粘性敷料覆盖。

4. 烧伤创面制备与高级伤口敷料

注意：烧伤将通过将黄铜块置于指定位置（随机化）的皮肤上接触30秒（固定不变）来产生。温度将决定烧伤深度。

  1. 在烧伤操作当天，动物麻醉后按步骤1所述置于俯卧位，将圆柱形黄铜块放入装有铝珠的不锈钢容器中（见 材料表）。将容器置于控温加热板上。将一个加热板设定为 65 °C（用于部分厚度烧伤），另一个设定为 93 °C（用于全层烧伤）。 图2).
    注意：容器可保持干燥状态以避免烫伤（需2-3小时达到温度平衡），或注入半满的水（30分钟达到温度平衡）。若使用水，黄铜块需在步骤4.5之前彻底干燥，以防止因热水残留导致后续烫伤。
  2. 将温度计插入黄铜圆筒中 通过 通过其中心开口监测其核心温度，并使用测温枪确认表面温度。如有需要，尽管存在轻微的热量散失，仍可将加热板温度升高至65 °C或93 °C。
    注意：可使用铝箔覆盖容器，以进一步减少热量散失，更快达到目标温度。
  3. 同时，将动物置于俯卧位，以进行烧灼操作，该体位与纹身操作（步骤3.1）相同。
  4. 动物俯卧位准备就绪后，按以下三步进行皮肤准备（7.5%聚维酮碘、0.9%生理盐水、干燥）。
  5. 使用耐热手套握住黄铜块，并根据随机分组将其放置于指定的纹身处。一旦黄铜块接触皮肤，立即启动计时器。注意不要对皮肤施加超过黄铜块自身重量的压力。
  6. 30 秒后，将黄铜块从皮肤上移开，并放回其专用的加热容器中。监测温度直至达到目标值，然后对所有伤口重复此操作。
  7. 进行多层高级敷料处理，以确保动物恢复后敷料的稳定性。
    1. 在每个烧伤部位（包括对照部位）放置一块浸有石油的纱布，然后覆盖无纺干纱布和大面积透明粘性敷料。
    2. 在周围皮肤上喷洒苯甲酸酊溶液，以增强透明敷料与皮肤的粘附性。
    3. 用自粘性绷带包裹动物时，注意不要包扎过紧（以免限制肺容积）。
    4. 通过添加一层管状弹力绷带（尺寸根据动物调整）完成包扎（参见 材料表). 或者，可使用定制的猪用背心 被使用 如果动物无法在整个研究期间保持敷料清洁
    5. 注射单剂布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，肌内注射）和单剂卡洛芬（2–4 mg/kg，肌内注射）后，在动物颈部贴敷透皮阿片类药物（芬太尼）贴剂，以确保适当的镇痛效果。
    6. 每次麻醉后，需在动物恢复后密切监测长达2小时。必要时使用加热垫，并在动物完全恢复直立姿势后自由提供食物。

5. 全层烧伤焦痂切开术

注意：动物在三度烧伤后 1 至 3 天内，将接受焦痂的全层手术切除。

  1. 在对动物进行类似的准备（包括麻醉、插管并将动物置于仰卧位）后，通过三步皮肤准备法处理皮肤，并对动物背部进行无菌铺巾。
  2. 使用4 mm打孔活检器（见材料表）对伤口进行活检，以确认损伤类型。
  3. 使用无菌手术刀片（n°15）围绕焦痂做环形切口，直至达到真皮深层，完成焦痂切开术43,44。
  4. 用无菌Adson组织钳（带2/1齿）牢固夹住焦痂一侧（见材料表），向上提起以显露焦痂的深层边界。
  5. 继续使用手术刀片沿同一平面在真皮深层/深部筋膜层进行焦痂切开。真皮层出血被视为组织存活的标志。
    1. 若操作过程中损伤小动脉，可使用双极电凝钳进行最小范围的电灼止血（见材料表）。注意：对创面床进行广泛电灼可能导致愈合延迟，应严格避免。
  6. 在放置最终敷料前，先在创面床上覆盖一层干纱布，持续5分钟，以增强局部止血效果。
  7. 按前述方法（步骤4.7）类似地包扎伤口，并额外添加数层干纱布填充创腔。依次应用之前所述各层材料：苯甲酸酊喷雾、粘性透明敷料、自粘绷带、管状网状绷带。
  8. 通过更换阿片类透皮贴剂并注射卡洛芬（2–4 mg/kg，肌内注射）提供镇痛治疗。

6. 后续伤口敷料处理

注意：后续换药频率为每2至7天一次，具体取决于实验处理设计及动物的耐受情况。可在21天后停止换药，以在干燥环境中促进再上皮化，并提高动物的耐受性。或者，若处理组需要湿润或潮湿环境，可将换药时间延长至研究结束。随访期最长延长至10周，以便研究急性期和长期的愈合过程。

  1. 短暂麻醉 动物，并将其置于仰卧位，使用鼻罩（异氟烷 2-5 L/min）。
  2. 移除之前的敷料，并使用无菌 0.9% 氯化钠溶液和无菌纱布清洁伤口。
  3. 如适用，施加实验性处理。
  4. 若研究需要，可在本操作过程中进行后续活检。随后应给予动物镇痛药物，例如卡洛芬（2-4 mg/kg，肌内注射，作用持续 24 小时）。
  5. 使用凡士林浸渍或同等材质的纱布、干燥的非织造纱布以及透明粘性敷料覆盖所有伤口部位，包括对照伤口。

结果

图2A、B展示了在尤卡坦微型猪背部进行多次烧伤后的结果。伤口（I）和（VII）为对照伤口（37 °C）。二度烧伤伤口（II、III和VIII）表现为明显红斑和水疱。相比之下，三度烧伤伤口（IV、V和VI）呈苍白外观，触诊时质地坚硬。值得注意的是，伤口VIII的表现介于二度与三度之间：为了正在进行的研究目的，我们将65 °C条件下的接触时间延长至45秒。图2C展示了术后第3天焦痂切开术后的伤口外观。对二度烧伤伤口进行了水疱切除术，对三度烧伤伤口则进行了坏死组织的整块切除，以形成可用于二期愈合的活性创面床。若真皮丛出血未自行停止，则进行最小范围的电凝止血。图2D–F分别展示了后续不同时间点（第2周、第3周和第7周）的伤口外观。

组织学结果如图所示 图3 （H&E，5.5倍和20倍）。对照皮肤（图3AB) 显示表皮完整（蓝色括号），包括一层角质层（蓝色箭头）附着于其余皮肤组织。真皮层呈现均匀的淡粉色嗜酸性染色（胶原纤维和弹性纤维——红色星号）。二度烧伤（图3D，E）与对照组相比显示出角质层的缺失（裂解平面，对应于水疱形成处）。浅层真皮表现出更强的嗜酸性以及真皮结构内的裂隙或断裂（蓝色箭头）。深层血管得以保留（红色箭头）。三度烧伤（图3G，H) 显示皮肤组织损伤广泛，真皮嗜酸性粒细胞增多，并伴有严重的真皮断裂（蓝色箭头），断裂延伸至真皮深层至皮下组织（脂肪细胞空泡化，绿色星号）。最后，三色染色（图3C，F，I) 有助于更准确地评估结缔组织，其利用热变性胶原蛋白着色性的差异来显示烧伤深度。 图3C 清晰显示对照组伤口活检中完整真皮层内的蓝色特征，并可见表皮上层。这与二度烧伤形成对比 (图3F), 表皮缺失的同时伴有真皮上层胶原蛋白的变性（白色星号）。最后，三度创面 (图 3I) 显示表皮层缺失，真皮层出现广泛红色染色（黄色箭头），表明该皮肤层的胶原蛋白已完全变性。

热损伤诱导示意图；加热铜块法；烧伤程度的实验装置。
图1：手术室中烧伤装置的布置及研究设计。 动物经麻醉、插管、机械通气后仰卧位固定。将铜块置于预热的容器中，容器内装有铝珠，可选择性加入水。将温度计置于铜块中心，以监测其核心温度。目标温度根据研究设计中拟诱导的烧伤深度而定。为制造浅二度烧伤，建议在65 °C下接触30秒，不施加额外压力；为制造三度烧伤，建议在93 °C下接触30秒，不施加额外压力。应随机分配二度和三度烧伤的位置，以避免因皮肤厚度差异导致的偏倚。预先纹色标记的创面位置有助于在随访期间对每个随机分配的创面进行便捷监测。请点击此处查看该图的放大版本。

皮肤移植实验、伤口愈合进程、临床研究、实验设置观察。
图 2：尤卡坦小型猪随机多深度烧伤后伤口表现的代表性结果。（A）纹身标记操作通过在全部8个伤口位置处进行标记完成，每个位置均编号以方便监测。（B）烧伤造模后伤口的表现。I 和 VII 号伤口为对照，II、III 和 VIII 号伤口为浅层部分厚度烧伤，IV、V 和 VI 号伤口为全层厚度烧伤。（C）术后第3天（POD3）对全层厚度烧伤伤口行焦痂切开术后的表现；同时对部分厚度烧伤伤口进行了水疱切除术。（D）术后第14天（POD14）伤口愈合的表现，显示全层厚度烧伤伤口（II 和 V）形成清洁的伤口床，部分厚度烧伤伤口（III、IV、VI、VII、VIII）可见来自皮肤附属器的再上皮化岛。（E）术后第21天（POD21）伤口愈合过程的表现，显示全层厚度伤口床出现收缩，部分厚度伤口进一步再上皮化。（F）术后第49天（POD49）伤口的表现，显示全层厚度烧伤伤口显著收缩，部分厚度烧伤伤口接近完全上皮化，并伴有明显的炎症后色素沉着。请注意，图中所示伤口可能包含活检部位的瘢痕。请点击此处查看该图的高清版本。

烧伤创面愈合；组织学比较；对照组、二度、三度烧伤；组织再生分析
图3组织学结果。 伤口组织学特征的代表性结果［光学显微镜 10×（A,C,D,F,G,I）和 20x（B,E,H）；苏木精和伊红（A,B,D,E,G,H）；马松三色染色（C,F,I对照皮肤（A,B)显示完整的表皮（黑色方括号），包括附着于其余皮肤组织的角质层（黑色箭头）。真皮呈现均质的淡粉红色嗜酸性结构（胶原纤维和弹性纤维——红色星号）。三色染色（C)显示表皮层、结缔组织及真皮胶原纤维形态正常。二度烧伤（D,E) 显示与对照组相比表皮角质层缺失（水疱切除术中移除的裂开平面）。浅层真皮呈现更强的嗜酸性染色以及真皮结构内的裂隙/断裂（蓝色箭头）。深层血管得以保留（红色箭头）。三色染色（F)显示上皮组织丧失，并伴有真皮上层胶原蛋白变性（黄色箭头）。三度烧伤（E,F显示皮肤层嗜酸性粒细胞显著增多，并伴有严重的真皮断裂（蓝色箭头），损伤延伸至真皮深层至皮下组织（脂肪细胞空泡化，绿色星号），以及三色染色显示真皮层广泛红色染色（I，黄色箭头），提示胶原蛋白完全变性。比例尺： A,D,G, 500 µm; B,E,H, 100 µm; C,F,I, 200 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

静力学平衡分析；示意图、实验装置图、力学研究用实验设备。
图4：用于制造烧伤创面的黄铜块的工程设计图。（A）展示用于制作黄铜块的尺寸示意图。40 mm的直径可产生大小适中的创面，同时可在20–30 kg的尤卡坦微型猪上设计8个创面。（B）显示黄铜块最终结构的示意图，其中央设有通道，以便温度计测量黄铜块的核心温度。（C）显示黄铜块被加热至65 °C的图像，温度由水银温度计显示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

烧伤后的伤口愈合是一个漫长的过程，可能持续数月之久，期间存在多种治疗选择并需考虑患者护理的诸多因素2,13。为了研究这一过程，需要建立一种可靠且可重复的模型。已有多种动物模型被描述，主要包括啮齿类动物29,45,46和猪29,47。其中，猪的模型更具相关性，因其皮肤结构与人类皮肤相似34,48。成年猪的体型允许在同一动物身上制造多个伤口，从而提高统计学显著性，并消除实验处理组与其对照组之间的个体间差异7。我们建议根据体重而非年龄来选择实验对象。当前模型可在不超过总体表面积10%的前提下制造最多8个伤口，从而避免血流动力学影响，并使疼痛处于可控范围。

一个关键点与猪的品种有关。尽管目前大多数已有的猪实验方案均采用约克夏猪29,31,47,48，但我们选择尤卡坦小型猪模型是基于多个原因。首先，该小型猪品种在随访期间体重增长极少36,49，这有助于最大限度地减少因生长导致的创面大小变化，从而实现更可靠的个体内部比较。与约克夏猪相比，其体重变异更小，也有助于更优地优化麻醉药物的剂量。其次，尤卡坦小型猪皮肤中黑色素含量较高，这对于研究色素性皮肤对烧伤的反应及愈合过程具有重要意义，提示其在人类皮肤光型3至6型中的适用性更佳35,50,51。Rice 等人发现，在采用皮肤磨削术治疗化学烧伤后，尤卡坦猪与普通白猪之间存在显著的愈合差异52。此外，临床上较高光型的皮肤表现出更高的病理性瘢痕发生率，例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩53,54,55，尽管红杜洛克猪在增生性瘢痕评估方面似乎仍是最准确的模型34,56。此外，色素沉着的愈合表皮也使得从创面外缘以及皮肤附属器评估再上皮化过程更为容易。最后，该模型表现出明显的炎症后色素沉着（图2D-F），这一特征也值得进一步研究。其他研究者曾利用该小型猪模型研究药物性皮肤毒性和光毒性，发现其对人类安全性和有效性的预测值分别高达89%和100%57。尽管这些特征突显了尤卡坦小型猪模型在创面愈合研究中的重要性，但在烧伤领域的相关文献仍较为匮乏。因此，有必要建立一种可重复的模型，以支持对烧伤创面愈合过程以及各类诊断和治疗干预措施的研究。

已有文献描述了在猪模型中研究烧伤的既往方案。Branski 等人58于2008年发表了一种使用加热至200 °C的铝棒制备全层热接触烧伤的模型。该技术借鉴了此前多项研究，通过在铝棒上连接一个50 mL注射器来实现可控压力。尽管这一设计具有相关性，因为压力会影响烧伤损伤的程度，但其装置的精确性可能存在不足（例如未考虑操作者施加在注射器上的压力，且压力水平依赖于活塞位置的变化）。最近，Kim 等人59和Seswandhana 等人60报道了一种使用定制电加热装置并具备温度控制功能的可重复烧伤模型。两种装置均包含用于测量向下作用力的压力监测系统。如Kim所述，反馈回路可实现在接触过程中同时维持核心和表面温度。两位作者均证实烧伤深度与压力之间具有良好的相关性，强调了压力控制的重要性。本研究中，除黄铜块自身重量外，未施加任何额外压力，操作者的动作仅限于稳定装置。目的是简化模型并尽量减少变量数量。Fan 等人61描述了一种类似模型，使用经甘油填充改装的电烙铁，但其缺点在于会引入额外的界面热阻。烧伤块由黄铜制成，其比热容（c）为395 W/m·K，导热系数（k）为134 J/kg·K1。与其他常见金属相比，例如铁（c = 490 W/m·K，k = 66 J/kg·K）和铝（c = 949 W/m·K，k = 240 J/kg·K），这些特性使得黄铜块能更快达到目标温度，并能迅速将最大热量传递至皮肤以形成烧伤。为提高可重复性，图4展示了用于制造烧伤的黄铜块的结构特征。图4A为黄铜块的工程图纸，所有尺寸单位为毫米。如图所示，该块体外径为40 mm，高度为151 mm。虚线表示贯穿块体的同轴孔，用于插入温度计，孔径为9 mm，深度为128 mm。图4B、C显示了将温度计插入黄铜块以测量核心温度的情况。

当前模型的一个局限性在于，由于肋状凸起的存在，导致出现未烧伤区域，这在浅层部分厚度烧伤中尤为明显（图2）。这些未烧伤区域可能作为角质形成细胞迁移的中央来源，从而影响再上皮化过程。然而，在使用硬质材料制造烧伤模型时，似乎难以避免这一问题。此外，未烧伤区域的总面积较小，且黄铜块的直径为4 cm，提供了足够的创面面积，即使需要多次打孔活检，仍可支持长期随访研究。

另一个主要变量是全层烧伤切痂术的时机，本方案中计划在术后第3天（POD3）进行。选择这一延迟时间点旨在针对存在延迟性组织损伤的区域，该区域在临床实践中也被称为烧伤创面恶化区。62,63目的是清除所有受损组织，此时焦痂具有较好的完整性，有利于清创操作。该时间点还允许研究旨在减少延迟性损伤的早期干预措施 "阴影区" 例如抗炎剂64,65,66干细胞治疗18,67,68，冷疗69，或抗凝治疗65,70,71 最长可达3天。此外，尽管大多数作者描述的随访期较短，为2至4周29,47此处采用了8至10周的延长随访期，以便不仅研究急性期，还可观察继发性愈合过程。

在此次延长的随访期间，术后护理和伤口敷料至关重要：团队需要接受培训，以对动物提供充分的护理。尤卡坦猪品种常出现皮肤干燥，需每周多次涂抹保湿乳液，以减轻瘙痒症状，瘙痒是不适的表现，可能导致动物对伤口进行自我损伤。本文所述的多层敷料方案，是本中心在类似模型中多年实践经验的成果7,72。动物未表现出不适或疼痛的迹象。研究中未发现感染，但仍需在最初两周内每日监测，以便尽早发现这些潜在并发症。这突显了安全性和动物福利合规性在现代研究中的极端重要性。我们选择在3周后停止敷料，以促进空气暴露和干燥性再上皮化73,74。然而，在当前利用基于纳米颗粒20和交联凝胶35促进烧伤伤口愈合的时代，可将闭塞性敷料持续应用于本方案中。

最后，该模型的一个重要特征是可以在同一受试个体中研究不同深度的伤口。组织学结果证实了该方案在此方面的相关性。这一特性对于诊断目的具有重要意义，例如用于辅助测量烧伤深度的新技术、评估初始阶段的病情恶化或愈合过程中的改善情况，同时也可用于评估新疗法及其在一度、二度和三度烧伤中的差异性作用。由于愈合过程在很大程度上取决于初始烧伤深度，该模型能够在避免个体间差异的情况下，测量潜在疗法的差异性效应。然而，该模型的一个局限性在于，在同一只动物身上混合多种烧伤类型，使得无法评估诸如基质金属蛋白酶、促炎和抗炎细胞因子等系统性生物标志物，这些标志物已知会随伤口深度和总体烧伤体表面积而变化75。

综上所述，目前的尤卡坦小型猪烧伤模型因其能够为研究烧伤后的伤口愈合提供一个可靠的平台而具有显著优势。利用猪皮肤与人类皮肤在生理上的高度相似性，该动物模型具备若干独特优点，包括可进行个体内的对照比较，以及可在单只动物身上同时容纳多种类型的伤口。可重复的烧伤诱导技术、干预时机的选择以及延长的随访时间，是提升该模型临床相关性与可靠性的关键因素。尤卡坦猪的皮肤可用于研究色素性皮肤所特有的现象，例如增生性瘢痕和炎症后色素沉着。新型诊断工具旨在帮助临床医生判断“"阴影区"”烧伤转化，以及诸如纳米颗粒或3D打印皮肤移植物等现代治疗方法，这些均体现了建立此类珍贵的临床前模型以研究烧伤急性期、延迟期及长期阶段的必要性。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了Shriners儿童医院研究基金对S.N.T.的慷慨资助。Y.B.获得了Shriners儿童医院的支持。我们还衷心感谢以下机构对S.N.T.的资助：美国国立卫生研究院（K99/R00 HL1431149；R01HL157803；R01DK134590，R24OD034189）、美国心脏协会（18CDA34110049）、哈佛医学院Eleanor和Miles Shore研究员奖学金、Polsky家族基金会，以及麻省总医院外科部门和/或麻省总医院研究执行委员会授予的Claflin杰出学者奖。此外，我们感谢麻省总医院研究执行委员会向R.J.授予医学发现基金（FMD）奖项所提供的支持。最后，感谢来自 "破碎面容基金会" 感谢法国雷恩第一大学、雷恩大学、雷恩大学医疗中心及法国整形外科学会向 Y.B. 提供的支持。作者感谢 Knight Surgery Research Laboratory 在动物麻醉方面的贡献与协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿顿组织镊Jarit130-234
铝珠Lab Armor42370-002Lab Armor Beads 
盐酸布托啡诺Ranbaxy PharmaceuticalsNDC:12469-0757-01Buprenex Injectable
卡洛芬PfizerNADA 141-199Rymadyl 50mg/ml injectable 
圆柱形黄铜块手工制作N/A工程图纸包含在稿件中
皮肤标记笔McKesson无菌外科皮肤标记笔
一次性#15外科手术刀片MedlineMDS15315手术刀片
芬太尼透皮贴剂MylanNDC:60505-7082Fentanyl Transdermal System
异氟烷 PiramalNDC:66794-013-25异氟烷，符合美国药典标准
麦克弗森双极电凝镊BovieA842可重复使用，可高压灭菌
Miltex混合规格活检打孔器（3、4和5 mm）Integra33-38活检打孔器——根据研究需要选择尺寸
无纺纱布StarryshineGZNW222 x 2" 四层无纺医用纱布垫
聚维酮碘BetadineNDC:0034-9200-887.5%外科洗手液 
无菌等渗氯化钠溶液 0.9%Aqualite SystemRL-2095无菌生理盐水溶液
纹身墨水Spaulding & Rogers黑色 - 2盎司 - #9053
纹身标记笔Spaulding & Rogers特种电动纹身标记笔
纹身针Spaulding & Rogers1310251五点式纹身针
Tegaderm透明薄膜敷料3M1.628大型透明粘性敷料
温控加热板Cole-Parmer03407-11StableTemp加热搅拌板
温度计American ScientificU14295玻璃管汞温度计
盐酸替来他明和唑拉西泮ZoetisNDC:54771-9050Telazol
苯甲酸酊喷雾剂Smith&Nephew407000粘合层喷雾
三重抗生素软膏FougeraNDC 0168-0012-31三重抗生素软膏
管状网套MedlineNONNET02Curad Medline 无乳胶弹性网套
加热毯3MBair Hugger 750 warming unit
Xeroform闭合性纱布条Covidien8884433301Xeroform凡士林伤口敷料
赛拉嗪VetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
尤卡坦小型猪（雌性，30 kg）Sinclair Bio ResourcesN/A完全色素沉着à 

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