一种用于研究多种深度烧伤创面愈合过程的猪烧伤模型

摘要

本方案描述了一种在尤卡坦微型猪中可重复的多深度烧伤伤口模型。

摘要

烧伤创面愈合是一个复杂而漫长的过程。尽管已有丰富的临床经验，整形外科医生及烧伤中心的专业团队仍面临诸多挑战。其中，烧伤后早期软组织损伤范围可能持续演变，使得保守治疗与坏死组织清除之间的决策变得尤为微妙。热力烧伤是最常见的类型，其烧伤深度受温度、接触时间等多种因素影响。烧伤深度亦随时间动态变化，继发性加重的 "阴影区" 仍是一种 poorly understood phenomenon。针对这些挑战，已有若干创新疗法被研究，更多疗法尚处于早期开发阶段。现代伤口敷料和人工皮肤中的纳米颗粒即为目前仍在评估中的现代疗法示例。总体而言，烧伤诊断与烧伤治疗均需重大进展，研究团队亟需一种可靠且相关的模型以测试新工具和新疗法。在动物模型中，猪因其皮肤结构与人类高度相似而成为最相关的模型。更具体而言，尤卡坦小型猪（Yucatan minipigs）具有黑色素色素沉着和生长缓慢等有趣特征，可用于研究高光型皮肤及长期愈合过程。本文旨在描述一种可靠且可重复的实验方案，用于在尤卡坦小型猪中研究多深度烧伤创面，实现长期随访，并为诊断与治疗研究提供相关模型。

引言

烧伤是一个重大的公共卫生问题，根据国家烧伤登记库的数据，每年在美国影响超过48万名患者^1,2。这导致每年有超过5万名患者因非致命的复杂病例而住院，需要深入治疗²。此外，烧伤是军事人员死亡和伤病的根本原因之一，占军事伤亡人数的10%至30%^3,4。尽管烧伤对患者的影响广泛而多样，涵盖身体、心理和情绪等多个方面，但其治疗方式在很长一段时间内几乎未发生改变⁵。

烧伤损伤的初步诊断和评估需根据烧伤类型（一度、二度和三度）或受损组织的深度（表浅、部分皮层和深层烧伤）进行基础分类^6,7,8。部分皮层厚度烧伤（即一度和二度烧伤）累及表皮及真皮不同深度（浅层或深层真皮，即浅二度和深二度烧伤）⁹。特别是，深层真皮中附属器的损伤排除了来自附属器上皮再上皮化的可能性¹⁰。根据定义，全层厚度烧伤累及皮下脂肪、筋膜和/或深层肌肉（三度烧伤），有时甚至累及骨骼（亦称为四度烧伤）^11,12。

住院后，烧伤患者需要接受特殊护理，其治疗策略在于精细地平衡组织清创与组织保留之间的关系。需要逐步清除受损和/或继发感染的软组织，直至暴露出健康组织，从而可使用特定敷料和皮肤移植来促进愈合过程^13,14,15,16。然而，手术过程中必须谨慎操作，以避免意外切除正在愈合的组织，并减少并发症，实现最佳康复。从生物学角度看，烧伤区域表现为中央坏死区，周围环绕着一个“阴影区”或“淤滞区”，提示存在可逆性缺血的可能。该区域可能恶化，导致坏死范围扩大，也可能通过逆转凋亡过程而实现自我修复^17,18。烧伤严重程度的这种变异性给外科医生的准确评估带来挑战，也使保守治疗与手术切除之间的权衡更加复杂¹⁹。迄今为止，尚无有效的工具可用于表征烧伤恶化前的这一"阴影区"。开发此类工具对于优化这一精细平衡至关重要。

已有多种治疗方法被测试以帮助减少继发性烧伤恶化，但目前临床尚无特定疗法¹⁸。烧伤治疗领域的其他进展还包括现代伤口敷料和纳米材料的开发^20,21、组织工程皮肤^22,23以及新型表皮培养技术^24,25。此外，现代重建手术和筋膜皮瓣技术已改善了长期后遗症的管理，特别是关节屈曲部位病理性愈合后所导致的烧伤挛缩^26,27。这些进步为烧伤患者带来了令人鼓舞的前景，显著改善了治疗策略和生活质量，但近期研究结果表明，其功能影响在身体和心理层面仍然显著²⁸。综上所述，烧伤诊断与治疗领域对创新性进展的需求十分迫切。

总体而言，目前有许多方法致力于改善复杂烧伤病例的诊断、管理和治疗，研究人员需要一种可重复且相关的模型来测试这些新方法。由于烧伤涉及多个器官和全身性反应，具有较高的生物学复杂性，因此迄今尚无体外模型被证实适用于研究烧伤创面的病理过程²⁹。啮齿类动物模型因在生物学、皮肤结构、弹性以及与深层组织粘附性方面与人类存在显著差异，导致其与人类情况存在重大偏差²⁹。相比之下，猪模型因其皮肤结构与人类皮肤高度相似而被证实具有良好的相关性^30,31,32。猪皮肤具有类似的血管分布、弹性纤维组成以及表皮更新周期。此外，其毛囊和顶泌汗腺附属器支持岛状再上皮化，这与临床观察到的浅表烧伤愈合过程相似^33,34。特别是尤卡坦微型猪模型具有一些独特优势，使其成为研究色素性皮肤³⁵以及长期预后且体貌变化最小化的理想模型³⁶。

本文旨在描述一种在尤卡坦猪中建立的可靠的多度烧伤模型，可在同一受试动物身上研究多种二度和三度烧伤。该模型为烧伤诊断与治疗新技术的研究提供了相关且可重复的实验平台。此外，该模型具备不同类型的烧伤及其严重程度、可进行长期随访以研究烧伤挛缩及病理性愈合过程，并具有色素性皮肤的差异化反应特征，而后者已被证实具有特定的生物学特性。

方案

所有动物实验均按照 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）清单³⁷ 进行，并符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）第 #2021N000271 号方案的要求。动物福利遵循《实验动物护理与使用指南》³⁸。本实验共使用了五只30 kg的雌性尤卡坦小型猪，动物来源于商业供应商（见材料表）。

1. 术前护理与麻醉

1. 实验前禁食动物12小时 全身麻醉
2. 通过肌肉注射2-4 mg/kg盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮以及1-2 mg/kg赛拉嗪启动麻醉，随后吸入异氟烷（氧气中浓度2-3%）（参见 材料表用于在手术过程中维持麻醉。

2. 烧伤创面设计与随机分组

1. 为了在同一动物身上研究部分厚度烧伤和全层烧伤，并设置阴性对照（避免个体间差异），在每只猪背部旁正中区域制造八个伤口。其中三个为全层厚度伤口，三个为部分厚度伤口，两个为对照伤口。
2. 将伤口编号为1至8，并进行随机化分配，以将不同烧伤程度（部分厚度、全层厚度、对照）分配至背部不同的解剖位置。
   注意：对每个伤口（深度和位置）进行随机化是为了提高实验的显著性：已知猪的真皮层在厚度和胶原组成上存在差异³⁹。因此，在每只动物身上进行随机化可减少潜在的偏差。

3. 纹身伤口边界界定

注意：第一个步骤包括在猪的背部制作圆形纹身，以定位并编号随机分布的伤口（图1）。该步骤在首次烧伤操作前两天进行，以利于动物更好地适应环境，但也可在烧伤操作当天进行。

1. 麻醉后（见步骤1） ，在仰卧位进行经口插管⁴⁰，然后将猪转为俯卧位，并在动物身下放置软楔形垫（床单），以提高其舒适性和稳定性（置于前肢、脐部区域和后肢下方）⁴¹。在动物头部和颈部覆盖暖风毯，以维持适当的体温。
2. 在猪背部中央画一条直线，以便对称绘制标记。
3. 使用皮肤标记笔（见材料表）在中央线两侧各6.5 cm处画两条垂直线。这两条侧线将用于确定圆心位置。
4. 对称绘制四对直径为4.5 cm的圆，不同圆之间的最小间距应保持在4 cm以上（图1A）。
5. 完成绘图后，进行单步皮肤准备（使用7.5%聚维酮碘），以减少皮肤表面的细菌菌群。
6. 使用纹身针机、无菌黑色墨水和已灭菌的五点针头（见材料表），对八个直径4.5 cm的圆进行纹身操作⁴²。最终效果如图1B所示。
7. 若延迟进行烧伤造模操作，需在纹身处涂抹三种抗生素软膏，并用透明粘性敷料覆盖。

4. 烧伤创面制备与高级伤口敷料

注意：烧伤将通过将黄铜块置于指定位置（随机化）的皮肤上接触30秒（固定不变）来产生。温度将决定烧伤深度。

1. 在烧伤操作当天，动物麻醉后按步骤1所述置于俯卧位，将圆柱形黄铜块放入装有铝珠的不锈钢容器中（见 材料表）。将容器置于控温加热板上。将一个加热板设定为 65 °C（用于部分厚度烧伤），另一个设定为 93 °C（用于全层烧伤）。 图2).
   注意：容器可保持干燥状态以避免烫伤（需2-3小时达到温度平衡），或注入半满的水（30分钟达到温度平衡）。若使用水，黄铜块需在步骤4.5之前彻底干燥，以防止因热水残留导致后续烫伤。
2. 将温度计插入黄铜圆筒中 通过 通过其中心开口监测其核心温度，并使用测温枪确认表面温度。如有需要，尽管存在轻微的热量散失，仍可将加热板温度升高至65 °C或93 °C。
   注意：可使用铝箔覆盖容器，以进一步减少热量散失，更快达到目标温度。
3. 同时，将动物置于俯卧位，以进行烧灼操作，该体位与纹身操作（步骤3.1）相同。
4. 动物俯卧位准备就绪后，按以下三步进行皮肤准备（7.5%聚维酮碘、0.9%生理盐水、干燥）。
5. 使用耐热手套握住黄铜块，并根据随机分组将其放置于指定的纹身处。一旦黄铜块接触皮肤，立即启动计时器。注意不要对皮肤施加超过黄铜块自身重量的压力。
6. 30 秒后，将黄铜块从皮肤上移开，并放回其专用的加热容器中。监测温度直至达到目标值，然后对所有伤口重复此操作。
7. 进行多层高级敷料处理，以确保动物恢复后敷料的稳定性。
   1. 在每个烧伤部位（包括对照部位）放置一块浸有石油的纱布，然后覆盖无纺干纱布和大面积透明粘性敷料。
   2. 在周围皮肤上喷洒苯甲酸酊溶液，以增强透明敷料与皮肤的粘附性。
   3. 用自粘性绷带包裹动物时，注意不要包扎过紧（以免限制肺容积）。
   4. 通过添加一层管状弹力绷带（尺寸根据动物调整）完成包扎（参见 材料表). 或者，可使用定制的猪用背心 被使用 如果动物无法在整个研究期间保持敷料清洁
   5. 注射单剂布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，肌内注射）和单剂卡洛芬（2–4 mg/kg，肌内注射）后，在动物颈部贴敷透皮阿片类药物（芬太尼）贴剂，以确保适当的镇痛效果。
   6. 每次麻醉后，需在动物恢复后密切监测长达2小时。必要时使用加热垫，并在动物完全恢复直立姿势后自由提供食物。

5. 全层烧伤焦痂切开术

注意：动物在三度烧伤后 1 至 3 天内，将接受焦痂的全层手术切除。

1. 在对动物进行类似的准备（包括麻醉、插管并将动物置于仰卧位）后，通过三步皮肤准备法处理皮肤，并对动物背部进行无菌铺巾。
2. 使用4 mm打孔活检器（见材料表）对伤口进行活检，以确认损伤类型。
3. 使用无菌手术刀片（n°15）围绕焦痂做环形切口，直至达到真皮深层，完成焦痂切开术^43,44。
4. 用无菌Adson组织钳（带2/1齿）牢固夹住焦痂一侧（见材料表），向上提起以显露焦痂的深层边界。
5. 继续使用手术刀片沿同一平面在真皮深层/深部筋膜层进行焦痂切开。真皮层出血被视为组织存活的标志。
   1. 若操作过程中损伤小动脉，可使用双极电凝钳进行最小范围的电灼止血（见材料表）。注意：对创面床进行广泛电灼可能导致愈合延迟，应严格避免。
6. 在放置最终敷料前，先在创面床上覆盖一层干纱布，持续5分钟，以增强局部止血效果。
7. 按前述方法（步骤4.7）类似地包扎伤口，并额外添加数层干纱布填充创腔。依次应用之前所述各层材料：苯甲酸酊喷雾、粘性透明敷料、自粘绷带、管状网状绷带。
8. 通过更换阿片类透皮贴剂并注射卡洛芬（2–4 mg/kg，肌内注射）提供镇痛治疗。

6. 后续伤口敷料处理

注意：后续换药频率为每2至7天一次，具体取决于实验处理设计及动物的耐受情况。可在21天后停止换药，以在干燥环境中促进再上皮化，并提高动物的耐受性。或者，若处理组需要湿润或潮湿环境，可将换药时间延长至研究结束。随访期最长延长至10周，以便研究急性期和长期的愈合过程。

1. 短暂麻醉 动物，并将其置于仰卧位，使用鼻罩（异氟烷 2-5 L/min）。
2. 移除之前的敷料，并使用无菌 0.9% 氯化钠溶液和无菌纱布清洁伤口。
3. 如适用，施加实验性处理。
4. 若研究需要，可在本操作过程中进行后续活检。随后应给予动物镇痛药物，例如卡洛芬（2-4 mg/kg，肌内注射，作用持续 24 小时）。
5. 使用凡士林浸渍或同等材质的纱布、干燥的非织造纱布以及透明粘性敷料覆盖所有伤口部位，包括对照伤口。

结果

图2A、B展示了在尤卡坦微型猪背部进行多次烧伤后的结果。伤口（I）和（VII）为对照伤口（37 °C）。二度烧伤伤口（II、III和VIII）表现为明显红斑和水疱。相比之下，三度烧伤伤口（IV、V和VI）呈苍白外观，触诊时质地坚硬。值得注意的是，伤口VIII的表现介于二度与三度之间：为了正在进行的研究目的，我们将65 °C条件下的接触时间延长至45秒。图2C展示了术后第3天焦痂切开术后的伤口外观。对二度烧伤伤口进行了水疱切除术，对三度烧伤伤口则进行了坏死组织的整块切除，以形成可用于二期愈合的活性创面床。若真皮丛出血未自行停止，则进行最小范围的电凝止血。图2D–F分别展示了后续不同时间点（第2周、第3周和第7周）的伤口外观。

组织学结果如图所示 图3

讨论

烧伤后的伤口愈合是一个漫长的过程，可能持续数月之久，期间存在多种治疗选择并需考虑患者护理的诸多因素^2,13。为了研究这一过程，需要建立一种可靠且可重复的模型。已有多种动物模型被描述，主要包括啮齿类动物^29,45,46和猪^29,47。其中，猪的模型更具相关性，因其皮肤结构与人类皮肤相似^34,48。成年猪的体型允许在同一动物身上制造多个伤口，从而提高统计学显著性，并消除实验处理组与其对照组之间的个体间差异⁷。我们建议根据体重而非年龄来选择实验对象。当前模型可在不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿顿组织镊	Jarit	130-234
铝珠	Lab Armor	42370-002	Lab Armor Beads
盐酸布托啡诺	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC:12469-0757-01	Buprenex Injectable
卡洛芬	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50mg/ml injectable
圆柱形黄铜块	手工制作	N/A	工程图纸包含在稿件中
皮肤标记笔	McKesson	无菌外科皮肤标记笔
一次性#15外科手术刀片	Medline	MDS15315	手术刀片
芬太尼透皮贴剂	Mylan	NDC:60505-7082	Fentanyl Transdermal System
异氟烷	Piramal	NDC:66794-013-25	异氟烷，符合美国药典标准
麦克弗森双极电凝镊	Bovie	A842	可重复使用，可高压灭菌
Miltex混合规格活检打孔器（3、4和5 mm）	Integra	33-38	活检打孔器——根据研究需要选择尺寸
无纺纱布	Starryshine	GZNW22	2 x 2" 四层无纺医用纱布垫
聚维酮碘	Betadine	NDC:0034-9200-88	7.5%外科洗手液
无菌等渗氯化钠溶液 0.9%	Aqualite System	RL-2095	无菌生理盐水溶液
纹身墨水	Spaulding & Rogers	黑色 - 2盎司 - #9053
纹身标记笔	Spaulding & Rogers	特种电动纹身标记笔
纹身针	Spaulding & Rogers	1310251	五点式纹身针
Tegaderm透明薄膜敷料	3M	1.628	大型透明粘性敷料
温控加热板	Cole-Parmer	03407-11	StableTemp加热搅拌板
温度计	American Scientific	U14295	玻璃管汞温度计
盐酸替来他明和唑拉西泮	Zoetis	NDC:54771-9050	Telazol
苯甲酸酊喷雾剂	Smith&Nephew	407000	粘合层喷雾
三重抗生素软膏	Fougera	NDC 0168-0012-31	三重抗生素软膏
管状网套	Medline	NONNET02	Curad Medline 无乳胶弹性网套
加热毯	3M	Bair Hugger 750 warming unit
Xeroform闭合性纱布条	Covidien	8884433301	Xeroform凡士林伤口敷料
赛拉嗪	Vetone	NDC:13985-704-10	AnaSed LA
尤卡坦小型猪（雌性，30 kg）	Sinclair Bio Resources	N/A	完全色素沉着à