用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

摘要

活体显微镜的发现向临床转化面临的主要挑战是其对组织的穿透深度较浅。本文介绍了一种小鼠背部窗口腔模型，该模型可实现活体显微镜与临床适用的成像方式（如CT、MRI）的共同配准，从而进行直接的空间关联分析，有望加速活体显微镜发现成果的临床转化。

摘要

在癌症研究中，临床前活体成像技术（如显微成像和光学相干断层扫描）已被证明是可视化肿瘤微环境及其对治疗反应的有力工具。这些成像方式具有微米级分辨率，但由于对组织的穿透深度较浅，在临床应用中受到限制。而CT、MRI和PET等更具临床适用性的成像技术虽然具有更深的组织穿透能力，但空间分辨率相对较低（毫米级）。

为了将临床前活体成像的研究成果转化为临床应用，必须开发新方法以弥合这种微观到宏观的分辨率差距。本文介绍了一种背侧皮肤褶窗腔肿瘤小鼠模型，该模型旨在同一动物体内实现临床前活体成像和临床适用的成像技术（如CT和MR）的结合，并介绍了连接这两种不同可视化方法的图像分析平台。重要的是，所描述的窗腔方法利用窗腔上的定位标记，实现了不同成像模态在三维空间中的共定位，从而获得直接的空间一致性。该模型可用于现有临床成像方法的验证，也可通过与“真实情况”高分辨率活体成像结果的直接关联，用于开发新的临床成像技术。

最后，利用临床前及临床适用的成像技术，可对肿瘤对多种治疗（如化疗、放疗、光动力治疗）的反应进行纵向监测。因此，本文所述的背侧皮肤褶窗腔小鼠肿瘤模型及成像平台可用于多种癌症研究，例如将临床前的活体显微成像发现转化为更具临床适用性的成像技术，如CT或MRI。

引言

肿瘤微血管是肿瘤微环境中的一个重要组成部分，可作为治疗的靶点，并决定治疗反应。在临床前研究中，通常使用原位或异位动物窗腔模型结合活体显微镜来研究微血管系统^1,2。与组织学研究相比，这种方法具有多项优势，因为成像在活体组织中进行，肿瘤可在数周甚至数月内被纵向监测^2,3。此类研究可利用活体显微镜的高分辨率成像能力，研究治疗药物向肿瘤的递送过程^4,5、治疗耐药的原因⁶，以及微血管对诸如抗血管生成治疗^7,8和放射治疗^2,9等疗法的反应。

活体显微镜在临床前癌症研究中显然发挥着重要作用；然而，在临床环境中如何测量肿瘤微环境的特征呢？微血管信息在临床上可用于评估血液供应和肿瘤细胞缺氧情况，这对于确定放射治疗中的治疗耐药性^10<....

方案

所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》进行。实验按照加拿大安大略省多伦多市大学健康网络机构动物护理与使用委员会批准的方案执行。

1. 肿瘤接种定位

注意： "标记点定位" 指在小鼠皮肤上做标记，以指示肿瘤细胞注射位置，从而优化DSFC的放置。该标记操作应在接种当天或接种前一天进行。本研究使用免疫缺陷型NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ（NRG）雌性小鼠。

1. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。将小鼠置于包裹有经高压灭菌手术垫的加热垫上，以维持体温。
2. 通过剃毛并涂抹医用脱毛膏，为小鼠接种肿瘤细胞做准备。使用湿润的无菌纸巾在30–60秒后彻底清除脱毛膏。涂抹兽用眼用润滑剂，以防角膜干燥。
3. 使用酒精棉片对皮肤进行消毒。
4. 轻轻拉直小鼠身体，并沿其脊柱提起皮肤。使用手术标记笔在小鼠一侧隆起皮肤的中央标记一个点。 该点应位于小鼠胸椎大致中心位置。
   注意：此位置即为肿瘤接种的预定部位。

2. 肿瘤接种

注意：本研究中使....

结果

采用散斑方差光学相干断层成像技术（svOCT）获取大视野（FOV）三维微血管图像（横向6 × 6 mm²，深度1 mm）。为获得这些图像，使用了先前描述的基于正交干涉仪的扫频光源OCT系统²³。OCT图像通过拼接两个横向相邻的3 × 6 mm²视野扫描图像获得。每个B扫描包含400个A扫描，并在每个位置重复扫描24次（间隔25 ms），以实现准确的散斑方差处理，具体方法见我们之前的工作²⁴。

为将MRI数据集与微血管svOCT数据集进行共配准，需执行多个步骤。第一步已在步骤5.12中完成，如图4所示。该步骤沿深度方向（图4中的z轴）实现两个数据集的共配准。为在横向维度（图4中的xy平面）上进行共配准，需利用标记物环以及一系列基于两点的仿射配准方法。首先，通过匹配标记物.......

讨论

在本研究中，我们建立了一种工作流程，可在同一动物体内同时进行活体显微成像和临床适用的影像学检查（CT、MRI 和 PET）。该方法旨在通过将活体显微成像与 MRI 等临床成像方式直接关联，实现临床前显微成像发现向临床应用的转化。尽管传统的背侧皮肤折叠室（DSFC）设计通常采用金属材料^2,3，但我们通过使用由生物相容性塑料树脂制成的3D打印观察窗室，使 DSFC 具备了磁共振兼容性。成像模态间的配准通过在临床成像中使用定位标记物实现，同时获取一幅宽场显微图像，以匹配 DSFC 上的定位标记物位置与宽场显微图像以及高分辨率活体显微成像微血管图像中可见的血管解剖标志。我们开发了一套用于多模态图像共配准的 MATLAB 代码，详见补充文件2。

DSFC 在临床前研究中并非新事物^2,3,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养材料
BxPC-3 人胰腺癌细胞	美国典型培养物保藏中心 (ATCC)	CRL-1687
Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV，10 mL	康宁	354234
康宁 Stripettor Ultra 移液控制器	康宁	07-202-350
不含钙、镁或酚红的杜尔贝科磷酸盐缓冲液，500 mL	Gibco	14190144
胎牛血清（加拿大），500 mL	Sigma-Aldrich	F1051-500ML
青霉素-链霉素 100倍浓缩液（液体，稳定型，经无菌过滤，细胞培养测试）	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
RPMI 1640 培养基（1×），液体；含 L-谷氨酰胺，500 mL	Gibco	11875093
TrypLE Express 酶，500 mL	Gibco	12605028
观察窗室材料
12 mm 玻璃盖玻片	哈佛仪器	CS-12R 编号 1.5
Connex 500 3D 打印机	Stratasys	N/A
生物相容性透明 MED610 树脂	Stratasys	RGD810
Loctite AA 3105 紫外光固化胶	Loctite	LCT1214249
窗式腔室后框架	Trimech Inc	N/A
窗式腔室定位标记	Trimech Inc	N/A
窗式腔室前框架	Trimech Inc	N/A
窗式腔体支撑夹	Trimech Inc	N/A
接种与手术材料
BD SafetyGlide 带永久性针头胰岛素注射器，0.5 mL，29 G × 1/2"	BD	CABD305932
聚维酮碘溶液	聚维酮碘	AP-B002C2R98U
Cidex OPA 14日溶液 3.8 L	ASP	JOH20394
一次性手术垫 23英寸 x 24英寸	Kendall	7134
眼部润滑剂	Optixcare	50-218-8442
脱毛膏	Nair	‎061700222611
哈尔斯特德止血钳	Almedic	7742-A12-150
加热垫	阳光	B086MCN59R
虹膜剪	Almedic	7601-A8-690
异氟烷	Sigma	792632
美达佳	Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc	NDC 0010-6015-03
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠	杰克逊实验室	7799
花生切割器 & Trimmer	Wahl	8655-200
SOFSILK 非吸收性外科缝线 #5-0，带 3/8 针" 锥形针头（17 mm）（石蜡涂层，编织黑色丝线，无菌）	Syneture	VS880
精密镊子	Almedic	7725-A10-634
磁共振成像
3D打印的窗式固定装置			定制3D打印，详见图3。
对流加热装置	3M Bair Hugger	70200791401
药物注射系统	哈佛仪器	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI 兼容注射泵
Gadovist 1.0	拜耳	2241089
呼吸监测系统	SAII	Model 1030	适用于小动物的磁共振兼容监测与门控系统
尾静脉导管（27 G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
光学成像
3D打印成像平台			定制3D打印，详见补充图3。
12 V 7 W 柔性聚酰亚胺加热板 薄型粘性 PI 加热膜 25 mm x 50 mm	BANRIA	B09X16XCVS	用于小鼠体温调节的加热元件
直流电源	BK Precision	1761	用于为加热元件供电。
Leica MZ FLIII	徕卡显微系统	15209
svOCT成像系统			自制成像系统。详细信息见参考文献23。
软件
MATLAB 软件	MathWorks	R2020A