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方法文章

用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

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DOI：

10.3791/66383

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2024年4月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Radiation Medicine Program, Princess Margaret Cancer Centre, 3Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 4Advanced Electronic and Photonics Research Center, National Research Council of Canada

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

活体显微镜的发现向临床转化面临的主要挑战是其对组织的穿透深度较浅。本文介绍了一种小鼠背部窗口腔模型，该模型可实现活体显微镜与临床适用的成像方式（如CT、MRI）的共同配准，从而进行直接的空间关联分析，有望加速活体显微镜发现成果的临床转化。

摘要

在癌症研究中，临床前活体成像技术（如显微成像和光学相干断层扫描）已被证明是可视化肿瘤微环境及其对治疗反应的有力工具。这些成像方式具有微米级分辨率，但由于对组织的穿透深度较浅，在临床应用中受到限制。而CT、MRI和PET等更具临床适用性的成像技术虽然具有更深的组织穿透能力，但空间分辨率相对较低（毫米级）。

为了将临床前活体成像的研究成果转化为临床应用，必须开发新方法以弥合这种微观到宏观的分辨率差距。本文介绍了一种背侧皮肤褶窗腔肿瘤小鼠模型，该模型旨在同一动物体内实现临床前活体成像和临床适用的成像技术（如CT和MR）的结合，并介绍了连接这两种不同可视化方法的图像分析平台。重要的是，所描述的窗腔方法利用窗腔上的定位标记，实现了不同成像模态在三维空间中的共定位，从而获得直接的空间一致性。该模型可用于现有临床成像方法的验证，也可通过与“真实情况”高分辨率活体成像结果的直接关联，用于开发新的临床成像技术。

最后，利用临床前及临床适用的成像技术，可对肿瘤对多种治疗（如化疗、放疗、光动力治疗）的反应进行纵向监测。因此，本文所述的背侧皮肤褶窗腔小鼠肿瘤模型及成像平台可用于多种癌症研究，例如将临床前的活体显微成像发现转化为更具临床适用性的成像技术，如CT或MRI。

引言

肿瘤微血管是肿瘤微环境中的一个重要组成部分，可作为治疗的靶点，并决定治疗反应。在临床前研究中，通常使用原位或异位动物窗腔模型结合活体显微镜来研究微血管系统1,2。与组织学研究相比，这种方法具有多项优势，因为成像在活体组织中进行，肿瘤可在数周甚至数月内被纵向监测2,3。此类研究可利用活体显微镜的高分辨率成像能力，研究治疗药物向肿瘤的递送过程4,5、治疗耐药的原因6，以及微血管对诸如抗血管生成治疗7,8和放射治疗2,9等疗法的反应。

活体显微镜在临床前癌症研究中显然发挥着重要作用；然而，在临床环境中如何测量肿瘤微环境的特征呢？微血管信息在临床上可用于评估血液供应和肿瘤细胞缺氧情况，这对于确定放射治疗中的治疗耐药性10，以及微血管向周围肿瘤细胞输送化疗药物的能力具有重要意义11。例如，在放射治疗中，关于肿瘤微血管结构和功能的空间信息可能有助于通过调整分割照射方案，或优先增加对无血管且可能缺氧区域的照射剂量，从而实现个体化治疗方案的优化12。

活体显微镜能够测量这些重要的微血管特征，因为它具有很高的分辨率（μm 级别）；然而，其在组织中的穿透深度仅限于几百微米至数毫米，最多只能达到这一范围，这使得临床应用面临挑战。事实上，活体显微镜在临床上已有一些新颖的应用13；但这些应用目前仍局限于通过柔性导管或内窥镜对皮肤14或各种体腔的黏膜/内皮衬层15,16等近表面组织进行检查。

更常见的是，微血管系统通过CT17或MRI18等成像方式来研究。这些临床成像技术能够对体内任意深度进行成像，但其空间分辨率较低（毫米量级）。因此，有必要弥合临床前活体显微镜与临床成像技术之间的分辨率差距，以将高分辨率、详细的微血管信息引入临床实践19。目前已开发出多种功能成像方法，以提升临床成像技术对微血管的成像能力，例如动态对比增强（DCE）MRI和CT20，以及体素内不相干运动（IVIM）MRI21。然而，这些方法均为基于模型的间接测量手段，因此必须通过适当的"金标准"微血管测量方法进行验证19,22。

我们开发了一种背侧皮肤褶窗室（DSFC）肿瘤小鼠模型，以填补临床前活体显微成像与临床适用的成像方式（如CT和MRI）之间的空白。DSFC通过玻璃窗口为高分辨率活体显微成像提供了对肿瘤的直接观察通路，同时由于其由磁共振兼容材料（塑料和玻璃）制成，也可用于MRI等临床适用的成像。此外，我们提供了一套MATLAB代码，可实现多模态三维共配准，从而在临床前活体显微成像与临床适用成像方式之间建立直接的空间关联。本文将详细介绍DSFC的设计与植入手术，以及活体显微成像与临床适用成像方式共配准的操作流程。

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方案

所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》进行。实验按照加拿大安大略省多伦多市大学健康网络机构动物护理与使用委员会批准的方案执行。

1. 肿瘤接种定位

注意： "标记点定位" 指在小鼠皮肤上做标记，以指示肿瘤细胞注射位置，从而优化DSFC的放置。该标记操作应在接种当天或接种前一天进行。本研究使用免疫缺陷型NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ（NRG）雌性小鼠。

  1. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。将小鼠置于包裹有经高压灭菌手术垫的加热垫上，以维持体温。
  2. 通过剃毛并涂抹医用脱毛膏，为小鼠接种肿瘤细胞做准备。使用湿润的无菌纸巾在30–60秒后彻底清除脱毛膏。涂抹兽用眼用润滑剂，以防角膜干燥。
  3. 使用酒精棉片对皮肤进行消毒。
  4. 轻轻拉直小鼠身体，并沿其脊柱提起皮肤。使用手术标记笔在小鼠一侧隆起皮肤的中央标记一个点。 该点应位于小鼠胸椎大致中心位置。
    注意：此位置即为肿瘤接种的预定部位。

2. 肿瘤接种

注意：本研究中使用的是人胰腺癌细胞系（BxPC3）。也可使用其他细胞系；但不同细胞系的特定细胞培养步骤可能有所差异。请参考随细胞提供的说明书，对以下实验步骤进行相应调整。

  1. 提前2周开始培养细胞，使用完全生长培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640培养基，含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素），在75 mL培养瓶中进行培养，置于 37 °C 和5% CO₂2确保细胞保持在指数生长期。
    注意：传代次数应限制在10–15代以内，接种时75 mL培养瓶应含有约600万细胞（约70%汇合度）。
  2. 吸弃培养基，用 5 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 加入5 mL细胞解离试剂，于37℃孵育5分钟 37 °C 和5% CO₂2 孵育6-7分钟。在显微镜下确认细胞已脱落，加入5 mL完全培养基。
    注意：轻轻敲击培养瓶的侧面有助于细胞脱落。
  4. 将悬液转移至15 mL离心管中，在500 ×g条件下离心 × g 离心5分钟以沉淀细胞。吸除培养基，将细胞重悬于5 mL完全培养基中。
  5. 使用血细胞计数板确定细胞浓度和总细胞数。
  6. 500离心 × g 离心5分钟以沉淀细胞，并吸除培养基。
  7. 根据步骤 2.5 获得的总细胞数，加入适量的完全培养基，使细胞浓度达到  figure-protocol-1  其中 n 需要接种的小鼠总数。重悬细胞。
    注意：每只小鼠接种的细胞目标数量为250,000。
  8. 转移含有250,000个细胞的1.5 mL溶液 细胞 × n 转移到1.5 mL微量离心管中。将1.5 mL微量离心管在500 ×g下离心 × g 5 分钟后吸出培养基。
    注意：任何多余的细胞悬液均可置于37℃水浴中保存 °C 必要时可用于额外接种。
  9. 将细胞重悬于 10 μL × n 加入 PBS，将细胞置于冰上以冷却悬液。
    注意：细胞在冰上冷却后，必须在20分钟内注射到小鼠体内。
  10. 加入10 μL × n 使用预冷的移液吸头吸取溶解的基底膜。用预冷的29号胰岛素注射针头吸取20 μL 每种细胞悬液。将注射器置于冰上。
  11. 使用5%异氟烷诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。
  12. 将小鼠置于包裹着无菌手术垫的加热垫上。
  13. 用酒精棉片对注射部位的皮肤进行消毒。
  14. 在标记点前约1 cm处进针，将针头沿皮下推进至标记位置。针头斜面朝上，注射 20 μL 细胞悬液
  15. 等待45秒，使溶解的基底膜充分凝固，然后移除注射器。
  16. 将小鼠移出麻醉状态，等待其恢复自主活动后，放回与其他小鼠相同的笼具中。
  17. 每天通过触诊监测肿瘤，让肿瘤生长4周或直至肿瘤直径达到4-8 mm。若小鼠出现以下任一情况，应实施安乐死：肿瘤大小超过1.5 cm、肿瘤溃烂、或出现全身性疾病的任何症状（如嗜睡、体重减轻超过正常体重的20%、活动能力受损、体温调节障碍、厌食、弓背姿势、明显的疼痛表现（如面部表情异常等）或脱水）。

3. 观察窗手术

注意：DSFC 由四个 3D 打印部件组成，如图 1所示。每个部件的示意图包含在补充文件 1中。所有部件均使用生物相容性透明塑料树脂打印而成。主窗口腔体组件由三个部分（图 1A-C）组成，另有一个可附加的基准标记环（图 1D），可在 MRI 或 CT 成像期间固定使用。

figure-protocol-2
图 1：背侧皮肤褶窗室示意图。 主窗室包含三个部分。首先，（A）前框架缝合于小鼠皮肤下方，并固定有通过紫外光固化胶粘附的玻璃盖玻片。（B）后框架缝合在皮肤外侧的前框架上。（C）支撑夹固定于后框架底部，用于保持背侧皮肤褶窗室（DSFC）在小鼠体表的直立状态。（D）定位标记环包含七个“孔”，可用于插入定位标记物。定位标记环可通过三个支撑柱固定于DSFC的前框架上。（E）显示完整的DSFC组件及其定位标记环。比例尺 = 1 cm（A–D，左下角；E）。缩写：DSFC = 背侧皮肤褶窗室。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 术前1-3小时，皮下注射0.6 mg/mL缓释布托啡诺，剂量为1 mg/kg。 确保小鼠具有足够的体型和体重，能够耐受DSFC手术而不发生胸腔受压。
  2. 灭菌主窗口腔室部件（图1A- C在高效液态消毒剂中浸泡12分钟，随后在异丙醇中浸泡至少5分钟。
  3. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。
  4. 将小鼠转移至底部带有加热垫的无菌手术垫上。
  5. 剃除小鼠体毛，若有残留毛发，可涂抹医用脱毛膏。30-60秒后，使用无菌湿纸巾擦去脱毛膏。
  6. 涂抹兽用眼用润滑剂以防止干燥。手术过程中每30分钟或根据需要重新涂抹。
  7. 用7.5%聚维酮碘擦洗皮肤，再用70%异丙醇冲洗，然后让皮肤自然风干。
  8. 将10%聚维酮碘溶液涂抹于皮肤，并使其自然风干（图2A).
  9. 更换为新的无菌手术垫。
  10. 通过脚趾夹捏法确认小鼠已达到手术麻醉深度。
  11. 沿脊柱方向提起小鼠皮肤，观察两侧侧皮褶上是否有肿瘤生长。将DSFC的背部支架放置图2B在肿瘤生长的同一侧皮肤上进行操作，确保将肿瘤置于视野中央。
  12. 在DSFC和手术导板的最上面三个孔中各添加一根缝线，以固定后框架的位置图2B).
  13. 将三根针穿过DSFC背板上带有垫片的孔图2B).
    注意：DSFC 后框架上有三个“垫片”，用于在前后框架之间保持一定间隙，以确保流入 DSFC 内部组织的血流不受限制。这些垫片在 图1B.
  14. 使用外科标记笔，在皮肤两侧标记出背架间隔物（DSFC）将要放置的六个位置（点1-6） 图 2C，D).
    注意：插入的针头应作为这些点位精确定位的参考。
  15. 在背框相对的一侧画一个直径1 cm的圆，以标示将要切除的皮肤区域图2D).
  16. 通过剪断缝线，将针头和背框从皮肤上移除。
  17. 在步骤3.15中标记的皮肤处切割出一个直径为1 cm的孔 使用外科显微剪刀（图2E).
  18. 将临时缝线穿过第4点，经由DSFC前框架的顶部孔洞，再穿过小鼠对侧的第1点，以固定窗式观察室的所有部分与皮肤图 2F 以及第1-2步 补充图 S1).
  19. 将缝合线穿过背框顶部支撑柱，然后从靠近小鼠头部一侧的背框支撑柱穿回图 2F).
  20. 将缝线穿过第2点，然后将缝线穿入前框架上对应的孔中图 2G 第3步 补充图 S1).
  21. 从皮肤内侧将缝线按图示穿入第6点 图 2H 第3-4步 补充图 S1.
  22. 按照图示将缝线穿过第5点 图 2I 第4步 补充图 S1.
  23. 将缝线从前框架的第3点穿出，然后按图示穿过后框架 图2J 第5步 补充图 S1.
  24. 将缝线从第1点、DSFC的前框架穿回，然后按图示从第4点穿出 图2K 第6步 补充图 S1.
  25. 用此缝线收紧整个组件，并将前框架通过第3.17步所创建的孔道从皮下穿出图 2L，M).
  26. 将缝线的两端打结，并剪去多余的线头。
  27. 通过DSFC前框和后框周边的孔进行永久性缝合。按照图示模式将两个框架缝合在一起 图2N 和 补充图 S2.
  28. 剪断并移除临时缝线。
  29. 将支撑夹通过后框架的凸起部分滑入，固定到DSFC的后框架上图 2O).
    注意：图中显示了小鼠术后2周的情况 图2P，Q支撑夹用于将DSFC垂直固定在小鼠身上，以减少皮肤张力和不适。
  30. 皮下注射5 mg/kg体重的美洛昔康（Meloxicam），一种非甾体抗炎药，用于减轻疼痛和炎症。
  31. 将小鼠移出麻醉状态，待其恢复自主行走后，放回笼中。
  32. 术后2-3小时检查小鼠，之后至少连续每日观察1周。以窗式植入手术后2个月或达到步骤2.17中任一条件（以先发生者为准）作为实验终点。

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图 2：DSFC 手术操作流程。（A）通过去除毛发并消毒皮肤，使小鼠进入手术准备状态。皮下肿瘤由箭头指示。（B）将背部支架放置于适当位置，并通过三支注射器以及固定在黑色手术导板上的临时缝线加以固定。（C,D）在皮肤两侧标记垫片位置（点 1–6）及孔位。（E）切除皮肤。（F–K）将临时缝线穿过皮肤的两层结构以及 DSFC 的前、后支架，以将所有部件固定在一起。（L,M）拉紧临时缝线，并将前支架插入皮肤下方。（N）使用八根永久缝线 固定 DSFC。（O）最后，移除临时缝线，并安装支撑夹。（P,Q）术后 2 周，从小鼠两侧观察的同一动物图像。缩写：DSFC = 背部皮肤皱襞观察窗装置。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 光学成像

  1. 手术后至少等待5天，使小鼠充分恢复并减轻炎症，然后再进行成像。
  2. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。
  3. 涂抹兽用眼用润滑剂以防止角膜干燥。每30分钟或根据需要重新涂抹一次。
  4. 将小鼠固定在配备气体麻醉装置的成像平台上，如补充图S3所示。
  5. 获取一个宽视野（>1.5 cm 宽度）的明场显微图像。确保DSFC前框架上的定位标记凹槽清晰可见。
    注：前框架玻璃边缘周围有七个凹槽，与定位标记环附件上的七个定位标记孔位置对应。这些凹槽在图1A中可见。
  6. 在同一天，使用选定的活体显微成像模式获取微血管图像。使用步骤4.4中的同一成像平台（补充图S3）。成像结束后将小鼠撤离麻醉，待其恢复自主活动后放回饲养笼。
    注：我们采用散斑方差光学相干断层扫描（svOCT）获取高分辨率三维微血管图像。

5. 磁共振成像

  1. 将小鼠笼置于加热灯下，麻醉前使小鼠保温约15分钟。
    注意：升温可促进血管扩张，有助于尾静脉导管置入。
  2. 使用5%异氟烷诱导麻醉，2%异氟烷维持麻醉（氧气流速设定为0.5 L/min）。
  3. 使用电子天平记录小鼠体重，以确保药物剂量准确。
    注意：为获得准确的体重测量值，需减去DSFC组件的重量（0.83 g）。
  4. 将小鼠放置于MRI床，并涂抹兽用眼用润滑剂以防止角膜干燥。
  5. 使用水加热器和泵系统维持小鼠的体温。
  6. 将呼吸监测垫置于小鼠膈肌下方，并保持在30 ± 5 次呼吸/分钟
  7. 若使用对比剂，将连接有微细导管的27 G蝶形针插入尾静脉（30 μL 用1%肝素生理盐水预填充死腔体积）。使用手术胶带将针头和微管固定在MRI床面上。
  8. 将窗式观察室固定在3D打印的“固定装置”中，如图所示 图3.
  9. 使用18 G针头，将兽用眼用润滑剂注入MRI定位标记物的七个管中。
  10. 将标记物通过三个方形连接器与前框架上伸出的三个柱状凸起对齐，固定到DSFC上图3).
  11. 将尾静脉导管连接至自动泵的给药管线和注射器。将床推入7特斯拉临床前磁共振成像仪中。
  12. 获取冠状面和轴向T2加权（T2w）图像以显示窗室平面（回波时间 TE = 25 ms重复时间 TR = 2,500 ms；40 × 40 mm 视野 与一个 64 × 64 矩阵 用于 0.5 mm × 0.5 mm 面内分辨率；0.5 mm 层厚；25 秒）。开具矢状位T2加权序列（TE = 25 ms；TR = 2,500 ms；32 × 32 mm 视野 与 128 × 128 矩阵 用于 0.25 × 0.25 mm 平面内分辨率；至少 11个成像切片；0.5 mm切片厚度；87秒），然后根据冠状面和轴向视图，将其旋转至DSFC和定位标记所在的平面，如图所示 图4逐步反复调整矢状面图像集的方向和位置，直至成像层面完全对齐，使第5层面完全包含背侧扣带回前部（DSFC）的组织信号，而第6层面 在DSFC中无组织信号。
  13. 使用选定的微血管 MRI 方法进行微血管成像。
    注意：对于微血管MR成像，无需采集标记物层面图像，因为这些图像是在与T2加权配准图像相同的成像参考框架中获取的。
    1. 获取步骤 5.12 和 5.13 中详述的全部采集数据 32 x 32 mm 视野范围 与一个 64 × 64 矩阵 用于 0.5 x 0.5 mm 平面内分辨率对于所有 MRI 采集，使用一致的射频脉冲以提高层面间的几何一致性（sinc 激发；sinc3 重聚焦；2,484 Hz 带宽).
  14. 用于DCE成像：
    1. 若需测量钆浓度，可使用在不同重复时间下获取的2D-RARE图像进行T1 mappingTE = 7 ms；RARE 因子 = 2；TR = 350、500、750、1,000、1,500、2,500 和 4,000 毫秒；8 分 28 秒).
    2. 使用二维RARE图像进行时间序列成像（TE = 8.1 ms；RARE 因子 = 2；TR = 200 ms；翻转角 = 90°；时间分辨率为 12.8 s；重复 188 次；总监测时间为 40 分 6 秒).
    3. 在完成五次图像重复后，通过自动磁共振兼容注射泵经尾静脉在10秒内注入0.75 mmol/kg体重的Gadobutrol。
  15. 对于IVIM MRI：
    1. 进行弥散加权成像，参数如下 b值：0、20、40、60、80、100、150、200、400、600、800、1,000 s/mm²2 与 三次平均值 的 B = 0 s/mm2 和 各向同性采样 (TE = 16 ms；TR = 800 ms；梯度持续时间 = 2.2 ms；梯度间隔 = 9 ms；61 分钟).
      注意：扩散加权成像采用二维傅里叶变换读出方式，而非易产生畸变的回波平面成像，以确保在图像序列之间以及与活体显微成像图像之间，肿瘤及周围组织信号在扩散源功能成像（DSFC）中的几何一致性。
  16. 将小鼠移出麻醉状态，等待其恢复自主活动后，放回笼中。

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图3：DSFC磁共振成像设置。（A）小鼠侧视图和（B）俯视图，小鼠置于MRI床面上，DSFC已固定并保持稳定。小鼠尾静脉置有导管用于注射对比剂，定位标记环固定在DSFC的前框架上。缩写：DSFC = 背部皮肤窗室；MR = 磁共振成像。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：相对于定位标记和窗式观察室的MRI切片位置。（A）带有定位标记环的背侧皮肤皱襞窗式观察室（DSFC）示意图，叠加显示11个MRI切片。必须采集多个T2加权图像，以确保切片与DSFC及组织正确对齐。（B,C）从不同方向观察，11个切片相对于DSFC内组织的正确位置。（D）第5层切片为最表浅的切片，将在此进行多模态相关性分析。（E）第6层切片无组织信号，表明其与DSFC对齐良好。（F）最后，第9层切片中可清晰看到7个定位标记。比例尺 = 5 mm。坐标轴上的“X”表示该轴指向页面内部，圆圈表示该轴从页面中指出。缩写：DSFC = 背侧皮肤皱襞窗式观察室；MRI = 磁共振成像。请点击此处查看该图的放大版本。

6. MRI 与活体显微镜共定位

  1. 在 MATLAB 中，打开包含在 Multimodal_Image_Register.m 文件中的 补充文件 2.
  2. 将微血管图像加载到工作区图5A），明场显微镜图像（图5B，以及微血管 MRI 数据（IVIM 和/或 DCE MRI 参数图）。
  3. 点击 运行 按钮
  4. 使用弹出式文件查找器，导航至包含T2w MRI切片的文件。
  5. 选择最多四个能清晰显示标记物的T2加权MRI切片（图5C).
  6. 显示显微镜图像的用户界面（图5B) 以及深度平均的T2加权MRI切片（图5C) 将会显示。在 MRI 图像上的每个七个基准标记处放置一个点，并将其与显微镜图像上对应的点（DSFC 前框玻璃边缘周围的基准标记凹点）进行匹配，如绿色点所示 图5B, C.
  7. 关闭窗口。
  8. 一幅包含叠加的 MRI 与显微镜图像的图示将显示出来，以帮助评估两组数据之间配准的质量。如果配准效果满意，请通过键入以下代码继续 y，然后按压 输入 在命令窗口中。否则，请通过输入重新尝试此步骤 n 在命令窗口中输入并按下 进入.
    注意：MRI 数据集与显微图像成功共配准的标志是，MRI 数据集中的七个明亮的标记点均位于 DSFC 前框架上对应凹槽的中心位置，且完全包含在凹槽内。
  9. 显示显微镜图像的用户界面（图5B）以及svOCT微血管成像数据集（图 5A将显示）。在svOCT微血管图像和显微图像中选择至少三个微血管解剖标志点，如蓝色点所示 图 5A，B.
  10. 关闭窗口。
  11. 一幅包含叠加的svOCT与显微镜图像的图示将显示出来，以帮助评估两组数据之间共配准的质量。如果配准效果满意，请继续输入代码 y，然后按压 进入 在命令窗口中。否则，请通过输入重新尝试此步骤 n 在命令窗口中输入并按下 进入.
    注意：svOCT 数据集与显微图像成功共配准意味着两个数据集中的血管完全重叠。
  12. 关闭窗口。
  13. 共聚焦显微图像将随即显示。在此图像中勾画肿瘤轮廓。
  14. 关闭窗口。
  15. 随后将显示多个图像：svOCT微血管数据集（图 5D），共定位显微图像（图5E）以及共同配准的 MRI 参数图（图5F）保存地图以供后续分析。
    注意：显示的 MRI 图像仅限于用户绘制的肿瘤轮廓范围内图5F).

figure-protocol-6
图5：基于多模态点的配准。 （A）以颜色深度编码的小血管svOCT数据集；比例尺 = 1 mm。（B）窗式培养室的明场显微图像；比例尺 = 2 mm。（C）第8–11层T2加权MRI切片的平均图像，显示位于标记环内的七个基准标记；比例尺 = 5 mm。（C）首先，通过用户在两组图像中输入的绿色标记，将“移动”的T2加权MRI数据集与“固定”的明场显微图像进行配准。接着，利用图A和B中的蓝色标记，将“移动”的明场显微图像和已配准的MRI图像与“固定的svOCT数据集”进行进一步配准。最终的配准数据集包括（D）svOCT图像、（E）明场显微图像以及（F）功能MRI参数图。（F）中的黑色体素位于肿瘤外部，因此在分析中不予考虑。对于D–F，比例尺 = 1 mm。缩写：svOCT = 斑点方差光学相干断层扫描；MRI = 磁共振成像。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

采用散斑方差光学相干断层成像技术（svOCT）获取大视野（FOV）三维微血管图像（横向6 × 6 mm2，深度1 mm）。为获得这些图像，使用了先前描述的基于正交干涉仪的扫频光源OCT系统23。OCT图像通过拼接两个横向相邻的3 × 6 mm2视野扫描图像获得。每个B扫描包含400个A扫描，并在每个位置重复扫描24次（间隔25 ms），以实现准确的散斑方差处理，具体方法见我们之前的工作24。

为将MRI数据集与微血管svOCT数据集进行共配准，需执行多个步骤。第一步已在步骤5.12中完成，如图4所示。该步骤沿深度方向（图4中的z轴）实现两个数据集的共配准。为在横向维度（图4中的xy平面）上进行共配准，需利用标记物环以及一系列基于两点的仿射配准方法。首先，通过匹配标记物...

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讨论

在本研究中，我们建立了一种工作流程，可在同一动物体内同时进行活体显微成像和临床适用的影像学检查（CT、MRI 和 PET）。该方法旨在通过将活体显微成像与 MRI 等临床成像方式直接关联，实现临床前显微成像发现向临床应用的转化。尽管传统的背侧皮肤折叠室（DSFC）设计通常采用金属材料2,3，但我们通过使用由生物相容性塑料树脂制成的3D打印观察窗室，使 DSFC 具备了磁共振兼容性。成像模态间的配准通过在临床成像中使用定位标记物实现，同时获取一幅宽场显微图像，以匹配 DSFC 上的定位标记物位置与宽场显微图像以及高分辨率活体显微成像微血管图像中可见的血管解剖标志。我们开发了一套用于多模态图像共配准的 MATLAB 代码，详见补充文件2。

DSFC 在临床前研究中并非新事物2,3,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Carla Calçada博士（博士后研究员，玛格丽特公主癌症中心）和Timothy Samuel博士（博士生，玛格丽特公主癌症中心）在肿瘤细胞培养及接种方案开发方面的帮助。Kathleen Ma博士、Anna Pietraszek博士和Alyssa Goldstein博士（动物研究中心，玛格丽特公主癌症中心）协助完成了手术方案的开发。Jacob Broske（医学工程技师，玛格丽特公主癌症中心）和Wayne Keller（硬件客户主管，Javelin Technologies – TriMech集团子公司）负责了观察窗室的3D打印。James Jonkman（大学健康网络高级光学显微镜设施）在明场和荧光显微镜图像采集方面提供了宝贵的指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养材料
BxPC-3 人胰腺癌细胞美国典型培养物保藏中心 (ATCC)CRL-1687
Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV，10 mL康宁354234
康宁 Stripettor Ultra 移液控制器康宁07-202-350
不含钙、镁或酚红的杜尔贝科磷酸盐缓冲液，500 mLGibco14190144
胎牛血清（加拿大），500 mLSigma-AldrichF1051-500ML
青霉素-链霉素 100倍浓缩液（液体，稳定型，经无菌过滤，细胞培养测试）Sigma-AldrichP4333-100ML
RPMI 1640 培养基（1×），液体；含 L-谷氨酰胺，500 mLGibco11875093
TrypLE Express 酶，500 mLGibco12605028
观察窗室材料
12 mm 玻璃盖玻片哈佛仪器  CS-12R 编号 1.5
Connex 500 3D 打印机StratasysN/A
生物相容性透明 MED610 树脂Stratasys RGD810
Loctite AA 3105 紫外光固化胶LoctiteLCT1214249
窗式腔室后框架Trimech IncN/A
窗式腔室定位标记Trimech IncN/A
窗式腔室前框架Trimech IncN/A
窗式腔体支撑夹Trimech IncN/A
接种与手术材料
BD SafetyGlide 带永久性针头胰岛素注射器，0.5 mL，29 G × 1/2"BDCABD305932
聚维酮碘溶液聚维酮碘AP-B002C2R98U
Cidex OPA 14日溶液 3.8 LASPJOH20394
一次性手术垫 23英寸 x 24英寸Kendall7134
眼部润滑剂  Optixcare50-218-8442
脱毛膏Nair‎061700222611
哈尔斯特德止血钳Almedic7742-A12-150
加热垫阳光 B086MCN59R
虹膜剪Almedic7601-A8-690
异氟烷Sigma792632
美达佳 Boehringer Ingelheim Animal Health USA IncNDC 0010-6015-03
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠杰克逊实验室7799
花生切割器 & TrimmerWahl8655-200
 SOFSILK 非吸收性外科缝线 #5-0，带 3/8 针" 锥形针头（17 mm）（石蜡涂层，编织黑色丝线，无菌）  Syneture  VS880
精密镊子Almedic7725-A10-634
磁共振成像
3D打印的窗式固定装置定制3D打印，详见图3。
对流加热装置3M Bair Hugger70200791401
药物注射系统哈佛仪器  PY2 70-2131PHD 22/2200 MRI 兼容注射泵
Gadovist 1.0拜耳2241089
呼吸监测系统SAIIModel 1030适用于小动物的磁共振兼容监测与门控系统
尾静脉导管（27 G 0.5" )Terumo Medical Corp15253
光学成像
3D打印成像平台定制3D打印，详见补充图3。
12 V 7 W 柔性聚酰亚胺加热板 薄型粘性 PI 加热膜 25 mm x 50 mmBANRIA B09X16XCVS用于小鼠体温调节的加热元件
直流电源BK Precision1761用于为加热元件供电。
Leica MZ FLIII徕卡显微系统15209
svOCT成像系统自制成像系统。详细信息见参考文献23。
软件
MATLAB 软件MathWorksR2020A

参考文献

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