用于慢性肺移植排斥小鼠模型中胶原沉积半定量组织病理学评估的苦味酸-天狼星红染色

摘要

苦味酸-天狼星红染色是一种半定量方法，可对小鼠肺纤维化重塑中的胶原沉积进行空间分辨的客观评估。除了评估总胶原沉积外，苦味酸-天狼星红染色还可用于区分不同厚度的胶原纤维。

摘要

肺纤维化是肺移植术后慢性排斥反应的病理生理学特征，也是影响受者长期存活的主要障碍。目前已有多种小鼠肺移植模型用于研究慢性排斥反应。然而，这些模型在移植物纤维化改变方面表现出结果异质性，且纤维化的组织学程度大多仅以定性方式报告。因此，采用一种具有空间分辨能力并可进行统计学分析的方法，有助于评估这些模型中的纤维化程度。本研究介绍了采用苦味酸-天狼星红（Picrosirius Red）染色对小鼠肺同种异体移植物中胶原蛋白排列进行半定量评估的方法，并将其与常规的苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin）、马松三色（Masson's Trichrome）和Herovici染色进行比较。染色实验基于主要和次要组织相容性复合体（MHC）错配的两种不同小鼠移植模型的组织切片进行。该方法已建立用于对整肺切片中的胶原蛋白排列进行半定量分析，因此可作为小鼠纤维化肺部疾病实验模型的研究工具。

引言

肺移植是终末期肺病患者的确定性治疗选择。然而，长期生存受到慢性排斥反应的限制，50%的受者在术后五年内会发生慢性排斥¹。小气道和肺实质的纤维化重塑是慢性肺移植物排斥导致肺功能进行性丧失的组织学特征²。在实验条件下，可通过主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的小鼠品系之间的原位肺移植建立慢性肺移植物排斥模型。已有多种品系组合被用于模拟慢性排斥表型³。其中，MHC次要不匹配的C57BL/10供体与C57BL/6受体的移植组合被广泛使用⁴。另一种方法是将BALB/c供体肺移植至接受每日免疫抑制治疗的C57BL/6受体小鼠体内⁵。这些模型在组织学上表现出不同程度的纤维化改变⁶。此类改变通常通过标准的苏木精-伊红染色和马松三色染色进行定性评估。

苏木精-伊红（H&E）标准组织学染色可提供样本的整体观，其中细胞核被染成蓝色，而细胞质和胶原纤维呈红色。采用马松三色（Masson's Trichrome）染色时，细胞核被染成黑色，胶原纤维呈绿色至蓝色，背景部分（包括细胞质、纤维蛋白和肌肉）则呈红色。由于马松三色染色可能导致结果低估，因此使用天狼星红（Picrosirius Red）染色被认为更具优势⁷。天狼星红是一种线性阴离子染料，可与带正电荷的长链胶原纤维结合，产生对比度高的红色染色。此外，在交叉偏振光下，天狼星红染色可增强胶原纤维的天然双折射特性⁸，从而便于评估胶原纤维的厚度和排列密度。使用偏振滤光片后，背景变为暗色，可清晰区分沉积胶原的厚度：较厚的胶原纤维呈红色，较细的胶原纤维在偏振光下呈绿色。文献中常描述双折射现象与胶原亚型之间的直接关联，其中红色双折射对应Ⅰ型胶原，绿色双折射对应Ⅲ型胶原⁹。

本方案描述了使用天狼星红染色法评估小鼠肺同种异体移植物中纤维化的方法。除了常规组织学染色外，该方法还可对慢性排斥反应的小鼠模型中的纤维化改变进行半定量评估，仅通过一次染色即可区分粗细不同的胶原纤维，具有成本低、操作简便的优点。该方法同样适用于其他以肺实质纤维化重塑为特征的小鼠实验模型。

方案

所有动物实验方案均符合人道动物研究的“3R”伦理原则，并已获得当地兽医伦理委员会（瑞士苏黎世州兽医局，研究编号45/2014）的批准。同样，读者在对实验动物进行任何操作前，也应获得相关机构的许可。

1. 样本获取

1. 根据个人需求及相应的伦理审批开展动物实验。所有手术均由一名显微外科医生完成，且不造成任何额外的长时间缺血。
   注意：为重现我们的代表性实验结果，请从 Charles River Laboratories 购买体重为 27–30 g 的无特定病原体级成年雄性 C57BL/6J、C57BL/10J 和 BALB/c 小鼠。进行同系移植时，供体与受体均使用 C57BL/6J 小鼠。在轻度错配模型中，将 C57BL/10J 供体肺移植至 C57BL/6J 受体。在重度错配模型中，将 BALB/c 供体肺移植至 C57BL/6J 受体，并于术后每日皮下注射环孢素（10 mg/kg/天）和甲基泼尼松龙（1.6 mg/kg/天）⁵使用生理盐水灌注，并在8周（56天）后取材肺组织。
2. 安乐死时，使用20G导管对动物进行插管，并用O₂进行通气₂ 补充2%-3%异氟烷。通过夹捏足垫无反应确认麻醉深度足够。
3. 通过手术剪切开腹壁，并沿胸骨全长切开，行正中胸腹联合切口以暴露心脏。根据解剖位置辨认下腔静脉和左心耳。
4. 用手术剪迅速剪断下腔静脉和左心耳，同时通过肺动脉根部用注射器灌注3-5 mL 0.9% NaCl，以清除肺循环中的全部血液。
   注意：安乐死应根据相应的伦理批准进行。其他方法也可同样应用。建议彻底清除肺循环中的血液，这也可以在循环停止后通过灌注完成。
5. 使用剪刀取出灌注过的肺组织。
6. 为保存样本，将样本置于4%甲醛溶液中孵育。将甲醛溶液直接注入支气管和肺血管系统。将样本完全浸入甲醛溶液中，孵育至少6 h。
   注意：为获得可比结果，肺组织用甲醛充盈时应采用标准化操作流程。此类操作流程的示例方案已发表于其他文献中。^10,11.
7. 根据实验需求修剪器官。将肺脏横向切成两半，以便在切片中包含支气管树的所有部分。
8. 将样本转移至自动组织处理机，依次进行酒精脱水、二甲苯透明及石蜡包埋，具体步骤如下：70% 乙醇、70% 乙醇、80% 乙醇、96% 乙醇、100% 乙醇（每步1小时）、100% 乙醇、100% 乙醇、二甲苯（每步2小时）、二甲苯（1小时），以及石蜡处理3次，每次2小时。
9. 熔化石蜡，并将样品以正确方向包埋于聚甲醛嵌入盒中。包埋时需确保样品的切面朝下。使用旋转式切片机进行切片。 5 µm 连续切片。将切片在室温下干燥24小时 37 °C 在进一步处理之前。

2. 石蜡切片的脱蜡和水化

1. 将样品在100%二甲苯中孵育2次，每次5分钟，以去除石蜡。
   注意：二甲苯易燃且对健康有害，仅可在通风橱中使用。
2. 将样品依次在100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中各浸泡2分钟进行水化，然后在蒸馏水中洗涤2分钟。

3. 使用天狼星红进行染色

1. 将切片在 Mayer 苏木精溶液中染色 8 分钟。用流动的自来水冲洗切片 10 分钟。
2. 将切片在 Picrosirius Red 溶液中孵育 1 小时。Picrosirius Red 溶液可使用预混染色液，或用 0.1% 的直接红 80 或 Sirius Red F 3B（CI 35780）溶于饱和苦味酸溶液中配制。
   警告：苦味酸易燃且具有高度爆炸性，应小心操作。
   备注：市面上有多种 Picrosirius Red 染色试剂盒供应商，详见材料表。请注意不同产品在价格和染色方法上的差异，并始终遵循供应商提供的说明。建议仅使用含有 Sirius Red F 3B（CI 35780）特定色指数的染色试剂盒。
3. 将切片在乙酸溶液（0.5%）中浸洗 5 至 10 次。轻轻摇动切片，以物理方式去除溶液。
4. 依次在 95% 乙醇、100% 乙醇、100% 乙醇、100% 二甲苯和 100% 二甲苯中各脱水 5 分钟。
5. 在每个样本上滴加一滴封片介质，并加盖盖玻片进行封片。将切片置于通风橱中干燥。

4. 数字化与图像处理

1. 使用适当的成像软件在光学显微镜下对样本进行聚焦，直至图像清晰锐利。添加偏振滤光片，并调节偏振程度，直到背景完全变暗或呈黑色。当背景尽可能黑暗时，即已达到正确的偏振状态。
   注意：也可使用常规透射光且不加偏振滤光片来观察Picrosirius Red染色。为此，建议使用与快绿（Fast Green）复染的猩红染料（Sirius Red），因其已被证明比单独使用Sirius Red更敏感^12,13。然而，必须使用偏振显微镜才能区分粗胶原纤维与细胶原纤维。
2. 以20倍放大倍数完整扫描所有样本，并导出为.tiff格式。导入Fiji软件¹⁴。务必提前彻底清洁载玻片，并在曝光时间及光源强度方面采用标准化设置。
3. 在软件中手动圈选样本区域，并通过编辑 > 清除外部将其裁剪出来。点击分析 > 测量，测定总表面积。
   注意：选择待测区室是获得可靠且可比结果的关键步骤。通过数字化并选择整个样本，可展示良好的横截面，并将异质性组织作为一个整体加以考虑。但也可仅限于样本内的特定区域，例如胸膜或单个支气管。需注意始终以标准化方式选择用于比较的区室。若样本间通气程度存在较大差异，建议从分析区室中排除气腔区域¹⁵。
4. 通过点击图像 > 调整 > 颜色阈值，使用颜色阈值法测量每个样本的总胶原含量，并通过点击分析 > 分析颗粒调整参数设置。设定大小 = 1 - 无穷大，勾选“清除”和“汇总”；亮度 = 35 - 255；色相 = 2 - 130。
   注意：合理设置颜色阈值对于获得可靠结果至关重要。
5. 通过调整色相分别测量粗胶原纤维和细胶原纤维：红色 粗胶原纤维（色相 2-30），黄绿色 细胶原纤维（色相 31-130）。结果将显示为染色像素的面积。
6. 通过点击插件 > 宏 > 记录配置宏，以实现自动化处理，并对所有样本重复此过程。
7. 为获得标准化至横截面表面积的最终数值，需将各参数的染色像素面积分别除以每个样本在步骤4.3和4.5中测得的总表面积。

结果

上述方案可对小鼠肺组织中的胶原沉积进行客观的半定量评估。纤维化重塑是肺移植后慢性排斥反应的病理生理学特征。因此，在采用左侧小鼠原位肺移植建立的慢性肺同种异体移植排斥模型中，应用了天狼星红染色法。在轻度免疫抑制条件下，主要MHC不相合的BALB/c供体向C57BL/6受体的肺移植会导致类似于人类慢性肺同种异体移植功能障碍的纤维化改变⁵。相比之下，次要MHC不相合的C57BL/10供体向C57BL/6受体的移植主要导致淋巴细胞性支气管炎⁶。图1详细展示了实验设计。

图2展示了两种模型移植左肺的代表性图像以及C57BL/6J同系移植对照的图像。Masson三色染色¹⁶、Herovici染色¹⁷和天狼星红染色¹⁸显示，在主要MHC不相容...

讨论

苏木精和伊红染色以及马松三色染色等标准组织学方法常用于以空间分辨的方式检测小鼠肺部的纤维化改变^16,19。然而，通常需要额外的方法来定量分析这些改变，并评估组织的胶原蛋白组成。

苦味酸-天狼星红染色法于1964年首次被描述，用于识别胶原蛋白：在透射光显微镜下，胶原呈红色，而肌肉和细胞质呈黄色¹⁸。在光路中插入偏振滤光片并利用双折射现象，可区分胶原纤维的厚度。自那时以来，纤维颜色与胶原纤维厚度之间的相关性已被反复证实，并常用于评估总胶原含量以及估计纤维化重塑过程中胶原亚型的分布^{9,20,21,22,23}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Honeywell, Charlotte, USA	33209
Axio Observer	Zeiss, Oberkochen, Germany	4633000956 (序列号)
盖玻片 1.5	Roth, Karlsruhe, Germany	KCY5.1
37% 甲醛	Fisher Scientific, Leicestershire, UK	F/1501/PB15
Meyer's 苏木精溶液	Merck, Darmstadt, Germany	109249
苦味酸-天狼星红溶液	Morphisto, Offenbach am Main, Germany	13422	可替代产品：ab150681, abcam, Cambridge, UK; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
偏振滤光片	Zeiss, Oberkochen, Germany	000000-1121-813
旋转式切片机，HistoCore AUTOCUT	Leica, Wetzlar, Germany	149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt 封片介质	Roth, Karlsruhe, Germany	6638.1
ROTI Plast 石蜡	Roth, Karlsruhe, Germany	6642.5
Rotilabo-包埋盒，POM	Roth, Karlsruhe, Germany	K113.1
Superfrost Plus 黏附载玻片	epredia, Portsmouth, UK	J1800AMNZ
组织处理仪	Leica, Wetzlar, Germany	TP 1020
软件
Fiji 软件版本 2.14.0/1.54f	开源
成像软件 ZEN 3.4.91	Zeiss, Oberkochen, Germany