我们描述了大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损的详细外科手术步骤，并研究了该模型的短期和长期预后。我们的目标是建立一个标准化的模型，用于开发骨缝再生疗法。
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本文内容
摘要
摘要
大范围颅骨缺损常伴随颅缝破坏，导致颅骨缺损修复受阻以及颅骨发育异常（后者发生于发育中的颅骨）。然而，由于缺乏标准化模型，阻碍了对颅缝再生疗法的研究，也给不同研究之间的比较分析带来挑战。为解决这一问题，本方案详细描述了在大鼠中建立颅骨颅缝-骨复合缺损模型的具体操作过程。
通过在冠状缝处钻取全层矩形孔（尺寸为 4.5 mm × 2 mm）建立模型。大鼠在术后第 0 天、第 2 周、第 6 周和第 12 周实施安乐死并采集颅骨样本。术后立即采集样本的 µCT 结果证实，成功建立了包含冠状缝及其邻近骨组织缺损的骨性复合缺损模型。
来自第6组的数据th 和 12th 术后数周显示出缺损自然愈合的趋势。组织学染色进一步证实了这一趋势，显示缺损中心矿化纤维和新骨组织增加。这些结果表明，颅骨缺损后随时间推移骨缝逐渐融合，凸显了针对骨缝再生进行治疗干预的重要性。我们预期该方案将促进骨缝再生疗法的开发，为颅骨缺损的功能性修复提供新的见解，并减少与骨缝丧失相关的不良后果。
引言
颅缝是颅骨之间致密的纤维连接，作为关节可促进颅骨轻微运动，并在压力下为大脑提供保护性缓冲1。近年来，越来越多的研究表明颅缝在颅骨发育、颅面稳态以及内在成骨修复潜能中发挥关键作用2,3,4,5,6,7,8。在生长发育阶段，颅缝作为颅骨的主要生长中心4。新骨形成发生在颅缝两侧的成骨前沿，而颅缝内的细胞则维持未分化的间充质状态，从而确保颅骨扩张与脑发育之间的平衡1。在此期间若丧失颅缝，将导致颅骨与脑生长之间的不匹配，引发脑损伤、脑积水、颅内压升高及认知功能障碍等严重问题3,9。
此外，颅缝在决定颅骨缺损预后方面起着至关重要的作用5....
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方案
本研究中所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2021-597）审查并批准。共使用12只Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，300 g，8周龄），每四个时间点各3只（见材料表），均购自商业来源。
1. 术前准备
- 手术物品
- 准备 图1A 所示的手术器械，包括弯头镊子、一次性无菌手术刀、骨膜剥离器、冲洗针头、棉球、低速手机、外科电机、牙科低速圆钻（图1B，直径分别为1.2 mm和0.8 mm）、持针器、3-0单丝缝线和直剪刀。
- 灭菌与消毒
- 提前通过蒸汽灭菌法（125–135 °C，20–25 min）对器械进行灭菌。
- 使用乙醇对热敏感的医疗设备（如电动剃毛器）进行消毒。
- 使用无菌医用无纺布覆盖操作台，并用75%乙醇对周围环境进行消毒。
- 麻醉
- 术前让动物适应环境1周。
- 术前20分钟，通过腹腔注射给予大鼠赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）以实施麻醉，或采用任何合适的麻醉方案实现全身....
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结果
在本研究中，通过在冠状缝处钻取一个4.5 mm × 2 mm的矩形孔，建立大鼠颅盖骨缝-骨复合缺损模型。手术示意图与研究流程图如图所示 图3术后0天样本（即手术后立即采集的样本）的三维图像和横截面视图证实，已成功构建全层颅骨缺损，包括冠状缝及两端邻近骨结构的完全去除。图 4A). µCT 术后6周的影像及相应统计分析结果显示，缺损区域自然趋向于闭合，并伴有在缺损内形成的不规则钙化结节图4）。这种趋势在术后12周更加明显（图4），表明随着时间推移可能存在骨缝融合。进一步采用H&E染色和Masson三色染色。术后两周，我们观察到骨膜和硬脑膜显著延伸并连续性良好，形成了致密且厚实的纤维组织，有效封闭了缺损区域。图5）。值得注意的是，在这一早期时间点已检测到蓝色染色的矿化纤维出现，其数量在术后6周时显著增加（
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讨论
传统的颅骨缺损模型，无论是否涉及颅缝，主要集中在硬组织修复上，常常忽视了颅缝间充质再生这一关键过程19,20。在颅缝再生研究中，以往的模型（如Mardas等人所建立的模型）15,16，采用环钻在大鼠矢状缝上制造5 mm的圆形缺损，导致大量骨组织丧失，从而偏离了颅缝再生的主要研究目标。类似地，Wilk等人提出的方法7，包括切除矢状缝和右侧冠状缝，并在右侧顶骨制造临界骨缺损，尽管具有一定的研究价值，但由于存在多个缺损部位，引入了复杂的因素和潜在的混杂变量。相比之下，我们的实验方案在冠状缝两侧建立双侧矩形缺损，旨在构建一种更为简洁且目标明确的研究模型。主要的颅缝包括冠状缝、矢状缝、额缝和人字缝21。与沿颅骨纵向排列的额缝和矢状缝不同，冠状缝和人字缝呈横向分布，可被分为左右两半，便于在对称条件下制造两个缺损。相较于人字.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金 82100982（F.L.）、82101000（H.W.）、82001019（B.Y.），四川省科技厅 2022NSFSC0598（B.Y.）、2023NSFSC1499（H.W.）以及四川大学华西口腔医学院/医院科研经费（RCDWJS2021-5）资助。图3使用Biorender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| 2% 碘伏溶液 | 成都金山化学试剂有限公司 | 无 | |
| 75% 乙醇 | 成都金山化学试剂有限公司 | 无 | |
| 棉球 | 海氏海诺集团有限公司 | 无 | |
| 棉签 | Lakong Medical Devices Co., | 无 | |
| 弯头镊子 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | |
| 用于残余缺损体积评估的 Dataviewer 和 Ctan 软件 | Bruker | 无 | |
| 牙科低速圆钻 | 德瑞博医疗设备有限公司 | RA3-012 RA1-008 | |
| 一次性无菌手术刀 | 杭州华为医疗器械有限公司 | 无 | |
| 一次性注射器（22 G） | 成都世锋科技有限公司 | SB1-089(IX) | |
| 电动剃须刀 | JASE | BM320210 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | BioFroxx | 1340GR500 | |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | Biosharp | BL700B | |
| 冲洗针头（23 G） | 四川新世纪医用高分子制品有限公司 | 无 | |
| 低速手机 | 广州牙卫士科技有限公司 | 无 | |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| 医用无纺布 | 河南亚都实业有限公司 | 无 | |
| 显微计算机断层扫描（µCT） | Scanco Medical AG | µCT45 | |
| 用于横截面图像处理的 Mimics 20.0 软件 | Materialise | 无 | |
| 持针器 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | |
| 骨膜剥离器 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | |
| 生理盐水溶液 | 四川科伦药业股份有限公司 | 无 | |
| 用于三维图像重建的 Scanco Medical 可视化软件 | Scanco Medical AG | 无 | |
| 用于统计分析的 SPSS Statistics 20.0 软件 | IBM | 无 | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | Byrness Weil Biotech Ltd | 无 | |
| 直剪刀 | 成都世锋科技有限公司 | 无 | |
| 外科电动马达 | MARATHON | N3-140232 | |
| 外科缝合线（3-0 单股） | 杭州华为医疗器械有限公司 | 无 |
参考文献
- Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
- Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., H....
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重印与许可
