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大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损模型的建立：骨缝再生治疗研究的标准化模型

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DOI：

10.3791/66417

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2024年5月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

本文内容

摘要

我们描述了大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损的详细外科手术步骤，并研究了该模型的短期和长期预后。我们的目标是建立一个标准化的模型，用于开发骨缝再生疗法。

摘要

大范围颅骨缺损常伴随颅缝破坏，导致颅骨缺损修复受阻以及颅骨发育异常（后者发生于发育中的颅骨）。然而，由于缺乏标准化模型，阻碍了对颅缝再生疗法的研究，也给不同研究之间的比较分析带来挑战。为解决这一问题，本方案详细描述了在大鼠中建立颅骨颅缝-骨复合缺损模型的具体操作过程。

通过在冠状缝处钻取全层矩形孔（尺寸为 4.5 mm × 2 mm）建立模型。大鼠在术后第 0 天、第 2 周、第 6 周和第 12 周实施安乐死并采集颅骨样本。术后立即采集样本的 µCT 结果证实，成功建立了包含冠状缝及其邻近骨组织缺损的骨性复合缺损模型。

来自第6组的数据th 和 12th 术后数周显示出缺损自然愈合的趋势。组织学染色进一步证实了这一趋势，显示缺损中心矿化纤维和新骨组织增加。这些结果表明，颅骨缺损后随时间推移骨缝逐渐融合，凸显了针对骨缝再生进行治疗干预的重要性。我们预期该方案将促进骨缝再生疗法的开发，为颅骨缺损的功能性修复提供新的见解，并减少与骨缝丧失相关的不良后果。

引言

颅缝是颅骨之间致密的纤维连接，作为关节可促进颅骨轻微运动，并在压力下为大脑提供保护性缓冲1。近年来，越来越多的研究表明颅缝在颅骨发育、颅面稳态以及内在成骨修复潜能中发挥关键作用2,3,4,5,6,7,8。在生长发育阶段，颅缝作为颅骨的主要生长中心4。新骨形成发生在颅缝两侧的成骨前沿，而颅缝内的细胞则维持未分化的间充质状态，从而确保颅骨扩张与脑发育之间的平衡1。在此期间若丧失颅缝，将导致颅骨与脑生长之间的不匹配，引发脑损伤、脑积水、颅内压升高及认知功能障碍等严重问题3,9。

此外，颅缝在决定颅骨缺损预后方面起着至关重要的作用5,7,10。颅骨表面的再生潜力分布不均，颅缝区域的再生能力显著优于非缝合区域10,11。一项研究表明，颅骨缺损愈合速度与颅缝到损伤部位之间的距离呈负相关10。具体而言，冠状缝和矢状缝的缺失会导致顶骨缺损无法愈合7，这凸显了颅骨缺损修复过程中颅缝再生的必要性。然而，目前的研究主要集中在颅骨骨性结构的重建，而忽视了缝间充质的再生。

在缝线再生领域的进展方面，含有缝线的骨瓣、间充质干细胞（MSCs）以及人工生物材料的移植已显示出良好的效果。当带有缝线的骨瓣被移植到颅骨缺损部位时，能够成功整合并愈合；相比之下，不含缝线的骨瓣则出现骨不连，且无法形成骨膜、硬脑膜或骨细胞5。同样，将来源于骨髓的MSCs植入矢状缝-骨复合缺损区域，可促进类缝线间隙的形成12。值得注意的是，最近一项研究证实，利用Gli1+ MSCs可实现缝线再生，从而实现颅内压调控、颅骨畸形矫正以及神经认知功能的改善13。随着再生医学与生物医学工程的发展，由于组织工程生物材料具有良好的可调性与可定制性，研究人员日益关注此类材料的应用14。特别是，聚四氟乙烯膜已被证明在同时重建颅骨及缝线间充质方面具有显著效果15,16。

然而，颅面研究领域缺乏用于探索骨缝间充质再生治疗的成熟模型，而其他组织（如骨、皮肤、软骨和肌肉）的修复研究已具备相对成熟的模型17。标准化模型的缺失限制了对骨缝再生治疗的研究，也使得不同研究之间的比较分析变得困难。因此，本研究建立了一种可行且可重复的大鼠颅骨骨缝-骨复合缺损模型。通过该方法，我们旨在为颅骨骨缝重建开发适当的临床干预手段，为颅骨缺损的功能性修复提供新视角，并减少因骨缝丧失所导致的不良后果。

方案

本研究中所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2021-597）审查并批准。共使用12只Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，300 g，8周龄），每四个时间点各3只（见材料表），均购自商业来源。

1. 术前准备

  1. 手术物品
    1. 准备 图1A 所示的手术器械，包括弯头镊子、一次性无菌手术刀、骨膜剥离器、冲洗针头、棉球、低速手机、外科电机、牙科低速圆钻（图1B，直径分别为1.2 mm和0.8 mm）、持针器、3-0单丝缝线和直剪刀。
  2. 灭菌与消毒
    1. 提前通过蒸汽灭菌法（125–135 °C，20–25 min）对器械进行灭菌。
    2. 使用乙醇对热敏感的医疗设备（如电动剃毛器）进行消毒。
    3. 使用无菌医用无纺布覆盖操作台，并用75%乙醇对周围环境进行消毒。
  3. 麻醉
    1. 术前让动物适应环境1周。
    2. 术前20分钟，通过腹腔注射给予大鼠赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）以实施麻醉，或采用任何合适的麻醉方案实现全身麻醉。
      注：大鼠腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪麻醉混合剂后，通常在10–15分钟内起效，注射后约35–40分钟达到麻醉峰值。为防止麻醉期间体温过低，应将大鼠置于加热垫上。
    3. 术前皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）以提供镇痛作用。
    4. 使用 "脚趾夹捏法" 判断大鼠是否具有意识和反应能力。

2. 手术过程

  1. 场地准备
    1. 将大鼠置于俯卧位，使其头部自然垂直伸展，无需使用特殊装置或约束具来维持此姿势（图2A).
    2. 在大鼠眼部涂抹兽医用软膏（如凡士林），以防止角膜干燥。
    3. 使用电动剃须刀去除鼻梁至颈椎关节之间头皮上的毛发图2B）。用2%碘伏溶液以创口为中心向外行环形消毒，随后用75%乙醇脱碘。使用手术巾覆盖动物背部及切口周围毛发区域。
  2. 手术部位切开
    1. 从鼻骨中点开始，沿颅骨正中线使用一次性手术刀做一长度为2 cm的纵向皮肤切口（图 2C).
    2. 沿皮肤切口的起始点和范围，做一中线骨膜切口 手术刀（图 2D）。然后，使用骨膜剥离器轻轻抬起切口两侧的骨膜（图 2E1）以暴露顶骨、额骨和冠状缝（图 2E2).
      注意：切开骨膜时，应小心避免损伤颅骨缝，以防切割时出血过多。充分暴露冠状缝对后续操作至关重要。
    3. 用生理盐水冲洗伤口，并用棉球擦干手术区域。
  3. 缝合-骨复合缺损模型建立
    1. 通过旋转旋钮将手术马达转速设定为 35,000 rpm（图1A，黄色箭头），然后打开开关（图1A，白色箭头）。
    2. 从冠状缝的任意一点开始，使用直径为1.2 mm的球形磨钻施加垂直力，直至感觉到突破感。
      注意：建议选择冠状缝的中点（如黄色箭头所示） 图 2E2) 作为钻孔起始点。钻孔时，牙科钻应始终保持与颅骨表面垂直。一旦穿透颅骨全层，应立即停止钻孔，以防对大鼠造成进一步伤害，包括脑组织损伤或脑出血。
    3. 从穿刺点开始，沿冠状缝横向移动钻头，形成一条长约4 mm的定位槽（图 2F1）。使用钻头在定位槽两侧去除骨组织，初步形成一个矩形的全层骨缺损（图 2F2).
    4. 使用直径为0.8 mm的圆形车针修整细节（图 2G1），包括研磨直角以及修整缺损边缘，最终形成一个宽2 mm、长4.5 mm的标准矩形缺损（图 2G2).
      注意：为了在300 g的SD大鼠中完全去除冠状缝，同时保留矢状缝和额缝，最大可行的缺损长度约为4.5 mm。考虑到冠状缝在前后方向上的宽度（补充图 S1），缺损宽度设定为2 mm。
    5. 在冠状缝的左右两半分别制造两个缺损，以进行自身对照比较。
    6. 钻孔过程中需持续灌注生理盐水，以防止颅骨和脑组织发生热损伤。同时，使用棉球干燥手术区域。
  4. 样本尺寸验证
    1. 使用游标卡尺定期测量缺损的长度和宽度图 2H1，H2以确保所有样本之间的一致性。
  5. 手术部位关闭
    1. 使用3-0单丝缝线缝合皮肤（图 2I).
  6. 术后即刻 体内 微型计算机断层扫描（µCT）
    1. 如果可行，进行 体内 对所有大鼠在术后立即进行µCT扫描，以确认手术成功，并监测每只大鼠缺损修复的恢复趋势。

3. 术后护理

  1. 根据动物护理规程，术后必要时给予标准镇痛药物，例如卡洛芬（carprofen，5 mg/kg， 皮下使用）。
  2. 将大鼠转移至恒温加热垫（37 °C）上进行术后恢复。
  3. 待大鼠完全清醒后，将其转移至含有清洁垫料的饲养笼中。
    注意：术后需持续监测大鼠状态，在其能够维持胸卧位之前不得无人看护。手术后的大鼠应与其他大鼠隔离，直至完全恢复。
  4. 术后24小时内进行镇痛管理和术后监测，之后在术后第一周内每日评估，此后每周至少监测1–2次。

4. 样本采集与数据分析

  1. 样本制备
    1. 在术后第0天、第2周、第6周和第12周收集颅骨标本。通过吸入CO2处死大鼠。
    2. 将样本置于4%多聚甲醛中，4 °C固定24小时，然后进行进一步分析。
  2. µCT评估
    1. 对术后第0天、第6周和第12周的颅骨进行µCT扫描，扫描参数如下：X射线管电压，70 kVp；X射线电流，0.2 mA；滤光片，AL 0.5 mm；积分时间，1 × 300 ms；体素尺寸，10 µm。
    2. 使用图像处理软件获得三维重建图像和横截面图像（参见材料表）。
    3. 测量残留缺损体积，并使用相应软件进行统计分析（参见材料表）。
  3. 组织学染色
    1. 将颅骨置于12%（w/v）乙二胺四乙酸溶液（pH = 7.2）中，4 °C脱钙6周。
      注：每3天更换一次脱钙液。可使用摇床以加快脱钙进程。当25 G针头可轻松穿透样本时，表明脱钙完成。
    2. 按照标准方案进行脱水、石蜡包埋，并制备6 µm厚切片18。
    3. 根据试剂盒说明书，采用苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色进行组织学分析18。

结果

在本研究中，通过在冠状缝处钻取一个4.5 mm × 2 mm的矩形孔，建立大鼠颅盖骨缝-骨复合缺损模型。手术示意图与研究流程图如图所示 图3术后0天样本（即手术后立即采集的样本）的三维图像和横截面视图证实，已成功构建全层颅骨缺损，包括冠状缝及两端邻近骨结构的完全去除。图 4A). µCT 术后6周的影像及相应统计分析结果显示，缺损区域自然趋向于闭合，并伴有在缺损内形成的不规则钙化结节图4）。这种趋势在术后12周更加明显（图4），表明随着时间推移可能存在骨缝融合。进一步采用H&E染色和Masson三色染色。术后两周，我们观察到骨膜和硬脑膜显著延伸并连续性良好，形成了致密且厚实的纤维组织，有效封闭了缺损区域。图5）。值得注意的是，在这一早期时间点已检测到蓝色染色的矿化纤维出现，其数量在术后6周时显著增加（图5术后12周时，缺损中心可见大块新生骨组织。图5），再次证实了间质钙化和骨缝闭合的不良预后。骨缝-骨复合缺损的自然愈合效果不佳，凸显了通过治疗干预（如生物材料植入）实现颅骨缝再生的必要性。13,15,16.

手术器械设置；显示工具和带有不同牙科钻头（1.2 mm，0.8 mm）的旋转钻。
图1：手术器械。（A）手术用品按使用顺序编号，包括（1）弯镊、（2）一次性无菌手术刀、（3）骨膜剥离器、（4）冲洗针头、（5）棉球、（6）低速手机、（7）外科电机（黄色箭头指示转速调节旋钮，白色箭头指示开关）、（8）牙科低速圆钻、（9）持针器、（10）3-0单丝缝线和（11）直剪刀。（B）直径为1.2 mm和0.8 mm的低速圆钻。请点击此处查看该图的放大版本。

啮齿类动物手术方法；颅骨开窗术；颅骨结构测量实验。
图 2：手术流程。（A）将大鼠置于俯卧位。（B）使用电动剃刀剃除头皮毛发。（C）使用一次性手术刀切开皮肤。（D）使用手术刀切开骨膜。（E1, E2）使用骨膜剥离器剥离骨膜，暴露冠状缝，黄色箭头指示冠状缝。（F1）钻出定位槽。（F2）使用1.2 mm球形磨头初步制备矩形缺损。（G1, G2）使用0.8 mm球形磨头修整缺损，获得标准的4.5 × 2 mm矩形形状。（H1, H2）使用游标卡尺校准缺损的宽度和长度。（I）使用3-0单股缝线缝合皮肤。本图示使用尸体标本，并故意未覆盖手术巾，以便更清晰地展示解剖结构。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠组织处理流程图；手术取样、µCT、脱钙、石蜡包埋、染色。
图3：颅盖骨缝-骨复合缺损及本研究策略的示意图。缩写：H&E = 苏木精和伊红；µCT = 微计算机断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

骨愈合过程；CT扫描图像及显示12周内残余缺损体积的柱状图
图4：颅骨缝-骨复合缺损的闭合趋势。(A) 术后第0天、第6周和第12周颅骨缝-骨复合缺损的代表性µCT图像及横截面视图。横截面显示了三维图像中黄色虚线所指示的位置。比例尺=2 mm。(B) 通过µCT评估术后残余缺损体积的定量分析。每组n = 6个重复。数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验。***p<0.001。缩写：PO = 术后；µCT = 微计算机断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学分析示意图，组织再生，术后第2、6、12周；显微镜结果。
图5：缝线-骨复合缺损的组织学变化。（A）术后第2周、第6周和第12周缝线-骨复合缺损的H&E染色和（B）Masson三色染色。红色虚线轮廓表示包裹缺损区域的纤维组织。黑色五角星代表蓝色染色的矿化纤维。黄色五角星突出显示在缺损中心形成的新骨。比例尺 = 500 µm；200 µm（插图）。缩写：PO = 术后；H&E = 苏木精-伊红。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：冠状缝在前后方向（矢状面颅骨图像）的宽度。 请点击此处下载该文件。

讨论

传统的颅骨缺损模型，无论是否涉及颅缝，主要集中在硬组织修复上，常常忽视了颅缝间充质再生这一关键过程19,20。在颅缝再生研究中，以往的模型（如Mardas等人所建立的模型）15,16，采用环钻在大鼠矢状缝上制造5 mm的圆形缺损，导致大量骨组织丧失，从而偏离了颅缝再生的主要研究目标。类似地，Wilk等人提出的方法7，包括切除矢状缝和右侧冠状缝，并在右侧顶骨制造临界骨缺损，尽管具有一定的研究价值，但由于存在多个缺损部位，引入了复杂的因素和潜在的混杂变量。相比之下，我们的实验方案在冠状缝两侧建立双侧矩形缺损，旨在构建一种更为简洁且目标明确的研究模型。主要的颅缝包括冠状缝、矢状缝、额缝和人字缝21。与沿颅骨纵向排列的额缝和矢状缝不同，冠状缝和人字缝呈横向分布，可被分为左右两半，便于在对称条件下制造两个缺损。相较于人字缝，通过头皮切口暴露的冠状缝手术视野更易于进行一系列操作。在冠状缝左右两侧分别制造缺损并施加不同干预措施，有助于通过自身对照更直观地比较不同治疗方法的效果。此外，该方法还可实现治疗侧与未治疗侧之间的比较，从而揭示干预后的愈合过程与自然愈合过程之间的差异。因此，本研究认为，在大鼠双侧冠状缝区域制造骨-缝复合缺损是一种适用于研究颅缝再生疗法的合适手术模型。

缺损尺寸的选择严格遵循实际操作和解剖学因素的指导。对于该特定动物模型，主要挑战在于完全去除冠状缝，同时保留矢状缝和额缝，并尽量减少骨组织的切除。因此，最佳策略是沿冠状缝创建一个精确的矩形缺损。这一策略至关重要，因为冠状缝或邻近缝中任何残留的间充质组织都可能影响对治疗真实再生效果评估的准确性。因此，我们确定了300 g雄性SD大鼠可行的最大缺损长度约为4.5 mm。此外，考虑到冠状缝在前后方向上的宽度（在矢状面上约为1.5 mm，如补充图S1所示），我们将缺损宽度设定为2 mm，以确保从颅骨表面到其深度完全去除缝线组织。需要注意的是，缺损的具体尺寸（包括长度和宽度）可能需要根据动物种类、年龄以及实验目标等因素进行调整。另一项研究中，在小鼠的冠状缝上创建了一个细长的矩形缺损，宽度仅为0.3–0.4 mm，以适应小鼠较小的体型13。

值得注意的是，构建该手术模型的难点在于制备标准且均一的矩形缺损。必须保持缺损形状的一致性，以确保各样本间生物活性因子剂量的均一性，从而最大限度地减少组间和组内变异。为此，在去除缝线-骨复合体的过程中，我们首先使用直径为1.2 mm的圆形钻头定位冠状缝，并初步形成贯穿全层的矩形缺损轮廓（图1B）。随后，更换为最小的圆形钻头（直径0.8 mm），以修整直角转角并平滑缺损边缘（图1B）。为确保每个缺损的长度和宽度一致，使用游标卡尺监测钻孔过程，避免过度或不足磨除。尽管采用了上述方法，µCT扫描结果显示，所制备的矩形缺损仍呈现一定程度的弧形（图4），提示仍需进一步优化建模方法，以获得更精确的磨除形状。

为了评估预后，µCT扫描提供了最直接的方法，包括对骨组织愈合情况以及颅缝状态（是否闭合或通畅）的评估。此外，组织病理学水平的研究对于颅缝再生的分析至关重要。组织病理学染色有助于区分缺损未闭合的原因，是由于间充质组织形成、骨修复受抑制，还是材料占位效应所致。只有能够促进间充质组织再生的方法，才可能具备颅缝再生的潜力。此外，尽管在模型构建过程中可能缺乏相关实验，但仍强烈建议在治疗干预后检测再生组织中颅缝间充质干细胞（MSC）标志物的蛋白水平表达。该分析可采用免疫荧光、免疫组化或流式细胞术等技术进行，有助于确认颅缝再生的成功。特异性的颅缝MSC标志物包括Cd51、Cd200、Gli1、Axin2、Prrx1、Ctsk等1,22。

总之，本研究报道了在大鼠中建立颅骨骨缝-骨复合缺损的详细建模过程，旨在研究跨骨缝颅骨缺损的预后情况，并开发促进颅骨骨缝再生的适当治疗策略。值得注意的是，颅骨骨缝再生领域确实较为小众，目前文献中尚无广泛认可的标准模型或方法用于颅骨骨缝的再生。因此，我们认为本研究的方案为探索骨缝再生方法提供了坚实的理论基础，并为颅骨缺损的功能性修复引入了创新视角，最终目标是提升患者的生活质量。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金 82100982（F.L.）、82101000（H.W.）、82001019（B.Y.），四川省科技厅 2022NSFSC0598（B.Y.）、2023NSFSC1499（H.W.）以及四川大学华西口腔医学院/医院科研经费（RCDWJS2021-5）资助。图3使用Biorender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛BiosharpBL539A
2% 碘伏溶液成都金山化学试剂有限公司无
75% 乙醇成都金山化学试剂有限公司无
棉球海氏海诺集团有限公司 无
棉签Lakong Medical Devices Co., 无
弯头镊子成都世锋科技有限公司无
用于残余缺损体积评估的 Dataviewer 和 Ctan 软件Bruker无
牙科低速圆钻德瑞博医疗设备有限公司RA3-012
RA1-008
一次性无菌手术刀杭州华为医疗器械有限公司无
一次性注射器（22 G）成都世锋科技有限公司SB1-089(IX)
电动剃须刀JASEBM320210
乙二胺四乙酸（EDTA）BioFroxx1340GR500
苏木精-伊红染色试剂盒BiosharpBL700B
冲洗针头（23 G）四川新世纪医用高分子制品有限公司无
低速手机广州牙卫士科技有限公司无
Masson’s 三色染色试剂盒SolarbioG1340
医用无纺布河南亚都实业有限公司 无
显微计算机断层扫描（µCT） Scanco Medical AGµCT45
用于横截面图像处理的 Mimics 20.0 软件Materialise无
持针器成都世锋科技有限公司无
骨膜剥离器成都世锋科技有限公司无
生理盐水溶液四川科伦药业股份有限公司无
用于三维图像重建的 Scanco Medical 可视化软件Scanco Medical AG无
用于统计分析的 SPSS Statistics 20.0 软件IBM无
Sprague-Dawley 大鼠 Byrness Weil Biotech Ltd无
直剪刀成都世锋科技有限公司无
外科电动马达MARATHONN3-140232
外科缝合线（3-0 单股）杭州华为医疗器械有限公司无

参考文献

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