使用志贺氏菌进行上皮细胞感染分析

摘要

本实验方案描述了用于探究的感染实验方法 志贺氏菌 黏附、侵袭和细胞内复制 体外 上皮细胞系

摘要

人类适应的肠道致病菌 志贺氏菌 每年导致数百万例感染，对儿科患者的长期生长发育造成影响，并且是全球腹泻相关死亡的主要原因之一。感染后，病原体穿过胃肠道并侵染结肠上皮细胞，从而引发水样或血性腹泻。由于抗生素耐药性急剧上升，且目前尚无获批疫苗，因此建立标准化的研究方案对于深入研究这一严重病原体至关重要。本文介绍了一系列用于研究其分子致病机制的方法。 志贺氏菌 使用 体外 结肠上皮细胞中细菌黏附、侵袭及胞内复制的分析。在进行感染分析之前，毒力表型的 志贺氏菌 菌落通过在琼脂平板上吸收刚果红染料来验证。在细菌培养过程中，也可考虑使用添加了补充成分的实验室培养基以模拟 体内 条件下，采用标准化实验流程，将细菌细胞以既定的感染复数接种于培养板中的结肠上皮细胞，以感染结肠上皮细胞，并根据需要进行调整，以分析感染的各个阶段。对于黏附实验， 志贺氏菌 细胞在低培养基水平下孵育，以促进细菌与上皮细胞的接触。在侵袭和胞内复制实验中，均采用庆大霉素处理不同时间，以清除胞外细菌，从而评估细菌侵袭情况和/或定量胞内复制速率。所有感染实验均通过梯度稀释感染后的上皮细胞裂解液，将细菌菌落形成单位在刚果红琼脂平板上进行计数，并相对于接种滴度进行归一化，以分别定量黏附、侵袭和/或胞内细菌数量。上述方法可实现对感染各阶段的独立表征与比较 志贺氏菌 感染上皮细胞以成功研究该病原体。

引言

由肠道致病菌引起的腹泻病是全球重大的公共卫生负担。2016年，腹泻病在全球造成130万人死亡，是五岁以下儿童死亡的第四大原因^1,2。革兰氏阴性肠道致病菌Shigella是志贺菌病的致病因子，而志贺菌病是全球腹泻相关死亡的主要原因之一³。每年，中低收入国家的儿童中因志贺菌病导致大量发病和死亡^4,5，而在高收入国家，感染通常与托儿所、食源性和水源性暴发有关^6,7,8,9。疫苗研发效果不佳¹⁰以及抗菌药物耐药性（AMR）日益加剧^11,12，使大规模Shigella疫情的防控更加复杂。美国疾病控制与预防中心近期数据显示，2020年美国近46%的Shigella感染病例表现出耐药性^13,14，而世界卫生组织已将Shigella列为需要紧急开发新疗法的抗菌药物耐药优先病原体¹⁵。

志贺氏菌 感染极易传播 通过 通过摄入被污染的食物或水，或通过直接的人际接触，经粪-口途径传播。 志贺氏菌 已进化为一种高效的人类适应性病原体，仅需10-100个细菌即可引发疾病¹⁶小肠转运过程中， 志贺氏菌 暴露于环境信号，例如升高的温度和胆汁¹⁷检测到这些信号会诱导转录变化，从而表达毒力因子，增强细菌感染人结肠的能力^17,18,19. 志贺氏菌 不会从肠上皮的顶膜表面侵入，而是被滤泡相关上皮内的特化抗原呈递微皱褶细胞（M细胞）摄取后，穿过上皮层进行转运^20,21,22经转胞吞作用后， 志贺氏菌 细胞被常驻巨噬细胞吞噬。 志贺氏菌 迅速逃逸吞噬体并触发巨噬细胞死亡，导致促炎性细胞因子的释放^5,23,24. 志贺氏菌 然后从基底侧侵入结肠上皮细胞，裂解巨胞饮泡，并在细胞质中建立复制微环境^5,25促炎性细胞因子，尤其是白细胞介素-8（IL-8），可招募多形核中性粒细胞（PMNs）至感染部位，从而削弱上皮紧密连接，促进细菌侵入上皮层，加剧基底外侧感染。⁵中性粒细胞通过破坏受感染的上皮层以控制感染，从而导致杆菌性（血性）痢疾的典型症状。⁵尽管入侵和细胞内复制机制已被深入表征，但新近研究正在揭示该领域一些重要的新概念 志贺氏菌 感染，包括胃肠道（GI）通过期间的毒力调控¹⁷，黏附¹⁹，通过屏障通透性改善基底外侧通路²⁶以及营养不良儿童中的无症状携带²⁷.

其能力 志贺氏菌 引起腹泻性疾病的 spp. 仅限于人类和非人灵长类动物（NHP）²⁸. 志贺氏菌 斑马鱼已开发出肠道感染模型²⁹，小鼠³⁰，豚鼠³¹，兔子^21,32,33和猪^34,35然而，这些模型系统均无法准确再现人类感染过程中观察到的疾病特征³⁶. 尽管已建立志贺菌病的非人灵长类动物模型用于研究 志贺氏菌 发病机制，这些模型系统实施成本高昂，且需要人为较高的感染剂量，最高可达人类感染剂量的九个数量级^{37,38,39,40,41,42}因此，这种显著的适应性 志贺氏菌 为感染人类宿主的研究需要使用人源性细胞培养物，以构建符合生理相关性的模型，从而对感染过程进行准确解析 志贺氏菌 发病机制

此处详细描述了测量速率的方法 志贺氏菌 HT-29 结肠上皮细胞的黏附、侵袭及胞内复制。利用这些标准化方案，可研究细菌毒力基因和环境信号影响上述每个步骤的分子机制 志贺氏菌 感染可用于深入探究宿主与病原体之间动态相互作用的关系。

方案

1. 试剂与材料的准备

注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。

1. TSB 培养基：将 15 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，参见材料表）加入 0.5 L 去离子水（DI）中，高压灭菌。室温保存。
2. 胆盐培养基（TSB + BS）：配制含 0.4%（w/v）胆盐的 TSB 培养基时，将 0.06 g 胆盐（BS，参见材料表）重悬于 15 mL 高压灭菌后的 TSB 中。使用 0.22 µm 聚醚砜（PES）滤器过滤除菌。
   注意：胆盐为牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠按 1:1 比例组成的混合物。请在使用前新鲜配制。
3. DMEM + 10%（v/v）胎牛血清（FBS）：将 5 mL 胎牛血清（FBS）加入 45 mL 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。4 °C 保存。
4. DMEM + 庆大霉素：向 50 mL 离心管中加入 50 mL DMEM 和 50 µL 浓度为 50 mg/mL 的庆大霉素（参见材料表）。
   注意：每次实验前需新鲜配制，并在 37 °C 水浴中预热。
5. PBS + 1%（v/v）Triton X-100：将 150 µL Triton X-100 加入 15 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   注意：每次实验前需新鲜配制，并在 37 °C 水浴中预热。
6. 含刚果红指示剂的 TSB 平板（TSB + 刚果红）：将 15 g TSB、7.5 g 选择性琼脂和 0.125 g 刚果红染料（参见材料表）加入 1 L 瓶中，加入 0.5 L 去离子水，高压灭菌。将 10–20 mL 培养基倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，静置凝固。
   警告：刚果红具有致癌性且为生殖毒性物质。操作时必须佩戴适当的个人防护装备。更多安全信息请参阅产品安全数据表。
   注意：0.5 L 含刚果红的培养基约可制备 20 块平板。平板可提前 2–3 天制备，倒置存放于室温直至使用。如需长期保存，将平板倒置后放入塑料套中，于 4 °C 保存，最长可存放 3 个月。
7. DMEM + 10%（v/v）FBS 及 5%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）：将 42.5 mL DMEM、5 mL FBS 和 2.5 mL DMSO 加入 50 mL 离心管中。4 °C 保存。

2. 细菌的制备

注意：所有 Shigella 的实验室培养与保存方案均改编自 Payne, S. M.⁴³。

警告：Shigella spp. 属于危险等级2类病原体⁴⁴。所有实验操作均须在生物安全二级（BSL-2）环境中进行，并须采取额外的安全措施，以限制因Shigella spp. 感染剂量低而导致的意外暴露风险。

1. 从冻存菌种培养Shigella
   1. 使用无菌涂布棒从冷冻保存管中取出少量冻存菌液，转移至TSB+刚果红琼脂平板上。
   2. 将接种环火焰灭菌后冷却，将菌液在平板的第一象限内来回划线接种；再次火焰灭菌接种环并冷却后，从第一象限向第二象限划线接种；重复此操作，将菌液依次划线至第三和第四象限。
      注：也可在每个象限之间使用新的无菌涂布棒进行划线接种。
   3. 将平板倒置，在37 °C下过夜培养。
      注：必须在≥37 °C的温度下培养，以表达Shigella毒力因子，这是观察刚果红阳性（CR⁺）表型所必需的⁴⁵。无毒力的菌落呈白色，不具备侵袭性。
   4. 用封口膜密封平板，并在4 °C下冷藏保存。
      注：细菌菌落在琼脂平板上可保持活性1-2周。
2. Shigella液体培养物的过夜培养
   1. 将3 mL TSB培养基分装至无菌的14 mL培养管中。
   2. 使用无菌涂布棒挑取一个孤立良好的红色（CR+）单菌落，并将其重悬于液体培养基中。
   3. 在37 °C、250转/分钟（rpm）振荡条件下培养过夜（16-18小时）。

3. HT-29 真核细胞的制备

注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。HT-29细胞系购自美国模式培养物集存库（ATCC）。HT-29细胞的维持方案根据ATCC推荐方案进行调整⁴⁶。所有培养基在使用前应于37 °C水浴中预热。所有HT-29细胞的维持操作均应在生物安全柜中进行。在培养基中混合或处理HT-29细胞时，应避免产生气泡，以防止pH发生剧烈变化。

1. 从冻存液中复苏 HT-29 细胞
   1. 将 HT-29 细胞冻存管置于 37 °C 水浴中解冻。
      注意：确保管盖完全高于水面，以避免污染。解冻时间应少于 2 分钟。
   2. 细胞完全解冻后立即从水浴中取出冻存管，并用 70% 乙醇进行去污处理。此后所有操作均需采用无菌技术进行。
   3. 将冻存管中全部内容物转移至含有 9 mL DMEM + 10% FBS 的 15 mL 离心管中。在室温下以 125 × g 离心 5 分钟。
   4. 将上清液弃入废液容器中，用 10 mL 预热的 DMEM + 10% FBS 重悬细胞沉淀。将重悬的细胞转移至含有 10 mL 预热 DMEM + 10% FBS 的 75 cm² 组织培养瓶（T75）中（总体积为 20 mL）。
   5. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至细胞融合度达到 90%（约需 6–7 天）。
      注意：融合度通过肉眼估测确定。
2. 接种 HT-29 细胞
   1. 将 20 mL PBS 和 50 mL DMEM + 10% FBS 置于 37 °C 水浴中预热，并将 3 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA 溶液恢复至室温。
   2. 当 HT-29 细胞（来自步骤 3.1）融合度达到 90% 时，将 T75 培养瓶中的细胞培养基弃入废液容器中。向瓶中加入约 10 mL 预热的 PBS，轻轻晃动以洗涤细胞。将 PBS 弃入废液容器中。再次用预热 PBS 洗涤一次，并弃去。
   3. 加入 2–3 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA，轻轻晃动使液体覆盖整个培养表面。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4 分钟。
   4. 从孵育箱中取出培养瓶，轻轻晃动胰蛋白酶-EDTA 溶液，肉眼确认所有细胞均已从表面脱落。
   5. 立即加入 6 mL 预热的 DMEM + 10% FBS 以终止胰蛋白酶活性。用移液器反复吹打混匀。
   6. 将全部内容物转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。
   7. 小心弃去上清液至废液容器中，用 6 mL 预热的 DMEM + 10% FBS 重悬细胞沉淀。
   8. 重悬后立即从中段吸取 10 µL 细胞悬液转移至 0.2 mL PCR 管中。向 PCR 管中加入 10 µL 台盼蓝染料并混匀。
   9. 取 10 µL HT-29 细胞与台盼蓝混合液加入一次性 Countess 细胞计数板（见材料表）。统计活细胞数量并计算细胞活力。
      注意：记录样本中细胞数量时，应读取“活细胞”计数项下的数值，而非总细胞数。也可使用血细胞计数板手动完成细胞计数。
   10. 将重悬的 HT-29 细胞接种至新的 T75 培养瓶或 6 孔板中。
       1. 对于 T75 培养瓶：
          1. 轻轻吹打混匀，然后根据以下公式将 2.5 × 10⁶ 个细胞转移至新的 T75 培养瓶中：
             
          2. 加入预热的 DMEM + 10% FBS 培养基至终体积 20 mL（终浓度为 1.25 × 10⁵ 个细胞/mL）。
          3. 轻轻前后摇动培养瓶，使细胞均匀分布。
          4. 置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至细胞融合度达到 80%。
             注意：为获得最佳生长状态，建议每约 3 天更换一次 T75 培养瓶中的 DMEM + 10% FBS 培养基。将旧培养基弃入废液容器，向瓶中加入 10 mL 预热 PBS，轻轻晃动后弃去。随后向瓶中加入 20 mL 新鲜预热的 DMEM + 10% FBS，放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中。
       2. 对于 6 孔板：
          1. 轻轻吹打混匀，然后根据以下公式将 5.85 × 10⁶ 个细胞转移至新的 50 mL 锥形管中：
             
          2. 加入预热的 DMEM + 10% FBS 培养基至终体积 26 mL（终浓度为 2.25 × 10⁵ 个细胞/mL）。
          3. 轻轻吹打混匀后，向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL（含 4.5 × 10⁵ 个细胞）。
          4. 通过上下左右轻柔晃动 2–3 次，使细胞在孔内均匀分布。
          5. 置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，直至细胞融合度达到 80%–95%（约需 3–4 天）。
             注意：侵袭和胞内复制实验推荐使用 85% 融合度，而黏附实验推荐使用 90%–95% 融合度。通常在接种后 48 小时，细胞融合度可达约 85%，每孔细胞数约为 1 × 10⁶ 个。可能需要根据实际情况调整接种细胞数量和孵育时间。
3. 制备 HT-29 细胞冻存液
   1. 将 1 mL DMEM + 10% FBS + 5% DMSO 培养基分装至各个冻存管中。
   2. 从步骤 3.2.7 中取 1 × 10⁶ 个 HT-29 细胞加入每支冻存管中。根据以下公式计算所需细胞体积：
      
   3. 将 HT-29 细胞长期保存于液氮气相储存罐中，温度低于 -130 °C。

4. 黏附实验

注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。

1. 过夜传代培养 志贺氏菌 培养物 通过 1:50 稀释至新鲜培养基中。
   1. 涡旋混匀，然后将每种过夜培养物各100 µL加入到装有5 mL新鲜TSB或含BS的TSB的合适大小的培养管中。
      注意：将培养体积限制在 <培养瓶或试管体积的20%，以确保充分通气。
   2. 在37 °C、250 rpm振荡培养，直至细胞达到指定的光密度（OD₆₀₀0.7（对数生长中期） 志贺氏菌 生长）；约2-2.5小时。
      注意：传代过程中，分装 50 mL DMEM 以及足量 PBS 用于所有洗涤步骤，并置于 37 °C 水浴中。使用前确保培养基温度升至 37 °C。
2. 转移 2 x 10⁸ 菌落形成单位（CFUs）继代培养 志贺氏菌 转移到各自的 2 mL 微量离心管中。
   注意：2 x 10⁸ CFUs 对应于 1 mL 菌液，其 OD 值约为₆₀₀ 0.7。使用OD₆₀₀ 根据每台分光光度计的校准情况，将读数换算为近似的CFU/mL。
3. 洗涤每一份 志贺氏菌 用 PBS 洗涤 2 次。
   1. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟。吸除上清液，加入1 mL预热的PBS，充分重悬沉淀，轻轻吹打样品8–10次，直至混合液完全均匀。
   2. 重复步骤4.3.1一次。
   3. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL预热的DMEM中。
      注意：重悬细菌的最终浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL
4. 涡旋，然后加入 1 mL（1 × 10⁸ 重悬的菌落形成单位（CFUs） 志贺氏菌 向6孔板中已制备好的HT-29结肠上皮单层细胞（来自步骤3.2.10.2）的每个孔中加入。
   注意：感染通常以感染复数（MOI；细菌与上皮细胞的比例）为100的条件进行。若需测试不同的MOI，可稀释重悬的 志贺氏菌 在温热的DMEM中将细菌稀释至所需浓度，然后向HT-29单层细胞中加入1 mL稀释后的细菌。例如，若要测试MOI为10的感染复数，可通过加入150 µL的1 × 10⁸ 将细菌以 CFU/mL 浓度加入 1.35 mL 温热的 DMEM 中，然后加入 1 mL（1 × 10⁷ 菌落形成单位（CFUs）对 HT-29 细胞的作用。
5. 将6孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 3小时。
6. 孵育期间，测定细菌感染滴度。
   1. 制备重悬液的10倍系列稀释液 志贺氏菌 细胞（来自步骤 4.3.3）加入 PBS 中。
   2. 接种100 µL的1 x 10^-5 和 1 × 10^-6 在TSB + 刚果红平板上进行稀释接种，并于37 °C过夜培养。
      注意：从 1 × 10 的稀释液中取 100 µL 进行涂布^-5 和 1 × 10^-6 稀释对应于最终稀释倍数为 1 x 10^-6 和 1 × 10^-7分别。
7. 孵育后，用 PBS 洗涤单层细胞 4–5 次。
   1. 吸出每孔中的培养基。
      注意：从6孔板中吸取培养基时，应将吸头沿孔的底部移动，尽量避免接触HT-29细胞。
   2. 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS，轻轻洗涤。
      注意：用 PBS 轻柔洗涤 6 孔板单层细胞时，应在实验台面上上下、左右移动培养板。以圆形轨迹晃动培养板和/或将其移离实验台面，可能导致细胞从塑料表面因机械作用而脱落。
   3. 重复步骤 4.7.1 和 4.7.2，共额外进行 4 次。
8. 吸除 PBS，每孔加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 裂解 HT-29 细胞。
9. 将6孔板在37 °C孵育5分钟。
10. 使用细胞刮或弯头移液器吸头将裂解的细胞从孔底刮下，并将全部1 mL液体转移至新的1.7 mL微量离心管中。
11. 确定与细胞相关的细菌数量。
    1. 涡旋振荡每个试管（来自步骤4.10）至少30秒，以进一步分散 志贺氏菌 来自裂解的真核细胞。
    2. 将裂解液用PBS进行10倍系列稀释。
    3. 接种 100 µL 的 1 x 10^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 在TSB + 刚果红平板上进行稀释涂布，并于37 °C过夜培养。
       注意：从 1 × 10 的稀释液中取 100 µL 进行涂布^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 稀释对应于1 × 10的最终稀释倍数^-3，1 × 10^-4，以及 1 × 10^-5分别。

5. 侵袭实验

注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。

1. 过夜传代培养 志贺氏菌 培养物 通过 1:50 稀释至新鲜培养基中。
   1. 涡旋混匀，然后将每种过夜培养物各100 µL加入到装有5 mL新鲜TSB或含BS的TSB的合适大小的培养管中。
      注意：将培养体积限制为 <培养瓶或试管体积的20%，以确保适当的通气。
   2. 在37 °C、250 rpm振荡培养，直至细胞达到OD₆₀₀ 0.7（对数生长中期） 志贺氏菌 生长）；约2-2.5小时。
      注意：传代过程中，分装 50 mL DMEM 加 50 mg/mL 庆大霉素，以及足量的 PBS 用于所有洗涤步骤，并置于 37 °C 水浴中。使用前确保培养基温度升至 37 °C。
2. 转移 2 x 10⁸ CFUs 传代培养 志贺氏菌 转移到各自的2 mL微量离心管中。
   注意：2 x 10⁸ 菌落形成单位（CFUs）对应于光密度（OD）为一定值时约1 mL的细菌细胞₆₀₀ 0.7。使用OD₆₀₀ 根据每台分光光度计的校准情况，将读数换算为近似的CFU/mL。
3. 洗涤 志贺氏菌 用 PBS 洗涤样品 1 次。
   1. 通过离心在17,000 x g下收集细胞沉淀 g 室温孵育2分钟。吸除上清液，加入1 mL预热的PBS，充分重悬沉淀，轻轻吹打样品8–10次，直至混合液完全均匀。
   2. 重复步骤 5.3.1 一次。
   3. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL预热的DMEM中。
      注意：重悬细菌的最终浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL
4. 涡旋，然后加入 1 mL（1 x 10⁸ 重悬的菌落形成单位（CFUs） 志贺氏菌 向6孔板中已制备好的HT-29结肠上皮单层细胞（来自步骤3.2.10.2）的每孔加入1 mL DMEM。
   注意：感染通常以感染复数（MOI；细菌与上皮细胞的比例）为100的条件进行。如需测试不同的MOI，可稀释重悬的 志贺氏菌 在DMEM中将细菌稀释至所需浓度，然后向HT-29单层细胞中加入1 mL稀释后的细菌。例如，若要检测MOI为10的条件，可通过加入150 µL的1 × 10⁸ CFU/mL 细菌加入 1.35 mL DMEM 中，然后加入 1 mL（1 × 10⁷ 菌落形成单位（CFUs）与HT-29细胞的共培养。
5. 为促进细菌与HT-29细胞的接触，将6孔板在2,000 x g 室温或37 °C（若可调节温度）孵育10分钟。
   注意：离心可促进细菌与HT-29细胞的接触，从而绕过对黏附因子的需求，使细菌能够快速侵入细胞。
6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育6孔板₂ 45 分钟。
7. 孵育期间，测定细菌感染滴度。
   1. 制备重悬液的10倍系列稀释液 志贺氏菌 细胞（来自步骤 5.3.3）加入 PBS 中。
   2. 接种100 µL的1 x 10^-5 和 1 × 10^-6 稀释液接种至含刚果红的TSB平板，37 °C过夜培养。
      注意：从 1 × 10⁶ 细胞/mL 的悬液中取 100 µL 进行铺板^-5 和 1 × 10^-6 稀释对应于1 x 10的最终稀释倍数^-6 和 1 × 10^-7分别。
8. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
   1. 吸出每孔中的培养基。
      注意：从6孔板中吸取培养基时，应将吸头沿孔的底部移动，尽量避免接触HT-29细胞。
   2. 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS，轻轻洗涤。
      注意：用 PBS 轻柔洗涤 6 孔板单层细胞时，应在实验台面上上下、左右移动培养板。以圆形轨迹晃动培养板和/或将培养板移离实验台面，可能导致细胞从塑料表面因机械作用而脱落。
   3. 重复步骤 5.8.1 和 5.8.2，额外进行 2 次。
9. 吸除 PBS，每孔加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟₂.
10. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
    1. 重复步骤5.8的洗涤操作。
11. 吸除 PBS，随后每孔加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 60 分钟₂.
12. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
    1. 重复步骤5.8的洗涤操作。
13. 吸除 PBS，每孔加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 裂解 HT-29 细胞。
14. 将6孔板在37 °C孵育5分钟。
15. 使用细胞刮棒或弯头移液器吸头将裂解的细胞从孔底刮下，并将全部1 mL液体转移至新的1.7 mL微量离心管中。
16. 确定细胞内细菌数量。
    1. 涡旋振荡每个试管（来自步骤 5.15）至少 30 秒，以进一步分散 志贺氏菌 来自裂解的真核细胞。
    2. 将裂解液用 PBS 进行10倍系列稀释。
    3. 加入100 µL的1 x 10⁶细胞/孔的细胞悬液^-2 和 1 × 10^-3 在TSB + 刚果红平板上进行稀释涂布，并于37 °C过夜培养。
       注意：从 1 × 10 的稀释液中取 100 µL 进行涂布^-2 和 1 × 10^-3 稀释对应于最终稀释倍数1 x 10^-3 和 1 × 10^-4分别。

6. 细胞内复制实验

注意：所有体积均基于使用两块 6 孔板的实验设计。

1. 过夜传代培养 志贺氏菌 培养物 通过 1:50 稀释至新鲜培养基中。
   1. 涡旋混匀，然后将每种过夜培养物各100 µL加入到装有5 mL新鲜TSB或TSB + BS的合适大小的培养管中。
      注意：将培养体积限制为 <培养瓶或试管体积的20%，以确保充分通气。
   2. 37 °C、250 rpm 振荡培养，直至细胞达到 OD₆₀₀ 0.7（对数生长中期） 志贺氏菌 生长）；约2-2.5小时。
      注意：传代过程中，分装 50 mL DMEM 加 50 mg/mL 庆大霉素，以及足量的 PBS 用于所有洗涤步骤，并置于 37 °C 水浴中。使用前确保培养基温度升至 37 °C。
2. 转移 2 x 10⁸ CFUs 传代培养 志贺氏菌 至各自的2 mL微量离心管中。
   注意：2 x 10⁸ CFUs 对应于约 1 mL 的细菌细胞，其 OD₆₀₀ 0.7。使用OD₆₀₀ 根据每台分光光度计的校准情况，将读数换算为近似的CFU/mL。
3. 洗涤 志贺氏菌 用 PBS 洗涤样本 1 次。
   1. 通过离心在17,000 x g下收集细胞沉淀 g 室温孵育2分钟。吸除上清液，加入1 mL预热的PBS，充分重悬沉淀，轻轻吹打样品8–10次，直至混合液完全均匀。
   2. 重复步骤 6.3.1 一次。
   3. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL预热的DMEM中。
      注意：重悬细菌的最终浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL
4. 涡旋，然后加入 1 mL（1 × 10⁸ 重悬的菌落形成单位（CFUs） 志贺氏菌 向6孔板中已制备好的HT-29结肠上皮单层细胞（来自步骤3.2.10.2）每孔加入1 mL DMEM。
   注意：感染通常在感染复数（MOI；细菌与上皮细胞的比例）为100的条件下进行。如需测试不同的MOI，可稀释重悬的 志贺氏菌 在DMEM中将细菌稀释至所需浓度，然后向HT-29单层细胞中加入1 mL稀释后的细菌。例如，若要检测MOI为10的条件，可通过加入150 µL的1 × 10⁸ 将CFU/mL的细菌加入1.35 mL DMEM中，然后加入1 mL（1 × 10⁷ 菌落形成单位（CFUs）对 HT-29 细胞的作用。
5. 为促进细菌与HT-29细胞的接触，将6孔板在2,000 x g 室温或37 °C（若温度可调节）孵育10分钟。
   注：离心可促进细菌与HT-29细胞的接触，从而无需依赖黏附因子，使细菌能够快速侵入细胞。
6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育6孔板₂ 45 分钟。
7. 孵育期间，测定细菌感染滴度。
   1. 制备重悬液的10倍系列稀释液 志贺氏菌 细胞（来自步骤6.3.3）加入PBS中。
   2. 加入100 µL的1 x 10⁶细胞/mL悬液至培养板中^-5 和 1 × 10^-6 在TSB + 刚果红平板上进行稀释接种，并于37 °C过夜培养。
      注意：从 1 × 10 的稀释液中取 100 µL 进行涂布^-5 和 1 × 10^-6 稀释对应于1 x 10的最终稀释倍数^-6 和 1 × 10^-7分别。
8. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
   1. 吸出每孔中的培养基。
      注意：从6孔板中吸取培养基时，应将移液器吸头沿孔的底部移动，尽量避免接触HT-29细胞。
   2. 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS，轻轻洗涤。
      注意：用 PBS 轻柔清洗 6 孔板单层细胞时，应在实验台面上轻轻上下及左右移动培养板。以环形方式清洗或在清洗过程中将培养板提起离开实验台面，可能导致细胞从塑料表面因机械作用而脱落。
   3. 重复步骤 6.8.1 和 6.8.2，额外进行 2 次。
9. 吸除 PBS，随后每孔加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟₂.
10. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
    1. 重复步骤6.8的洗涤操作。
11. 吸除 PBS，然后向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 在所需时间内孵育，以允许细胞内复制（最长24小时）。
12. 用 1 mL PBS 将细胞充分洗涤 2 次。
    1. 重复步骤6.8的洗涤操作。
13. 吸除 PBS，每孔加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 裂解 HT-29 细胞。
14. 将6孔板在37 °C孵育5分钟。
15. 使用细胞刮或弯头移液器吸头将裂解的细胞从孔底刮下，并将全部1 mL液体转移至新的1.7 mL微量离心管中。
16. 确定细胞内细菌数量。
    1. 涡旋振荡每个试管（来自步骤6.15）至少30秒，以进一步分散 志贺氏菌 来自裂解的真核细胞。
    2. 将裂解液用PBS进行10倍系列稀释。
    3. 加入100 µL的1 x 10⁶ cells/mL细胞悬液至^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 在TSB + 刚果红平板上进行稀释涂布，并于37 °C过夜培养。
       注意：从 1 × 10 的稀释液中取 100 µL 进行涂布^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 稀释对应于1 x 10的最终稀释倍数^-3，1 × 10^-4，以及 1 × 10^-5分别。

结果

通过黏附、侵袭和细胞内复制实验，比较了S. flexneri 2457T野生型（WT）与S. flexneri ΔVF（ΔVF）突变株的特性，后者被认为可能负向调控Shigella的毒力。由于Shigella利用胆盐作为调控毒力的信号分子^17,18,47，实验在细菌于TSB培养基中继代培养后进行，同时设置了添加0.4%（w/v）胆盐的TSB培养条件¹⁸。继代培养过程中暴露于胆盐是一种预处理，用以模拟细菌在进入结肠感染前穿越小肠的生理过程^17,18,47。图1分析了ΔVF突变对S. flexneri黏附HT-29结肠上皮细胞能力的影响。纵轴表示黏附率，即HT-29细胞裂解后回收的细菌数量与接种细菌数量的比值。正如预期，无论与未添加胆盐的TSB相比，S. flexneri WT和ΔVF菌株在添加胆盐的TSB继代培养后，其黏附能力均显著增强¹⁸。然而，在相同继代培养条件下，WT菌株与ΔVF突变株在对HT-29细胞的黏附能力方面并无差异。这些数据表明，ΔVF突变对S. flexneri在有或无胆盐预处理条件下黏附HT-29上皮细胞的能力均无影响。

在图2中，分析了ΔVF突变对S. flexneri在有或无胆盐预处理条件下侵入（图2A）和在HT-29结肠上皮细胞内复制（图2B）能力的影响。纵轴表示回收率，代表HT-29细胞裂解后回收的细菌数量与接种细菌数量的比值。在图2A中，野生型S. flexneri 2457T经胆盐预暴露后侵入HT-29细胞的能力显著增强，符合预期⁴⁸；而S. flexneri ΔVF突变株在胆盐预暴露后的侵入能力提升幅度小于野生型菌株。ΔVF突变株在TSB培养基中继代培养时，其侵入HT-29细胞的效率高于野生型；但在添加胆盐的TSB培养基中继代培养时，其侵入效率与野生型相似（图2A）。这些结果表明，ΔVF突变增强了S. flexneri侵入HT-29细胞的能力，从而削弱了胆盐预处理的作用效果，尽管ΔVF突变株在胆盐继代培养后其侵入能力仍有进一步提高。

总体而言，经过过夜培养后回收的细菌数量比培养90分钟时高出10倍（图2B vs 图2A），这分别体现了监测细胞内增殖与入侵能力之间的差异。当感染HT-29细胞后孵育18小时以允许细菌在细胞内复制（图2B）时，胆盐预处理对野生型（WT）和ΔVF菌株的影响均有所减弱。然而，ΔVF突变株在细胞内复制过程中对胆盐预处理的响应减弱更为显著。由于两种菌株在胆盐预处理后细胞内复制的增幅小于相同条件下入侵率的增幅，我们推测胆盐对S. flexneri致病过程的早期阶段影响更大。ΔVF突变株在两种传代条件下，从HT-29细胞中过夜复制后的回收率百分比均高于野生型（图2B）。然而，ΔVF突变株的回收率百分比在是否经过胆盐预处理的情况下基本相似。这些数据趋势表明，与野生型相比，ΔVF突变株在HT-29细胞内的复制效率更高，且胆盐预处理不影响ΔVF突变株的细胞内复制能力，而野生型则表现出受影响的现象（图2B）。由于在90分钟入侵实验中未观察到突变株与野生型菌株在胆盐预处理条件下的差异，我们推测被删除的VF基因所编码的产物可能也参与调控S. flexneri在HT-29细胞内的复制。综合两项分析结果表明，相对于野生型，ΔVF突变株具有更高的毒力，提示VF基因产物是S. flexneri毒力的负调控因子。

图1：胆盐预处理诱导S. flexneri对HT-29细胞的黏附。S. flexneri 2457T野生型（WT）和ΔVF突变株分别在TSB或添加0.4% (w/v)胆盐的TSB培养基（TSB+BS）中进行传代培养。随后将细菌以感染复数（MOI）为100的条件接种至HT-29细胞，孵育3小时以检测其黏附能力。孵育结束后，洗涤并裂解感染的HT-29细胞，对回收的细菌进行系列稀释后涂布平板，以测定每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。黏附细菌数量相对于接种细菌滴度进行归一化处理，计算出黏附百分率。数据代表一次生物学重复实验，包含三次技术重复（单个圆点）。误差线表示均值的标准误（SEM）。统计学显著性通过Student t检验确定（*p < 0.05；***p < 0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：胆盐预暴露增强了野生型 S. flexneri 的侵袭能力及胞内复制能力。将 S. flexneri 2457T 野生型和 ΔVF 突变株在 TSB 培养基或添加胆盐的 TSB 培养基（TSB+BS）中进行传代培养。随后以感染复数（MOI）为 100 的条件将细菌接种至 HT-29 细胞，经离心使细菌与细胞接触，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，向 DMEM 培养基中加入庆大霉素以裂解胞外细菌，从而仅回收胞内细菌。在孵育 90 分钟（A，细菌侵袭）或 18 小时（B，胞内复制）后，洗涤并裂解被感染的 HT-29 细胞，对回收的细菌进行系列稀释后涂布平板，以测定每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。将胞内细菌数量相对于接种细菌滴度作图，以计算回收率百分比。数据代表一次生物学重复实验，每次生物学重复包含三次技术重复（单个圆点）。误差线表示标准误（SEM）。统计学显著性通过 Student t 检验确定（*p < 0.05）。请注意图中（A）与（B）两组的 y 轴刻度差异。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了一组三种标准化的实验方法，用于研究Shigella对肠上皮细胞的黏附、侵袭以及胞内复制。尽管这些方法仅是对经典庆大霉素保护实验的改良版本，最初用于研究多种细菌病原体在宿主细胞内的侵袭和胞内复制过程^49,50,51，但在研究Shigella时必须采用特殊的实验条件和考虑因素。

志贺氏菌 是兼性厌氧菌，在有氧条件下，于37 °C的丰富培养基中生长最佳⁴³在进行这些检测以探究不同环境信号或代谢物对...的影响时 志贺氏菌 感染时，建议培养 志贺氏菌 在丰富培养基中过夜培养，然后转接至限定或补充培养基中，于感染前培养至对数生长中期。毒力基因的最大表达发生在对数生长期。^52,53因此，过夜传代培养 志贺氏菌 培养并使细菌生长至指数期（OD₆₀₀ ~ 0.7）是正确评估的必要步骤 志贺氏菌 毒力。此外，毒力基因的表达具有温度依赖性。为确保仅在宿主感染期间特异性表达，毒力基因在宿主生理温度（37 °C）下被诱导，而在较低温度（如 30 °C）下则受到严格抑制。⁵⁴为确保毒力基因的表达，细菌传代培养和感染操作必须在37 °C下进行，并需妥善控制温度，防止低于37 °C。一个大小约为220 kb的毒力质粒是所有此类细菌所必需的关键毒力决定因子，该质粒编码了入侵和感染上皮细胞所需的分子机制。 志贺氏菌 种（spp）⁵反复传代和在37 °C下长期培养会促进毒力质粒的不稳定性，导致质粒丢失，从而使菌株失去毒力 志贺氏菌 无毒力细胞⁵⁵为确保毒力质粒的稳定维持及关键毒力基因的表达，建议每隔两周将细菌直接从冻存菌种重新划线接种至新鲜的TSB + 刚果红指示剂平板。刚果红琼脂可用于区分野生型毒力菌株（红色，CR⁺）与非毒力或质粒丢失突变株（白色，CR⁻）。⁺）菌落和无毒型（白色，CR^-丢失毒力质粒的菌落⁴⁵若反复观察到毒力质粒不稳定，应进行过夜培养的 志贺氏菌 可在30 °C下孵育以防止毒力质粒丢失，随后在37 °C下传代培养以促进毒力基因表达⁴³最后，如果使用含有抗生素标记的突变株和/或互补菌株进行分析，建议在细菌过夜培养及传代培养步骤中使用相应的抗生素筛选。

使用HT-29上皮单层细胞在研究分子机制方面具有多种优势 志贺氏菌 发病机制 体外。由于 志贺氏菌 是一种适应于人类的病原体，因此小型动物模型无法准确反映人类志贺菌病的特征性发病机制³⁶因此，采用标准化的感染人源细胞系的实验方案，可对细菌致病过程中的各个步骤进行定量分析，以表征该病原体与其天然宿主之间的分子相互作用。历史上，HeLa细胞被广泛用于研究宿主与病原体之间的相互作用。 体外^25,56,57然而，HeLa细胞是一种永生化的宫颈癌细胞系，对于肠道细菌病原体而言属于非天然宿主细胞。因此， 体外 对肠道致病机制的研究已转向使用结肠腺癌细胞系（如 HT-29、Caco-2 和 T84），这些细胞系能更真实地模拟肠上皮形态，并可在跨孔培养系统中生长为具有分化明显的顶膜和基底侧膜的上皮单层。^58,59,60尽管每种细胞系都有其各自的优缺点，但HT-29细胞因其在表型上与肠道肠上皮细胞具有相似性，并能稳定表达细胞表面受体和促炎性细胞因子，故被用于本文所述的实验。^58,59,61然而，上述讨论的每种模型均为癌症来源的细胞系，具有异常的代谢和生长表型，不能准确代表结肠上皮的自然生理状态 体内⁵⁸近年来，人类组织培养技术的进步使得从组织活检中获取的人类肠道干细胞能够被培养成类器官或单一的二维细胞单层，这些模型可重现人体胃肠道（GI） tract 中存在的多种细胞类型^62,63,64肠道类器官可分化为包含肠上皮细胞、分泌黏液的杯状细胞、M细胞及其他组织特异性细胞类型。近期研究已证实，这些类器官模型可用于研究肠道病原体，包括多种 志贺氏菌 sp. 鼠伤寒沙门氏菌，以及 大肠杆菌 致病变种^62,63,64尽管类器官是更精确的人胃肠道上皮模型，甚至可在不同的营养条件下培养以代表全球人群⁶⁵，其相对复杂的特性需要大量的培训和技术专长，导致与传统癌细胞系相比，培养成本更高且培养时间更长⁵⁸.

本方案描述了中等通量的实验方法，即使用两块6孔板，共可提供12个单层细胞用于检测。然而，实验可轻松扩大规模，以增加接种的单层细胞数量，从而容纳更多的技术重复，或检测更多的Shigella突变株和环境信号。也可使用孔数更多的组织培养板（例如 12孔板或24孔板），但需根据孔径较小的情况进行适当调整。根据步骤3.2中所述的HT-29培养条件，从一个T75培养瓶中培养出的HT-29细胞滴度足以接种约六个6孔板，同时还能保留足够数量的细胞以维持HT-29细胞系的培养。此外，细菌黏附、侵袭及胞内复制实验在HT-29单层细胞的接种和接种菌液的制备步骤上完全相同。因此，针对相同Shigella菌株或传代培养条件的实验可平行开展，从而同时考察各实验条件在Shigella感染不同阶段中的作用。

通过裂解感染的 HT-29 细胞后进行系列稀释并涂板，测定贴壁（步骤 4）、侵入（步骤 5）和细胞内细菌（步骤 6）的回收滴度，从而实现对每个阶段效率的定量评估 志贺氏菌 感染。基于经典实验方法的侵袭和细胞内复制实验中的离心步骤^49,50,51，促进细菌与宿主细胞的接触以实现快速侵入，并提高侵入率。因此，离心处理 "跳过" 黏附步骤，后来被发现是其中一个重要方面 志贺氏菌 感染^17,18,19,66需要注意的是，接种在Transwell小室上的极化上皮细胞不能进行离心步骤。然而，在黏附实验中，黏附过程不通过离心强制进行，且在裂解感染的HT-29细胞前不添加庆大霉素，从而允许对黏附的细菌细胞进行计数。为了使细菌与HT-29细胞更有效地接触，组织培养基的体积减少至1 mL（相对于侵袭和细胞内复制实验的2 mL）。此外，根据黏附速率的不同，在3小时孵育期间可能发生一定程度的侵袭和细胞内复制，但通常可忽略不计（例如， 仅占宿主细胞裂解后回收细菌群体的0.05%。然而，为了准确区分在3小时孵育期间黏附于细胞表面与真正内化的细菌，建议进行平行实验：除标准操作步骤外，另设一组培养板，每孔加入2 mL含50 µg/mL庆大霉素的DMEM，总体孵育45分钟（先孵育15分钟，洗涤一次，再更换为新鲜DMEM加庆大霉素继续孵育30分钟），以彻底清除胞外细菌。随后按照方案所述裂解HT-29细胞，按前述方法计数胞内菌数量，该数值即代表成功入侵的细菌数。将未经庆大霉素处理组所计数的总细菌数减去此数值，即可准确区分黏附与入侵的细菌数量。此外，也可通过平行分析进一步探究细菌在细胞内的复制情况。 志贺氏菌 在侵袭HT-29细胞后，可通过多个时间点绘制细胞内细菌生长曲线，以评估其胞内增殖情况。最后，在经过18小时庆大霉素孵育后，除对细胞内细菌进行计数外，还可收集培养上清液，检测感染HT-29细胞的细胞因子分泌水平。例如，IL-8是一种由上皮细胞分泌的趋化因子，主要功能是募集中性粒细胞（PMNs）至感染部位。可通过IL-8 ELISA检测法测定感染HT-29细胞培养上清中IL-8的分泌量。⁶⁷.

胆盐已被证实是Shigella在通过人体胃肠道过程中重要的毒力信号，可在本实验方案的细菌培养基中添加胆盐，以模拟典型的胃肠道环境。正常情况下，胆盐在十二指肠或小肠上段释放，以协助消化； 而在回肠末端或小肠末端，约95%的胆盐被吸收并重新循环，最终储存于胆囊⁶⁸。小肠内胆盐的浓度通常在0.2%–2.0%（w/v）之间，具有天然的杀菌作用。然而，Shigella与大多数肠道细菌一样，能够耐受胆盐，并利用这些信号增强感染能力⁴⁷。已有多个研究记录了胆盐暴露（有时与其他小肠信号如葡萄糖共同作用）如何影响Shigella在感染前的存活及毒力调控。研究表明，在模拟小肠通过条件的环境中，Shigella能够抵抗胆盐、改变基因表达，并形成和分散生物膜^17,69。这些变化可导致出现高毒力表型，即当Shigella随后感染结肠时，其黏附和侵袭能力被显著诱导^{17,18,19,48,66}。因此，上述条件描述了如何在进行黏附、侵袭或细胞内复制实验前，使用胆盐对Shigella进行传代培养，以模拟其在小肠中的通过过程。所指定的TSB培养基配方相较于典型的Luria肉汤（LB）含有额外添加的葡萄糖¹⁷。因此，若使用LB培养基，则必须同时补充葡萄糖（0.5%–2.0% [w/v]），以充分考虑小肠中的葡萄糖信号影响¹⁷。此外，如上所述，所有Shigella的传代培养物均需经过洗涤以去除胆盐，从而模拟其向结肠转移的过程，用于后续感染分析。

传统上，以及如上文结果所示（图1 和 图2），感染实验对于确定特定基因在其中的作用具有重要价值 志贺氏菌 感染。然而，若不恰当地补充细菌培养基，各种突变体的表型可能无法被准确评估。正如先前研究所表明的，胆盐会显著改变 S. flexneri 基因表达，包括中心代谢基因、转录因子、糖转运蛋白、药物抗性基因以及位于染色体或毒力质粒上的毒力基因¹⁷这些基因有助于揭示 志贺氏菌 利用胆盐作为信号来改变基因表达，为最终感染结肠做准备，因此在进行黏附、侵袭和细胞内复制等毒力相关实验之前，必须在添加了适当成分的细菌培养基中完成后续的突变体分析。如上所述 图1 和 图2，ΔVF 突变不影响黏附能力，但影响侵袭和细胞内复制。由于该突变增强了侵袭和细胞内复制能力，目前正在进行实验以确定该基因产物如何调控感染过程。突变体分析为深入理解相关机制提供了范例 志贺氏菌 致病机制可被研究，尤其是在更接近人类胃肠道条件的情况下。建议进行适当的互补分析，以验证各类突变体的表型。

综合而言，这些实验步骤描述了定量实验，将为深入理解分子作用机制提供重要见解 志贺氏菌 黏附、侵袭以及在HT-29结肠上皮细胞内的复制，以最佳模拟人类胃肠道感染期间的自然环境。未来的研究可拓展突变株和实验条件，以更深入地理解其机制 志贺氏菌 为有效感染人类宿主做准备。尽管已有数十年的研究，关于这一领域仍有许多未知有待探索 志贺氏菌 感染.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm PES 滤膜	Millipore-Sigma	SCGP00525	无菌聚醚砜滤膜，用于过滤灭菌最多 50 mL 培养基
14 mL 培养管	Corning	352059	17 mm × 100 mm 聚丙烯带盖试管
50 mL 锥形离心管	Corning	430829	50 mL 透明聚丙烯圆锥底离心管，带防漏盖
6 孔组织培养板	Corning	3516	经表面处理，利于细胞最佳贴附
胆盐	Sigma-Aldrich	B8756	胆酸与脱氧胆酸按 1:1 比例混合
刚果红染料	Sigma-Aldrich	C6277	一种基于联苯胺的阴离子偶氮染料，>85% 纯度
Countess 细胞计数板	Invitrogen	C10283	与 Countess 自动细胞计数仪配合使用
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418	一种高度极性的有机试剂
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	10569-010	DMEM 添加了高浓度葡萄糖、丙酮酸钠、GlutaMAX 和酚红
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F4135	经热灭活处理，无菌
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G3632	储存液浓度为 50 mg/mL
HT-29 细胞系	ATCC	HTB-38	腺癌细胞系，来源于结直肠
石蜡膜	Bemis	PM999	实验室封口膜
培养皿	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm × 15 mm 培养皿，用于固体培养基
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010049	1× 浓度；pH 7.4
琼脂	Invitrogen	30391023	从红藻细胞壁提取的多糖混合物，用于制备细菌培养平板
T75 培养瓶	Corning	430641U	组织培养瓶
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	一种常用的非离子型表面活性剂和乳化剂
台盼蓝染色液	Invitrogen	T10282	用于检测死亡的组织培养细胞；只有活细胞能够排斥该染料
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056	用于细胞解离，适用于细胞系的维持与传代
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	Sigma-Aldrich	T8907	细菌生长培养基