本实验方案描述了用于探究的感染实验方法 志贺氏菌 黏附、侵袭和细胞内复制 体外 上皮细胞系
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类适应的肠道致病菌 志贺氏菌 每年导致数百万例感染，对儿科患者的长期生长发育造成影响，并且是全球腹泻相关死亡的主要原因之一。感染后，病原体穿过胃肠道并侵染结肠上皮细胞，从而引发水样或血性腹泻。由于抗生素耐药性急剧上升，且目前尚无获批疫苗，因此建立标准化的研究方案对于深入研究这一严重病原体至关重要。本文介绍了一系列用于研究其分子致病机制的方法。 志贺氏菌 使用 体外 结肠上皮细胞中细菌黏附、侵袭及胞内复制的分析。在进行感染分析之前，毒力表型的 志贺氏菌 菌落通过在琼脂平板上吸收刚果红染料来验证。在细菌培养过程中，也可考虑使用添加了补充成分的实验室培养基以模拟 体内 条件下，采用标准化实验流程，将细菌细胞以既定的感染复数接种于培养板中的结肠上皮细胞，以感染结肠上皮细胞，并根据需要进行调整，以分析感染的各个阶段。对于黏附实验， 志贺氏菌 细胞在低培养基水平下孵育，以促进细菌与上皮细胞的接触。在侵袭和胞内复制实验中，均采用庆大霉素处理不同时间，以清除胞外细菌，从而评估细菌侵袭情况和/或定量胞内复制速率。所有感染实验均通过梯度稀释感染后的上皮细胞裂解液，将细菌菌落形成单位在刚果红琼脂平板上进行计数，并相对于接种滴度进行归一化，以分别定量黏附、侵袭和/或胞内细菌数量。上述方法可实现对感染各阶段的独立表征与比较 志贺氏菌 感染上皮细胞以成功研究该病原体。
引言
由肠道致病菌引起的腹泻病是全球重大的公共卫生负担。2016年，腹泻病在全球造成130万人死亡，是五岁以下儿童死亡的第四大原因1,2。革兰氏阴性肠道致病菌Shigella是志贺菌病的致病因子，而志贺菌病是全球腹泻相关死亡的主要原因之一3。每年，中低收入国家的儿童中因志贺菌病导致大量发病和死亡4,5，而在高收入国家，感染通常与托儿所、食源性和水源性暴发有关6,7,8,9。疫苗研发效果不佳10以及抗菌药物耐药性（AMR）日益加剧11,12，使大规模Shigella疫情的防控更加复杂。美国疾病控制与预防中心近期数据显示，2020年美国近46%的Shigella感染病例表现出耐药性
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 试剂与材料的准备
注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。
- TSB 培养基：将 15 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，参见 材料表）加入 0.5 L 去离子水（DI）中，高压灭菌。室温保存。
- 胆盐培养基（TSB + BS）：配制含 0.4%（w/v）胆盐的 TSB 培养基时，将 0.06 g 胆盐（BS，参见 材料表）重悬于 15 mL 高压灭菌后的 TSB 中。使用 0.22 µm PES 滤器过滤除菌。
注意：胆盐为牛磺胆酸钠与脱氧胆酸钠的 1:1 混合物。请在使用前新鲜配制。 - DMEM + 10%（v/v）胎牛血清（FBS）：将 5 mL 胎牛血清（FBS）加入 45 mL 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。4 °C 保存。
- DMEM + 庆大霉素：向 50 mL 离心管中加入 50 mL DMEM 和 50 µL 浓度为 50 mg/mL 的庆大霉素（参见 材料表）。
注意：每次实验前需新鲜配制，并在 37 °C 水浴中预热。 - PBS + 1%（v/v）Triton X-100：将 150 µL Triton X-100 加入 15 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注意：每次实验前需新鲜配....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过黏附、侵袭和细胞内复制实验，比较了S. flexneri 2457T野生型（WT）与S. flexneri ΔVF（ΔVF）突变株的特性，后者被认为对Shigella的毒力具有负调控作用。由于Shigella利用胆盐作为调控毒力的信号分子17,18,47，实验在细菌于TSB培养基中继代培养后进行，同时设置了添加0.4%（w/v）胆盐的TSB培养基组18。继代培养过程中暴露于胆盐被视为一种预处理，用以模拟细菌在进入结肠感染前穿越小肠的生理过程17,18,47。图1分析了<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案描述了一组三种标准化的实验方法，用于研究Shigella对肠上皮细胞的黏附、侵袭以及胞内复制。尽管这些方法仅是对经典庆大霉素保护实验的改良版本，最初用于研究多种细菌病原体在宿主细胞内的侵袭和胞内复制过程49,50,51，但在研究Shigella时必须采用特殊的实验条件和考虑因素。
志贺氏菌 是兼性厌氧菌，在有氧条件下，于37 °C的丰富培养基中生长最佳43在进行这些检测以探究不同环境信号或代谢物对...的影响时 志贺氏菌 感染时，建议培养 志贺氏菌 在丰富培养基中过夜培养，然后转接至限定或补充培养基中，于感染前培养至对数生长中期。毒力基因的最大表达发生在对数生长期。52,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者的研究得到了马萨诸塞州总医院儿科系、研究执行委员会临时支持基金（ISF）项目2022A009041、美国国家过敏与传染病研究所资助R21AI146405以及美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助哈佛营养与肥胖研究中心（NORCH）2P30DK040561-26的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm PES 滤膜 | Millipore-Sigma | SCGP00525 | 无菌聚醚砜滤膜，用于过滤灭菌最多 50 mL 培养基 |
| 14 mL 培养管 | Corning | 352059 | 17 mm × 100 mm 聚丙烯带盖试管 |
| 50 mL 锥形离心管 | Corning | 430829 | 50 mL 透明聚丙烯圆锥底离心管，带防漏盖 |
| 6 孔组织培养板 | Corning | 3516 | 经表面处理，利于细胞最佳贴附 |
| 胆盐 | Sigma-Aldrich | B8756 | 胆酸与脱氧胆酸按 1:1 比例混合 |
| 刚果红染料 | Sigma-Aldrich | C6277 | 一种基于联苯胺的阴离子偶氮染料，>85% 纯度 |
| Countess 细胞计数板 | Invitrogen | C10283 | 与 Countess 自动细胞计数仪配合使用 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | 一种高度极性的有机试剂 |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 10569-010 | DMEM 添加了高浓度葡萄糖、丙酮酸钠、GlutaMAX 和酚红 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F4135 | 经热灭活处理，无菌 |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G3632 | 储存液浓度为 50 mg/mL |
| HT-29 细胞系 | ATCC | HTB-38 | 腺癌细胞系，来源于结直肠 |
| 石蜡膜 | Bemis | PM999 | 实验室封口膜 |
| 培养皿 | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm × 15 mm 培养皿，用于固体培养基 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1× 浓度；pH 7.4 |
| 琼脂 | Invitrogen | 30391023 | 从红藻细胞壁提取的多糖混合物，用于制备细菌培养平板 |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641U | 组织培养瓶 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 一种常用的非离子型表面活性剂和乳化剂 |
| 台盼蓝染色液 | Invitrogen | T10282 | 用于检测死亡的组织培养细胞；只有活细胞能够排斥该染料 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | 用于细胞解离，适用于细胞系的维持与传代 |
| 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB） | Sigma-Aldrich | T8907 | 细菌生长培养基 |
参考文献
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
