改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

摘要

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。

摘要

轻度创伤性脑损伤是一种临床表现高度异质性的神经系统疾病。为了研究轻度创伤性脑损伤后神经病理机制并测试治疗方法，迫切需要建立具有明确病理特征且高度可重复的创伤性脑损伤（TBI）动物模型。在动物模型中完整复制TBI的全部继发性病变已被证明具有挑战性。因此，有必要提供多种TBI动物模型，以涵盖TBI患者中观察到的不同方面和严重程度。闭合性头部撞击（CHI）是制备重复性轻度TBI（rmTBI）啮齿类动物模型最常用的方法之一。然而，该方法易受多种因素影响，包括撞击方式、颅骨厚度与形状、动物呼吸暂停情况以及头部固定与支撑方式。本实验方案旨在展示一种结合减薄颅窗与液体脉冲损伤（FPI）的方法，以建立精确的与CHI相关的rmTBI小鼠模型。本方案的主要目标是尽量减少可能影响CHI和FPI建模准确性与一致性的因素，包括颅骨厚度、形状及头部支撑方式。通过采用减薄颅窗技术，可最大程度减少因开颅手术及FPI引起的潜在炎症反应，从而建立更优的小鼠模型，更好地模拟轻度TBI患者中观察到的临床特征。行为学检测及苏木精-伊红（HE）染色组织学分析结果表明，rmTBI可导致累积性损伤，引起行为学及脑组织大体形态的改变。总体而言，改进的与CHI相关的rmTBI模型为研究人员探索rmTBI中局灶性和弥漫性病理生理变化的潜在机制提供了一种有效的工具。

引言

轻度创伤性脑损伤（mild TBI），包括脑震荡和亚脑震荡，占所有创伤性脑损伤病例的大多数（>80%）¹。轻度创伤性脑损伤通常由跌倒、交通事故、暴力行为、接触性运动（如橄榄球、拳击、冰球）以及军事战斗引起^2,3。轻度创伤性脑损伤可引发一系列影响患者终生神经行为功能的神经生物学事件，并增加患神经退行性疾病的风险^4,5,6。动物模型为研究轻度创伤性脑损伤提供了高效且可控的手段，有望进一步提升对该类损伤的诊断与治疗水平。目前已开发出多种轻度创伤性脑损伤模型，例如可控性皮层冲击（CCI）、重物坠落（WD）、液体脉冲损伤（FPI）以及爆炸所致脑损伤（blast-TBI）模型^7,8。尚无单一实验模型能够完全模拟创伤性脑损伤所引起的病理复杂性^9,10。这些模型的异质性有助于揭示轻度创伤性脑损伤患者表现出的多样化临床特征，并深入探究其相关的细胞与分子机制。然而，每种动物模型均存在局限性³，这限制了当前对动物轻度创伤性脑损伤及其临床相关性的认识。

WD 模型和 CCI 模型被用于模拟临床状况，例如脑组织丢失、急性硬膜下血肿、轴突损伤、脑震荡、血脑屏障功能障碍，甚至创伤性脑损伤（TBI）后的昏迷状态^3,11,12。WD 模型通过自由落体的重物撞击硬脑膜或颅骨来诱导脑损伤。重物对完整颅骨的冲击可模拟混合性局灶性和弥漫性损伤；然而，该方法存在损伤部位准确性与可重复性差、反冲性损伤以及因颅骨骨折导致较高死亡率等问题^3,11,12。CCI 模型则利用气动驱动的金属探头直接撞击暴露的硬脑膜。与 WD 模型相比，CCI 模型具有更高的精确性和可重复性，但由于撞击头直径较小，难以产生弥漫性损伤¹¹。在 FPI 建模过程中，脑组织因冲击而短暂移位和变形。FPI 可诱导混合性局灶性和弥漫性损伤，并模拟颅内出血、脑肿胀以及 TBI 后进行性灰质损伤。然而，由于脑干损伤和长时间呼吸暂停，FPI 模型的死亡率较高^3,12。传统的 WD、CCI 和 FPI 模型所涉及的开颅手术可能导致皮质挫伤、出血性病灶、血脑屏障破坏、免疫细胞浸润、胶质细胞活化、建模时间延长以及潜在的致死性后果^3,12。

轻度创伤性脑损伤（TBI）的特征是格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale, GCS）在13至15分之间²。轻度TBI可以是局灶性的，也可以是弥漫性的，与急性损伤（如细胞稳态破坏、兴奋性毒性、葡萄糖耗竭、线粒体功能障碍、血流紊乱和轴突损伤）以及亚急性损伤（包括轴突损伤、神经炎症和胶质增生）相关^2,3。尽管在阐明TBI复杂的病理生理机制方面已取得显著进展，但轻度TBI/反复性轻度TBI（rmTBI）的潜在机制仍不明确，需要进一步研究⁹。鉴于闭合性头部损伤（CHI）是最常见的TBI类型¹²，本方案提出一种新颖的方法，利用改良的液体打击损伤（FPI）装置在颅骨变薄窗口处实施冲击，以建立更精确可控的rmTBI小鼠模型¹³。该方法通过避免开颅手术引起的损伤、因颅骨厚度和形状差异导致的定位误差以及反冲损伤，旨在克服挫伤打击（WD）、控制性皮质撞击（CCI）和FPI模型的主要缺陷。在颅骨变薄窗口上实施FPI冲击便于评估rmTBI后脑血管损伤情况，同时有助于降低某些模型中的高死亡率，从而使模型更接近TBI患者的临床特征。

方案

本方案中涉及的所有操作均在机构动物护理和使用委员会批准（浙江师范大学，许可证号：dw2019005）下进行，并符合ARRIVE指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。技术参数详见材料表。

1. 动物操作流程

1. 在温度为22-24 °C、湿度为40%-60%、12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境中饲养小鼠，并提供 随意摄取 可自由获取水和标准小鼠饲料。本实验使用25只ICR雄性小鼠（25-30 g，8周龄）。
2. 将小鼠随机分配至对照组（n=12）或重复轻度创伤性脑损伤组（rmTBI组，n=13）。为防止假手术小鼠对经历rmTBI的小鼠产生潜在攻击行为，应将两组小鼠分笼饲养。
3. 实验开始前，应让小鼠至少适应其笼具环境1周。该适应期可确保小鼠熟悉周围环境，并最大限度减少应激或焦虑对研究过程中生理或行为反应的潜在影响。

2. TBI 设备的制备

1. 使用改良的流体冲击损伤（FPI）装置在小鼠中构建重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型（参见材料表；图1A）¹³。在使用FPI装置前，应仔细检查所有连接处是否存在泄漏或裂纹，特别注意气缸与管路之间以及三通连接器与管路之间的接口。为准确测定冲击压力，在流体冲击损伤装置上冲击点位置安装了 压力传感器 ¹³。
2. 仔细检查FPI装置，确保活塞在气缸内能够平稳移动，并能有效实施冲击（图1B）。确认系统内无气泡存在。若发现气泡，使用50 mL注射器向系统中缓慢加入蒸馏水，并通过快速推动气缸杆经附近的三通连接器和/或注射器将气泡排出。
   注意：FPI系统内部由蒸馏水填充，包括气缸及相连管路。在操作前必须对装置进行校准，以确保实验结果的准确性与可靠性。

3. 薄颅骨制备

注意：动物手术和颅骨变薄制备不应在其他小鼠的视野范围内进行。颅骨变薄窗口可用于评估FPI手术后脑血管的损伤情况。

1. 按照动物中心的要求，指导实验操作人员在进行所有动物操作时穿戴无菌手术服和口罩。
2. 使用70%乙醇喷雾对实验台面、FPI设备、麻醉管路及周围台面进行消毒，然后开始实验。
3. 在手术前称量假手术组和重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）组小鼠的体重，并与实验前1周记录的体重进行比较。排除任何表现出健康状况不佳的小鼠，例如毛发粗糙、腹泻、体重减轻或精神萎靡。此外，排除体重低于20 g的小鼠，以确保其能够耐受重复性冲击。这些措施对于保障动物福利和确保实验结果的可靠性至关重要。
4. 将小鼠置于诱导室中，使用4%-5%异氟烷（以1 L/min流速通入100%氧气）麻醉3-4分钟。为保持手术期间眼睛的润滑，向动物眼部涂抹眼用润滑剂（参见材料表）。为减轻疼痛，在麻醉前20分钟于两耳之间皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，并在之后每6小时重复给药一次，持续24小时。此外，在麻醉结束时，为每只动物皮下注射一次5 mg/kg的卡洛芬。
5. 待小鼠失去翻正反射和足底回缩反射后，对其头部进行消毒。使用手术剪修剪小鼠头部毛发，并用剃毛器去除残留毛发。使用2%氯己定溶液进行三次连续消毒，每次间隔使用75%乙醇擦拭。
6. 在动物及其周围区域下方放置一次性无菌手术垫，以确保良好的无菌环境。使用精细小号手术剪沿小鼠头顶部正中线做1.5 cm切口，充分暴露手术区域（图2A）。
7. 使用非侵入性耳杆将小鼠固定于常规立体定位仪（参见材料表）中。根据拟研究的具体靶区，调整小鼠头部在立体定位仪中的位置，使其处于水平或轻微倾斜角度。清除手术区域的毛发，以避免后续发生炎症。
8. 使用常规恒温加热垫维持小鼠体温在37 °C（参见材料表）。
9. 在手术及冲击连接装置（雌性鲁尔锁接头）安装过程中，通过鼻罩持续输送2%异氟烷（由校准的挥发器调控浓度），维持小鼠麻醉状态（无足趾或尾部夹捏反应）。
10. 使用无菌生理盐水浸湿的棉签仔细清洁去薄颅骨窗周围的手术区域。
11. 使用平头微型钻头（参见材料表，图2B）和显微外科刀片，在右侧额叶运动皮层制作一个直径约2.5 mm、厚度约20 µm的去薄颅骨窗。手术位点定位于前囟前1.5 mm、中线外侧1.3-2.0 mm处（图2C）。
    1. 为防止微型钻头在制作去薄颅骨窗过程中穿透颅骨，钻磨时应间歇性地用生理盐水湿润颅骨表面。
    2. 使用细针头的扁平尖端轻柔探触去薄区域，通过触感判断其柔软程度，同时目视评估暴露的皮层微血管清晰度，以判断颅骨厚度。
    3. 为验证颅骨厚度，将无菌生理盐水滴加至去薄区域，并使用常规解剖显微镜进行目视检查（参见材料表）。该方法有助于确认颅骨是否已充分去薄。
       注意：在整个去薄颅骨准备及rmTBI建模过程中，需持续润滑小鼠眼部，防止角膜干燥。若颅骨去薄至小于15 µm，可能造成轻微皮层创伤，进而引发轻度皮层炎症¹⁴。
12. 将一个调整好的雌性鲁尔锁接头（内径2.2 mm，由19G针座改制而成，如图2D所示）固定于去薄颅骨窗位置。使用胶水和牙科水泥将鲁尔锁接头固定（图2E）。
    注意：使用胶水将雌性鲁尔锁接头固定于去薄颅骨窗周围区域时，必须彻底干燥颅骨表面，并防止粘合剂渗入窗口内部。若粘合剂进入窗口，将显著降低FPI的冲击力。

4. 与 CHI 相关的重复性轻度创伤性脑损伤建模流程

1. 采用改良的流体冲击装置，通过侧向流体冲击法诱导重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI），具体方法如先前所述^13,15。
2. 完成颅骨变薄窗口及冲击连接装置操作后，将小鼠从立体定位仪转移至冲击平台。
3. 鉴于麻醉可能影响动物在冲击后的翻正反射时间及损伤严重程度^9,16，应通过评估眼睑反射和足爪回缩反射来监测麻醉深度（图2F）。
4. 将粘附在颅骨变薄窗口上的雌性鲁尔锁接头与FPI装置导管末端的雄性鲁尔锁接头连接（图2G）。
   注意：在rmTBI建模过程中，由于冲击诱导了呼吸暂停和意识丧失，异氟烷麻醉时间会延长。
5. 使用改良装置进行两次轻度TBI（间隔48小时）。在完成颅骨变薄窗口手术并安装鲁尔锁后立即实施第一次FPI冲击。每次仅在小鼠对足爪夹捏刺激恢复回缩反射后才进行FPI冲击（图2H）。在深度麻醉的小鼠中实施FPI冲击可能导致长时间呼吸暂停甚至死亡。
   1. 实施FPI冲击时，将摆锤沿设备上的量角器提升至指定角度，并通过软件控制释放摆锤^13,15。冲击应达到2.0 ± 0.1 atm的冲击强度，符合啮齿类动物研究中已建立的方案^10,17,18。若冲击压力未在1.9–2.1 atm范围内记录到，或在FPI过程中发生颅骨骨折，则将该动物排除于后续实验之外。
   2. 对于假手术组小鼠，将其固定在装置上，但不施加冲击。
6. 冲击后立即断开鲁尔锁连接，并将小鼠转移至恒温加热垫上恢复。待小鼠恢复清醒和意识后，将其放回原笼，雌性鲁尔锁无需拆除。48小时后以相同方式实施第二次FPI冲击。
7. rmTBI后，小心移除雌性鲁尔锁和牙科水泥。使用组织粘合剂缝合头皮，并用平头镊子轻压头皮以促进粘合过程（参见材料表；图2I）。
8. 为预防炎症、感染以及缓解术后疼痛与不适，将红霉素与双氯芬酸钠软膏按1:1比例混合后涂抹于伤口处（参见材料表）。将小鼠转移至恒温加热垫上恢复。
9. 记录翻正反射持续时间，即从小鼠从立体定位仪上取下并侧卧放置于冲击平台上开始，至其能够独立直立站立为止。
10. 待小鼠恢复清醒和意识后，将其放回原笼。通常情况下，小鼠在损伤后1.5小时内可完全清醒并具备行走能力。
11. 在TBI建模后的数天内，观察小鼠的多种体征，包括呼吸模式、口鼻周围是否存在黏液，以及伤口区域是否出现红肿、渗出物或重新裂开等情况。若动物出现上述任一异常症状，则将其排除出研究。
    注意：AAV-GCaMP6s的预先微注射可借助双光子激光扫描显微镜，通过颅骨变薄窗口观察损伤皮层中神经元Ca2+稳态及兴奋性的变化¹⁵。

5. 莫里斯水迷宫（MWM）实验

注意：MWM（参见材料表）是一种广泛认可的方法，用于评估小鼠在创伤性脑损伤（TBI）后出现的空间学习和记忆缺陷。

1. 从损伤后第7天（DPI）开始进行MWM测试。MWM的圆形水池直径为120 cm，高50 cm，水温维持在25 °C。将圆形水池分为四个象限，在东北象限中放置一个直径为6 cm、高30 cm的圆形平台，平台位于水面下1 cm处。
2. 在圆形水池正上方架设摄像机，用于记录小鼠的运动轨迹。用黑色胶带在小鼠背部做标记，以利于图像采集软件识别，并用于记录潜伏期、游泳距离和运动轨迹等数据。
3. 将小鼠分别从四个象限的起始位置放入水中，每个象限测试一次，放入时使小鼠面向池壁。一旦小鼠找到平台，允许其在平台上休息10秒。若小鼠在60秒内未能找到平台，则由操作者引导其到达平台，让其在平台上休息10秒后，将其放回饲养笼中休息。
4. 每只小鼠每天进行4次获取试验。在获取试验结束后，于损伤后第12天（DPI 12）进行一次持续60秒的空间探针实验，记录小鼠穿越原平台区域的次数以及在平台所在象限停留的时间。
5. 每次试验结束后，立即用毛巾擦干小鼠或将其置于加热灯下，以维持其体温，防止在DPI 7至DPI 11期间的60秒获取试验中发生低体温。
6. 完成上述实验操作后，在损伤后第13天（DPI 13）使用戊巴比妥钠（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。经心脏灌注等渗生理盐水，随后灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）。取出脑组织进行常规苏木精-伊红（HE）染色，以评估皮层和海马整体形态学改变。HE染色方案的详细描述可参见先前发表的研究^13,15。
7. 所有实验完成后，如无需保留小鼠样本，可通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（≥100 mg/kg，i.p.）实施安乐死。在采集组织或处理尸体前，需持续监测小鼠直至其心跳完全停止且持续至少60秒。

结果

本研究中描述的方案概述了一种通过减薄颅骨窗口诱导重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）的方法，该方法解决了传统打击法TBI建模过程中开颅准备所导致的脑损伤问题。通过使用改进后的液体打击装置及该改良操作流程，实现了更高的FPI打击精度和可重复性¹³。该改良型撞击器具有多功能性，既可用于开颅也可用于不开颅的闭合性头部损伤（CHI）和液体打击损伤（FPI）建模。此外，可通过调节损伤参数（如撞击摆锤的下落角度），或在活塞杆端板上添加不同硬度的闭孔乙烯-醋酸乙烯酯泡沫垫，来调控损伤的严重程度。

改良的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型具有显著优势，例如可在不暴露皮层硬脑膜的情况下产生局灶性和弥漫性病理改变，从而最大限度地减少因脑膜暴露和/或实质直接受到流体冲击损伤（FPI）所引发的炎症反应。此外，该模型通过降低颅骨骨板厚度和形态的个体差异，获得更为可靠的损伤结果。因此，该改良rmTBI模型在模拟不同损伤程度下具有临床相关性的脑震荡后症状（PCS）相关的神经病理学改变及行为功能缺陷方面，具有良好的有效性与可重复性。特别是，该模型对于依赖动物TBI模型精确性与可重复性的创伤性脑损伤病理机制研究具有重要价值，尤其适用于轻度TBI相关机制的探索。

小鼠大脑中动脉的额侧支和尾侧吻静脉¹⁹位于颅骨变薄区域下方，可在显微镜下清晰观察。在经历两次重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）冲击（每次冲击压力约为 2.0 atm）后，所有小鼠在损伤后 0 天（0 DPI）均出现硬膜下血肿。尽管变薄的颅骨完整性似乎未受破坏，但微血管数量减少，并伴随微血管形态的改变（图 2H），这与先前报道结果一致¹⁵。至损伤后 2 天（2 DPI），血肿基本消退。死亡主要发生在小鼠处于深度麻醉状态下受到冲击时，此状态可能显著延长呼吸暂停时间。在冲击前定期通过眼睑反射和足爪回缩反射评估麻醉深度，可显著降低死亡率。影响液体冲击后死亡率的其他因素还包括小鼠品系、颅骨硬度、性别和年龄。在先前使用相同 rmTBI 方案的研究中，曾有一只 C57BL/6J 小鼠死亡¹⁵。本方案中仅使用雄性 ICR 小鼠以完整呈现全部操作流程。

人类和动物研究均表明，即使是重复性的亚震荡性头部冲击也可能导致广泛的白质微结构损伤^20,21,22，且这些损伤与认知功能下降相关^21,22。在伤后7-12天（DPI），重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）可引起空间学习和记忆功能障碍，本研究采用莫里斯水迷宫（MWM）实验范式对上述功能进行了评估。图4展示了该评估所获得的结果。

MWM中最后一次获取试验的分析显示，与对照组相比，重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠到达 submerged platform 的潜伏期显著延长（p< 0.05）。在探测试验中，rmTBI组小鼠在原平台所在象限停留时间百分比的分析显示，与对照组相比显著降低（p<0.01），表明rmTBI小鼠的空间参考学习和记忆能力下降。

本文所述方法已在先前使用C57BL/6J小鼠的研究中发表¹⁵。除莫里斯水迷宫（MWM）外，还进行了以下三种附加分析。

利用旷场实验（OFT）通过测量平均移动速度、总移动距离以及在中心区域移动距离的百分比，来评估小鼠的运动能力和探索能力。在伤后第6天（6 DPI）进行旷场实验（OFT），以评估小鼠的运动能力、探索行为和焦虑水平。实验装置尺寸为40 × 40 × 40 cm，被划分为16个区域（每个区域18 × 18 cm）。将小鼠置于装置中央，使其自由探索5分钟。记录其在中心4个区域内的移动距离、总移动距离、平均移动速度以及在边缘区域停留的时间。在5分钟观察期内，通过计算在中心区域移动距离的百分比以及在边缘区域停留的时间来评估焦虑水平。图4¹⁵显示，在伤后第6天，重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）可能并未显著影响小鼠的一般运动能力，但可引起显著的焦虑反应，并改变其探索行为。此外，改良的rmTBI模型可诱导弥漫性轴索损伤，这些损伤可通过其他行为学测试（例如本方案中所述的认知能力测试）进一步评估。

重复性轻度创伤性脑损伤（RmTBI）已被证明会损害小鼠的空间工作记忆和参考记忆，如 图5¹⁵所示。这些认知功能通过Y型迷宫实验进行评估。该实验在伤后第8天（8 DPI）进行，以检测小鼠的短期工作记忆缺陷。对于自发交替行为：使用一个丙烯酸Y型迷宫装置（高20 cm，臂长50 cm，底部宽10 cm）。将小鼠置于装置中心，允许其自由探索8分钟，并记录其进入各臂的次数。自发交替行为定义为小鼠连续进入三个不同臂组成的三联组。计算自发交替率（%）的公式为：（连续三联组数量 / 总臂进入次数减2）× 100。对于空间参考记忆，在8分钟训练期间，随机封闭Y型迷宫的一个臂。初次暴露后1小时，将小鼠重新放入迷宫，此时三个臂均开放，允许其自由探索3分钟。记录小鼠探索新开放臂与其他两个臂所用的时间。计算偏好指数，即小鼠在新开放臂中花费的时间与在所有三个臂中总探索时间的比值。

此外，我们建议在完成所有行为学测试后，通过简单的苏木精-伊红（HE）染色对脑组织的大体结构损伤进行评估（图6）¹⁵。取损伤部位前方1 mm至损伤后缘的冠状切面皮质区域，以及位于典型新月形区域（前囟：-1.7 至 -2.2 mm）的冠状切面海马区域。使用目镜网格（放大倍数400倍）在每张切片中随机选取六个视野计数神经元，并计算平均神经元数量，从而获得每个视野的数值密度（数值密度）。研究发现，重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）所影响的脑区表现出不同程度的神经元损伤¹⁵。具体而言，运动皮层的损伤程度较海马更为显著且变异范围更大。HE染色显示，正常神经元明显转变为固缩形态（图6A、B、E、F）。此外，在损伤区域可观察到细胞外基质出现特异性松解现象（图6F）。除基质松解区域外，rmTBI小鼠还在齿状回大量颗粒下层神经元以及部分皮层和CA1区神经元中表现出显著增强的嗜铬性染色，呈现更深的红色。有趣的是，这些染色模式并未伴随胞质收缩或核固缩等典型变性特征（图6C、D、G、H、K）¹⁵。上述行为学检测（WMM测试除外）和HE染色方法已在近期一篇介绍改良rmTBI模型的研究中详细描述¹⁵。

图1：改良后的FPI装置及软件界面截图。（A）改良后的FPI装置。（B）截图显示了FPI压力波形，以及上升时间、下降时间和半高全宽持续时间等实时冲击压力参数的自动测量与导出。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：ICR 小鼠改良的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型。 （A）进行正中切口以暴露手术区域。（B）在运动皮层上制作减薄颅骨窗。通过观察暴露的皮层微血管的清晰度来判断颅骨的厚度。（C）也可通过用精细注射器针头的扁平尖端轻轻探查减薄颅骨区域并评估其柔软度来验证颅骨厚度。（D）将雌性鲁尔锁接头粘附于减薄颅骨窗上。（E）使用牙科水泥固定已连接的雌性鲁尔锁接头。（F）通过检查眼睑反射和足垫回缩反射来监测麻醉深度。（G）在足垫受到夹捏刺激后出现回缩反射时，实施FPI冲击。（H）rmTBI后0天（0 DPI）减薄颅骨窗的图像。（I）使用组织粘合剂缝合头皮。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）对ICR小鼠空间参考学习与记忆的影响。（A）小鼠在第11天后（11 DPI）最后一次获取试验中的导航轨迹，（B）第12天后（12 DPI）探测试验中的空间探查路径，以及（C）小鼠在最后一次获取试验中找到平台所需的逃避时间。结果表明，rmTBI组到达隐藏平台所需时间显著长于对照组（p<0.05）。（D）在探测试验中，rmTBI组小鼠在原平台所在象限停留时间占总导航时间的百分比显著低于对照组（p<0.01）。n=8。*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比，采用非配对t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）对 C57BL/6J 小鼠运动能力、探索行为及焦虑样行为的影响。（A）对照组与 rmTBI 组小鼠在 5 分钟旷场实验（OFT）中的代表性运动轨迹。（B-E）分别汇总了小鼠在中心区域移动的距离、总移动距离、平均移动速度以及在外周区域停留时间的数据。对照组，n=13；rmTBI 组，n=12。***p<. 01，与对照组相比，采用非配对 t 检验。本图经修改自¹⁵。请点击此处查看此图的放大版本。

图5：重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）对C57BL/6J小鼠空间工作记忆和参考记忆的影响。（A, B）在Y迷宫中进行空间工作记忆和参考记忆评估期间，对照组与rmTBI小鼠运动轨迹的代表性示例。Y迷宫自发交替实验是评估啮齿类动物模型短期记忆的常用方法¹⁵。（C）在空间工作记忆评估期间，对照组与rmTBI小鼠自发交替率的汇总结果。啮齿类动物通常更倾向于探索迷宫中未曾进入的新臂，而非重新访问已探索过的臂。偏好指数根据动物在新臂中停留的时间与在所有三个臂中总停留时间的比值计算，并对指数进行分析。（D）在空间工作记忆评估期间，对照组与rmTBI小鼠偏好指数的汇总结果。对照组，n=13；rmTBI组，n=12。***p<. 01，与对照组相比，采用非配对t检验。本图经修改自¹⁵。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：对照组与C57BL/6J小鼠重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型中同侧损伤运动皮层及海马齿状回亚区HE染色的比较。（A, B）对照组小鼠不同放大倍数下的正常运动皮层；（C, D）对照组小鼠的海马区域。（E, F）rmTBI小鼠的损伤运动皮层，以及（G, H）rmTBI小鼠的海马区域。皮层和CA1区的深染神经元可能受到手术准备过程或持续性rmTBI的轻微影响；然而，与对照组小鼠的正常神经元相比，rmTBI小鼠的运动皮层中可见浅染（可能为中度损伤）和固缩（凋亡神经元）神经元。这些神经元凋亡特征包括胞质和细胞核的皱缩，并伴有明显的空泡化。值得注意的是，（E）图中的分界白线代表损伤组织与周围正常组织之间的边界。此外，DG亚区中的深染神经元（H）可能代表新生成的未成熟或成熟颗粒神经元。下方的柱状图显示了对照组与rmTBI小鼠在（I）运动皮层、海马（J）CA1区及（K）DG亚区中正常神经元与受损神经元的分布情况。对照组，n=13；rmTBI组，n=12；***p<. 001，与对照组相比，采用非配对t检验。本图经修改自¹⁵。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

创伤性脑损伤（TBI）主要分为两种类型：闭合性和穿透性，后者以颅骨和硬脑膜的破裂为特征。临床数据显示，闭合性头部损伤（CHI）比穿透性损伤更为常见^1,2。单次轻度TBI后，大多数患者会出现脑震荡后综合征（PCS）症状，这些症状通常在短期内自行缓解，但对于发展为长期后遗症的患者比例仍存在争议^23,24。因此，研究人员已将重点转向重复性CHI模型，以更好地理解多次脑震荡的累积效应²⁵，这类情况常发生于跌倒、交通事故和接触性体育运动中。这些反复的头部冲击可能导致更严重且持久的后果^26,27。通过使用重复性CHI模型，研究人员能够探索多次脑震荡可能存在的叠加或协同效应，并更深入地理解导致PCS的潜在机制。此类模型有助于开发针对性的治疗干预措施，以减轻反复头部撞击所造成的长期影响。

尽管一些闭合性头部损伤（CHI）模型通过结合线性和旋转力来模拟单次局灶性损伤和重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI），但由于颅骨骨折、颅骨形态和厚度、动物长时间呼吸暂停¹⁰等因素，以及在引入头部旋转运动时机械输入参数的变异性，这些模型可能导致反弹性损伤和损伤严重程度评估不准确⁹。活塞控制撞击法和落锤法是目前在CHI动物模型中诱导rmTBI的常用方法²⁵。活塞控制撞击法通过使用电磁或气动驱动的撞击装置，可精确且可调节地设定撞击参数，从而实现较高的撞击可重复性。然而，无论是用于暴露皮层的控制性皮层撞击（CCI）还是闭合颅骨撞击，活塞控制撞击法仍需在撞击过程中将动物头部严格固定于立体定位仪中。相比之下，落锤法所需材料简单、成本较低且易于搭建，但其代价是损伤严重程度存在一定变异性和较高波动性²⁵。

FPI 模型通常会诱导混合性的局灶性和弥漫性损伤，从而能够构建出不同程度严重性的创伤性脑损伤（TBI）。尽管该模型具有优势，但也存在潜在的局限性。与 CCI 模型类似，FPI 仍需进行开颅手术，而这种外科操作可能引发脑组织的炎症反应¹⁷。此外，即使是轻度 FPI 也常常以不同深度穿透硬脑膜，这可能在数据解释中引入混杂因素。因此，CCI 和 FPI 模型在模拟轻度 TBI 患者所表现出的临床特征方面存在一定局限性⁹。为此，我们提出了一种结合薄颅窗技术和 FPI 方法的实验方案，可用于构建更为精确的与重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）相关的闭合性头部损伤（CHI）小鼠模型。本方案的目标是尽可能贴近轻度 TBI 患者的临床特征。一个高度可重复的模型将为研究轻度 TBI 病理生理机制以及评估潜在治疗干预措施提供极为宝贵的工具。

我们关于重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）的研究结果与先前使用减薄颅骨窗进行轻度TBI研究的文献一致^28,29。例如，Ren等人在小鼠左侧顶叶联合皮层制备了厚度约为30 µm的减薄颅骨窗，并使用手术立体定位仪上直径为1 mm的钝端轻轻按压该窗口以诱导轻度TBI²⁹。他们的研究显示，损伤皮层区域的细胞死亡和活性氧（ROS）表达显著增加²⁹。为了研究rmTBI，Nguyen等人在小鼠顶叶联合皮层的减薄颅骨窗（厚度为20–40 µm）上，使用改良的撞击头（直径3 mm、厚度1.5 mm的圆形硅胶头）施加了三次控制性皮层撞击（CCI）²⁸。为保护减薄颅骨区域并维持其长期成像所需的透明度，他们在减薄颅骨窗上覆盖了一层薄的氰基丙烯酸酯胶水。三次CCI以每周一次的频率持续3周，撞击参数为速度4 m/s、深度2 mm。结果显示，经历三次CCI的小鼠表现出明显的星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化²⁸。鉴于减薄颅骨窗作为轻度TBI/rmTBI模型的应用相对较新，仍需进一步研究来探讨不同撞击技术与损伤严重程度/进展之间的关系。例如，在先前的一项研究中，我们观察到两次FPI（间隔2天）后细胞形态发生了明显变化¹⁵。与此同时，其他研究表明，对减薄颅骨窗施加一次轻柔压迫即可诱导出伴有明显细胞死亡和活性氧表达的轻度TBI²⁹，而每周一次、连续三次的CCI则导致显著的星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化²⁸。

使用所述方法构建一致的损伤模型时，应谨慎进行多个步骤。在实施减薄颅骨窗手术过程中，根据不同的靶向区域（例如，本研究聚焦于运动皮层），应将小鼠头部固定于立体定位仪中，保持水平位置，或略微向减薄颅骨窗对侧倾斜一定角度。这种特定的定位方式有助于在对应运动皮层的区域成功制作减薄颅骨窗。准确放置耳杆是该操作中最具挑战性的环节之一，需要一定的时间和练习才能掌握。在尝试减薄颅骨窗手术或诱导闭合性头部损伤（CHI）之前，必须确保颅骨处于水平状态。若颅骨位置不正确，应相应调整头部位置。由于颅骨形状和厚度不均匀，即使在同一块颅骨内，其生长也存在差异³⁰，因此在实施减薄颅骨窗手术或CHI前，调整头部定位至关重要。若未正确执行此步骤，则会增加颅骨骨折的风险，从而显著影响CHI的准确性和可重复性。有关减薄颅骨窗操作的更全面指导，请参考Guang等人的方案¹⁴。

不同研究人员根据其研究重点，对创伤性脑损伤（TBI）建模区域的选择有所不同。鉴于闭合性头部损伤（CHI）实际损伤位置存在显著差异，尽管大多数研究报道的撞击部位位于冠状缝（bregma）与人字缝（lambda）之间的中心区域，但正如一篇关于CHI动物模型的综述所指出的，建议在未来的实验研究中改变撞击位置²⁵。为了验证改进后的CHI薄颅骨损伤模型，我们建议从本方案中所述的运动皮层开始。重复性轻度TBI（rmTBI）可导致局灶性运动皮层损伤，可通过本方案中的开放场地测试（OFT）等运动功能评估方法进行简便评价。本操作过程中产生的切口需要一定时间愈合，可能引发外周免疫反应，从而为实验引入变异因素。为最大限度降低炎症、感染以及术后疼痛与不适的风险，我们建议在伤口处涂抹含有红霉素和双氯芬酸钠的外用软膏。该方法已被证明在减轻动物手术相关炎症和疼痛方面具有显著效果。

基于磨薄颅骨的液体打击模型是一种用于模拟啮齿类动物重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）的有前景方法，因为它减少了因硬脑膜暴露于液体打击损伤（FPI）所引起的常见炎症反应。该技术通过磨薄颅骨窗实现，能够有效产生不同程度的、具有临床相关性的脑震荡后综合征（PCS），为研究rmTBI的科研人员提供了一种潜在替代方案。此外，磨薄颅骨窗有助于在活体（in vivo）条件下观察大脑皮层的Ca²⁺稳态及神经元过度兴奋性¹⁵。利用该技术可加深我们对PCS在短期/中期/长期进展过程中潜在机制的理解，从而提升对其发展进程的预测能力，并推动更有效的治疗策略的开发。

材料

本文使用的材料清单

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75% 乙醇	山东协康医疗科技有限公司	220502
盐酸丁丙诺啡	天津药物研究院药业有限责任公司	H12020272	溶液，镇痛药
卡洛芬	上海古成生物科技有限公司	53716-49-7	粉末，镇痛药
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