改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

摘要

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。

摘要

轻度创伤性脑损伤是一种临床表现高度异质性的神经系统疾病。为了研究轻度创伤性脑损伤后神经病理机制并测试治疗方法，迫切需要建立具有明确病理特征且高度可重复的创伤性脑损伤（TBI）动物模型。在动物模型中完整复制TBI的全部继发性病变已被证明具有挑战性。因此，有必要提供多种TBI动物模型，以涵盖TBI患者中观察到的不同方面和严重程度。闭合性头部撞击（CHI）是制备重复性轻度TBI（rmTBI）啮齿类动物模型最常用的方法之一。然而，该方法易受多种因素影响，包括撞击方式、颅骨厚度与形状、动物呼吸暂停情况以及头部固定与支撑方式。本实验方案旨在展示一种结合减薄颅窗与液体脉冲损伤（FPI）的方法，以建立精确的与CHI相关的rmTBI小鼠模型。本方案的主要目标是尽量减少可能影响CHI和FPI建模准确性与一致性的因素，包括颅骨厚度、形状及头部支撑方式。通过采用减薄颅窗技术，可最大程度减少因开颅手术及FPI引起的潜在炎症反应，从而建立更优的小鼠模型，更好地模拟轻度TBI患者中观察到的临床特征。行为学检测及苏木精-伊红（HE）染色组织学分析结果表明，rmTBI可导致累积性损伤，引起行为学及脑组织大体形态的改变。总体而言，改进的与CHI相关的rmTBI模型为研究人员探索rmTBI中局灶性和弥漫性病理生理变化的潜在机制提供了一种有效的工具。

引言

轻度创伤性脑损伤（mild TBI），包括脑震荡和亚脑震荡，占所有创伤性脑损伤病例的大多数（>80%）¹。轻度创伤性脑损伤通常由跌倒、交通事故、暴力行为、接触性运动（如橄榄球、拳击、冰球）以及军事战斗引起^2,3。轻度创伤性脑损伤可引发一系列影响患者终生神经行为功能的神经生物学事件，并增加患神经退行性疾病的风险^4,5,6。动物模型为研究轻度创伤性脑损伤提供了高效且可控的手段，有望进一步提升对该类损伤的诊断与治疗水平。目前已开发出多种轻度创伤性脑损伤模型，例如可控性皮层冲击（CCI）、重物坠落（WD）、液体脉冲损伤（FPI）以及爆炸所致脑损伤（blast-TBI）模型^7,8。尚无单一实验模型能够完全模拟创伤性脑损伤所引起的病理复杂性^9,10。这些模型的异质性有助于揭示轻度创伤性脑损伤患者表现出的多样化临床特征，并深入探究其相关的细胞与分子机制。然而，每种动物模型均存在局限性³，这限制了当前对动物轻度创伤性脑损伤及其临床相关性的认识。

WD 模型和 CCI 模型被用于模拟临床状况，例如脑组织丢失、急性硬膜下血肿、轴突损伤、脑震荡、血脑屏障功能障碍，甚至创伤性脑损伤（TBI）后的昏迷状态^3,11,12。WD 模型通过自由落体的重物撞击硬脑膜或颅骨来诱导脑损伤。重物对完整颅骨的冲击可模拟混合性局灶性和弥漫性损伤；然而，该方法存在损伤部位准确性与可重复性差、反冲性损伤以及因颅骨骨折导致较高死亡率等问题^3,11,12。CCI 模型则利用气动驱动的金属探头直接撞击暴露的硬脑膜。与 WD 模型相比，CCI 模型具有更高的精确性和可重复性，但由于撞击头直径较小，难以产生弥漫性损伤¹¹。在 FPI 建模过程中，脑组织因冲击而短暂移位和变形。FPI 可诱导混合性局灶性和弥漫性损伤，并模拟颅内出血、脑肿胀以及 TBI 后进行性灰质损伤。然而，由于脑干损伤和长时间呼吸暂停，FPI 模型的死亡率较高^3,12。传统的 WD、CCI 和 FPI 模型所涉及的开颅手术可能导致皮质挫伤、出血性病灶、血脑屏障破坏、免疫细胞浸润、胶质细胞活化、建模时间延长以及潜在的致死性后果^3,12。

轻度创伤性脑损伤（TBI）的特征是格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale, GCS）在13至15分之间²。轻度TBI可以是局灶性的，也可以是弥漫性的，与急性损伤（如细胞稳态破坏、兴奋性毒性、葡萄糖耗竭、线粒体功能障碍、血流紊乱和轴突损伤）以及亚急性损伤（包括轴突损伤、神经炎症和胶质增生）相关^2,3。尽管在阐明TBI复杂的病理生理机制方面已取得显著进展，但轻度TBI/反复性轻度TBI（rmTBI）的潜在机制仍不明确，需要进一步研究⁹。鉴于闭合性头部损伤（CHI）是最常见的TBI类型¹²，本方案提出一种新颖的方法，利用改良的液体打击损伤（FPI）装置在颅骨变薄窗口处实施冲击，以建立更精确可控的rmTBI小鼠模型¹³。该方法通过避免开颅手术引起的损伤、因颅骨厚度和形状差异导致的定位误差以及反冲损伤，旨在克服挫伤打击（WD）、控制性皮质撞击（CCI）和FPI模型的主要缺陷。在颅骨变薄窗口上实施FPI冲击便于评估rmTBI后脑血管损伤情况，同时有助于降低某些模型中的高死亡率，从而使模型更接近TBI患者的临床特征。

方案

本方案中涉及的所有操作均在机构动物护理和使用委员会批准（浙江师范大学，许可证号：dw2019005）下进行，并符合ARRIVE指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。技术参数详见材料表。

1. 动物操作流程

1. 在温度为22-24 °C、湿度为40%-60%、12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境中饲养小鼠，并提供 随意摄取 可自由获取水和标准小鼠饲料。本实验使用25只ICR雄性小鼠（25-30 g，8周龄）。
2. 将小鼠随机分配至对照组（n=12）或重复轻度创伤性脑损伤组（rmTBI组，n=13）。为防止假手术小鼠对经历rmTBI的小鼠产生潜在攻击行为，应将两组小鼠分笼饲养。
3. 实验开始前，应让小鼠至少适应其笼具环境1周。该适应期可确保小鼠熟悉周围环境，并最大限度减少应激或焦虑对研究过程中生理或行为反应的潜在影响。

2. TBI 设备的制备

1. 使用改良的流体冲击损伤（FPI）装置在小鼠中构建重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型（参见材料表；图1A）¹³。在使用FPI装置前，应仔细检查所有连接处是否存在泄漏或裂纹，特别注意气缸与管路之间以及三通连接器与管路之间的接口。为准确测定冲击压力，在流体冲击损伤装置上冲击点位置安装了 压力传感器 ¹³。
2. 仔细检查FPI装置，确保活塞在气缸内能够平稳移动，并能有效实施冲击（图1B）。确认系统内无气泡存在。若发现气泡，使用50 mL注射器向系统中缓慢加入蒸馏水，并通过快速推动气缸杆经附近的三通连接器和/或注射器将气泡排出。
   注意：FPI系统内部由蒸馏水填充，包括气缸及相连管路。在操作前必须对装置进行校准，以确保实验结果的准确性与可靠性。

3. 薄颅骨制备

注意：动物手术和颅骨变薄制备不应在其他小鼠的视野范围内进行。颅骨变薄窗口可用于评估FPI手术后脑血管的损伤情况。

1. 按照动物中心的要求，指导实验操作人员在进行所有动物操作时穿戴无菌手术服和口罩。
2. 使用70%乙醇喷雾对实验台面、FPI设备、麻醉管路及周围台面进行消毒，然后开始实验。
3. 在手术前称量假手术组和重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）组小鼠的体重，并与实验前1周记录的体重进行比较。排除任何表现出健康状况不佳的小鼠，例如毛发粗糙、腹泻、体重减轻或精神萎靡。此外，排除体重低于20 g的小鼠，以确保其能够耐受重复性冲击。这些措施对于保障动物福利和确保实验结果的可靠性至关重要。
4. 将小鼠置于诱导室中，使用4%-5%异氟烷（以1 L/min流速通入100%氧气）麻醉3-4分钟。为保持手术期间眼睛的润滑，向动物眼部涂抹眼用润滑剂（参见材料表）。为减轻疼痛，在麻醉前20分钟于两耳之间皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，并在之后每6小时重复给药一次，持续24小时。此外，在麻醉结束时，为每只动物皮下注射一次5 mg/kg的卡洛芬。
5. 待小鼠失去翻正反射和足底回缩反射后，对其头部进行消毒。使用手术剪修剪小鼠头部毛发，并用剃毛器去除残留毛发。使用2%氯己定溶液进行三次连续消毒，每次间隔使用75%乙醇擦拭。
6. 在动物及其周围区域下方放置一次性无菌手术垫，以确保良好的无菌环境。使用精细小号手术剪沿小鼠头顶部正中线做1.5 cm切口，充分暴露手术区域（图2A）。
7. 使用非侵入性耳杆将小鼠固定于常规立体定位仪（参见材料表）中。根据拟研究的具体靶区，调整小鼠头部在立体定位仪中的位置，使其处于水平或轻微倾斜角度。清除手术区域的毛发，以避免后续发生炎症。
8. 使用常规恒温加热垫维持小鼠体温在37 °C（参见材料表）。
9. 在手术及冲击连接装置（雌性鲁尔锁接头）安装过程中，通过鼻罩持续输送2%异氟烷（由校准的挥发器调控浓度），维持小鼠麻醉状态（无足趾或尾部夹捏反应）。
10. 使用无菌生理盐水浸湿的棉签仔细清洁去薄颅骨窗周围的手术区域。
11. 使用平头微型钻头（参见材料表，图2B）和显微外科刀片，在右侧额叶运动皮层制作一个直径约2.5 mm、厚度约20 µm的去薄颅骨窗。手术位点定位于前囟前1.5 mm、中线外侧1.3-2.0 mm处（图2C）。
    1. 为防止微型钻头在制作去薄颅骨窗过程中穿透颅骨，钻磨时应间歇性地用生理盐水湿润颅骨表面。
    2. 使用细针头的扁平尖端轻柔探触去薄区域，通过触感判断其柔软程度，同时目视评估暴露的皮层微血管清晰度，以判断颅骨厚度。
    3. 为验证颅骨厚度，将无菌生理盐水滴加至去薄区域，并使用常规解剖显微镜进行目视检查（参见材料表）。该方法有助于确认颅骨是否已充分去薄。
       注意：在整个去薄颅骨准备及rmTBI建模过程中，需持续润滑小鼠眼部，防止角膜干燥。若颅骨去薄至小于15 µm，可能造成轻微皮层创伤，进而引发轻度皮层炎症¹⁴。
12. 将一个调整好的雌性鲁尔锁接头（内径2.2 mm，由19G针座改制而成，如图2D所示）固定于去薄颅骨窗位置。使用胶水和牙科水泥将鲁尔锁接头固定（图2E）。
    注意：使用胶水将雌性鲁尔锁接头固定于去薄颅骨窗周围区域时，必须彻底干燥颅骨表面，并防止粘合剂渗入窗口内部。若粘合剂进入窗口，将显著降低FPI的冲击力。

4. 与 CHI 相关的重复性轻度创伤性脑损伤建模流程

1. 采用改良的流体冲击装置，通过侧向流体冲击法诱导重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI），具体方法如先前所述^13,15。
2. 完成颅骨变薄窗口及冲击连接装置操作后，将小鼠从立体定位仪转移至冲击平台。
3. 鉴于麻醉可能影响动物在冲击后的翻正反射时间及损伤严重程度^9,16，应通过评估眼睑反射和足爪回缩反射来监测麻醉深度（图2F）。
4. 将粘附在颅骨变薄窗口上的雌性鲁尔锁接头与FPI装置导管末端的雄性鲁尔锁接头连接（图2G）。
   注意：在rmTBI建模过程中，由于冲击诱导了呼吸暂停和意识丧失，异氟烷麻醉时间会延长。
5. 使用改良装置进行两次轻度TBI（间隔48小时）。在完成颅骨变薄窗口手术并安装鲁尔锁后立即实施第一次FPI冲击。每次仅在小鼠对足爪夹捏刺激恢复回缩反射后才进行FPI冲击（图2H）。在深度麻醉的小鼠中实施FPI冲击可能导致长时间呼吸暂停甚至死亡。
   1. 实施FPI冲击时，将摆锤沿设备上的量角器提升至指定角度，并通过软件控制释放摆锤^13,15。冲击应达到2.0 ± 0.1 atm的冲击强度，符合啮齿类动物研究中已建立的方案^10,17,18。若冲击压力未在1.9–2.1 atm范围内记录到，或在FPI过程中发生颅骨骨折，则将该动物排除于后续实验之外。
   2. 对于假手术组小鼠，将其固定在装置上，但不施加冲击。
6. 冲击后立即断开鲁尔锁连接，并将小鼠转移至恒温加热垫上恢复。待小鼠恢复清醒和意识后，将其放回原笼，雌性鲁尔锁无需拆除。48小时后以相同方式实施第二次FPI冲击。
7. rmTBI后，小心移除雌性鲁尔锁和牙科水泥。使用组织粘合剂缝合头皮，并用平头镊子轻压头皮以促进粘合过程（参见材料表；图2I）。
8. 为预防炎症、感染以及缓解术后疼痛与不适，将红霉素与双氯芬酸钠软膏按1:1比例混合后涂抹于伤口处（参见材料表）。将小鼠转移至恒温加热垫上恢复。
9. 记录翻正反射持续时间，即从小鼠从立体定位仪上取下并侧卧放置于冲击平台上开始，至其能够独立直立站立为止。
10. 待小鼠恢复清醒和意识后，将其放回原笼。通常情况下，小鼠在损伤后1.5小时内可完全清醒并具备行走能力。
11. 在TBI建模后的数天内，观察小鼠的多种体征，包括呼吸模式、口鼻周围是否存在黏液，以及伤口区域是否出现红肿、渗出物或重新裂开等情况。若动物出现上述任一异常症状，则将其排除出研究。
    注意：AAV-GCaMP6s的预先微注射可借助双光子激光扫描显微镜，通过颅骨变薄窗口观察损伤皮层中神经元Ca2+稳态及兴奋性的变化¹⁵。

5. 莫里斯水迷宫（MWM）实验

注意：MWM（参见材料表）是一种广泛认可的方法，用于评估小鼠在创伤性脑损伤（TBI）后出现的空间学习和记忆缺陷。

1. 从损伤后第7天（DPI）开始进行MWM测试。MWM的圆形水池直径为120 cm，高50 cm，水温维持在25 °C。将圆形水池分为四个象限，在东北象限中放置一个直径为6 cm、高30 cm的圆形平台，平台位于水面下1 cm处。
2. 在圆形水池正上方架设摄像机，用于记录小鼠的运动轨迹。用黑色胶带在小鼠背部做标记，以利于图像采集软件识别，并用于记录潜伏期、游泳距离和运动轨迹等数据。
3. 将小鼠分别从四个象限的起始位置放入水中，每个象限测试一次，放入时使小鼠面向池壁。一旦小鼠找到平台，允许其在平台上休息10秒。若小鼠在60秒内未能找到平台，则由操作者引导其到达平台，让其在平台上休息10秒后，将其放回饲养笼中休息。
4. 每只小鼠每天进行4次获取试验。在获取试验结束后，于损伤后第12天（DPI 12）进行一次持续60秒的空间探针实验，记录小鼠穿越原平台区域的次数以及在平台所在象限停留的时间。
5. 每次试验结束后，立即用毛巾擦干小鼠或将其置于加热灯下，以维持其体温，防止在DPI 7至DPI 11期间的60秒获取试验中发生低体温。
6. 完成上述实验操作后，在损伤后第13天（DPI 13）使用戊巴比妥钠（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。经心脏灌注等渗生理盐水，随后灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）。取出脑组织进行常规苏木精-伊红（HE）染色，以评估皮层和海马整体形态学改变。HE染色方案的详细描述可参见先前发表的研究^13,15。
7. 所有实验完成后，如无需保留小鼠样本，可通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（≥100 mg/kg，i.p.）实施安乐死。在采集组织或处理尸体前，需持续监测小鼠直至其心跳完全停止且持续至少60秒。

结果

本研究中描述的方案概述了一种通过减薄颅骨窗口诱导重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）的方法，该方法解决了传统打击型TBI建模过程中开颅准备所导致的脑损伤问题。通过使用改进后的液体打击装置及该改良操作流程，实现了更高的FPI冲击精度和可重复性¹³。该改良型冲击器具有多功能性，既可用于开颅也可用于不开颅的闭合性头部损伤（CHI）和液体打击损伤（FPI）建模。此外，可通过调节损伤参数来调控损伤严重程度，例如调整冲击摆锤的下落角度，或在活塞杆端板上添加不同硬度的闭孔乙烯-醋酸乙烯酯泡沫垫片。

改良的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型具有显著优势，例如可在不暴露皮层硬脑膜的情况下产生局灶性和弥漫性病理改变，从而最大限度地减少因脑膜暴露和/或实质直接遭受流体脉冲损伤（FPI）所引发的炎症反应。此外，该模型通过减少颅骨骨厚度和形状的个体差异，可获得稳定可靠的损伤结果。因此，该改良rmTBI模型在模拟不同损伤程度下具有临床相关性的脑震荡后症状（PCS）相关的神经病理学改变及行为功能缺陷方面，具有良好的有效性与可重复性。特别是，该模型对于依赖动物...

讨论

创伤性脑损伤（TBI）主要分为两种类型：闭合性和穿透性，后者以颅骨和硬脑膜的破裂为特征。临床数据显示，闭合性头部损伤（CHI）比穿透性损伤更为常见^1,2。单次轻度TBI后，大多数患者会出现脑震荡后综合征（PCS）症状，这些症状通常在短期内自行缓解，但对于发展为长期后遗症的患者比例仍存在争议^23,24。因此，研究人员已将重点转向重复性CHI模型，以更好地理解多次脑震荡的累积效应²⁵，这类情况常发生于跌倒、交通事故和接触性体育运动中。这些反复的头部冲击可能导致更严重且持久的后果^26,27。通过使用重复性CHI模型，研究人员能够探索多次脑震荡可能存在的叠加或协同效应，并更深入地理解导致PCS的潜在机制。此类模型有助于开发针对性的治疗干预措施，以减轻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
75% 乙醇	山东协康医疗科技有限公司	220502
盐酸丁丙诺啡	天津药物研究院药业有限责任公司	H12020272	溶液，镇痛药
卡洛芬	上海古成生物科技有限公司	53716-49-7	粉末，镇痛药
葡萄糖酸氯己定	上海麦克林生化科技有限公司	18472-51-0	19%-21% 水溶液，抗菌剂
牙科水泥及溶剂套装	上海新世纪牙科材料有限公司	20220405, 3#	粉末用匹配溶剂重悬
解剖显微镜	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	77019
红霉素软膏	武汉马应龙药业集团股份有限公司	220412	抗生素
光纤冷光源	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	F-150C
平头微型钻头	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	HM31008	2 mm，钢制
FPI 装置软件	嘉兴博创生物科技有限公司	博创动物脑撞击仪 V1.0
ICR 小鼠	金华实验动物中心	Stock#2023091	25 只雄性小鼠，25-30 g，8 周龄
异氟烷	山东安特畜牧科技有限公司	2023090501
恒温加热垫	温州瑞宠宠物用品有限公司
Luer Lock 接头			使用 19G 针头接头定制
手持式微型颅骨钻	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	78001	最大转速：38,000 rpm
改良型 FPI 装置	嘉兴博创生物科技有限公司
莫里斯水迷宫	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	63031	评估小鼠空间学习和记忆能力
旷场实验装置	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	63008	评估小鼠运动能力与焦虑水平
眼科润滑剂	苏州天龙制药有限公司	SC230724B
双氯芬酸钠软膏	武汉马应龙药业集团股份有限公司	221207	非甾体抗炎药
小动物麻醉系统-增强型	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	R530IP
智能视频追踪系统	Panlab Harvard Apparatus 公司，马萨诸塞州，美国	V3.0	动物行为追踪与分析
立体定位仪	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	68043
Vetbond 组织粘合剂	3M 公司，明尼苏达州圣保罗，美国	202402AX	缝合动物伤口
Y 迷宫	深圳瑞沃德生命科学股份有限公司	63005	评估小鼠空间工作记忆