高分辨率三维全器官微生物感染断层成像

摘要

本文描述了一种能够在感染期间实现全器官范围内病原菌检测以及荧光报告基因活性定量的实验方法。

摘要

大多数感染发生在具有复杂解剖结构和局部生理状态各异的三维宿主组织中。病原体细胞在这一多样化环境中的定位显著影响其应激水平、反应、命运以及对疾病整体进展和治疗失败的贡献。然而，由于在厘米尺度的宿主器官中定位微米尺度病原体细胞存在技术困难，这一研究领域尚未得到充分探索。 µ微米级病原体细胞在厘米级宿主器官内的定位，这一研究领域尚未得到充分探索。本文提出了一种应对该挑战的方法。我们采用连续双光子断层扫描结合人工智能增强的图像分析技术，以定位单个 沙门氏菌 感染小鼠整个脾脏、肝叶及完整淋巴结中的细胞。利用荧光报告基因和 在体内 抗体给药，单个细菌的复制速率 沙门氏菌 细胞，其与特定免疫细胞的局部相互作用，以及细菌对抗生素的反应均可被确定。这些方法为在三维组织环境中对感染、预防及治疗进行全面研究开辟了途径。

引言

感染发生在具有复杂解剖结构和分区生理特性的组织中。感染组织内共存的多样化微环境可决定局部病原体亚群的命运及其对整体疾病结局的贡献。^1,2,3然而，在厘米级组织中对微生物病原体进行全面的三维定位仍然具有挑战性⁴脑及其他器官的成像是一项高度活跃的研究领域，其实验策略在不断改进⁵，但许多方法仍然缺乏亚微米级的分辨率µm 分辨率，这是识别所必需的 µ微米级细菌病原体。相比之下，连续双光子（STP）断层成像技术⁶ 可实现整个组织的自动化多色、无变形成像，具有亚微米级分辨率µm 的平面分辨率，生成完整的三维体积数据集。该方法结合使用振动切片机对组织进行重复物理切片，并利用红外光对暴露的切面进行间歇性双光子成像。STP 断层扫描已广泛用于绘制脑内细小轴突的分布图，以建立神经连接图谱^7,8,9,10.

STP 断层扫描还能利用断层扫描仪在全部感染组织中实现单个微生物病原体细胞（Salmonella、Toxoplasma）的三维定位^11,12。二次谐波生成可显示动脉周围的胶原鞘以及脾小梁等纤维带结构，从而提供解剖学背景信息。体内注射的荧光抗体可用于标记宿主细胞，揭示单个病原体细胞与中性粒细胞等浸润性免疫细胞之间的相互作用。本文描述了包括组织处理、成像、校正光照后拼接图像瓦片、三维图像堆叠以及利用机器学习工具进行分割的完整流程。该流程可获得病原体细胞及微菌落在宿主环境中的三维位置。由于分辨率限制，对微菌落内单个细胞数量的精确计数仍较困难，但可根据微菌落的总荧光强度对细胞数量进行估算。若可获得表达重组 GFP 或 YFP 的病原体，该流程可轻松适用于其他感染模型。

方案

此处所述的所有动物实验均已获得相关主管部门批准（许可证号 2239，巴塞尔州兽医局），并遵循当地指南（巴塞尔动物保护条例）和瑞士动物保护法。

1. 感染组织的制备与保存

1. 选用合适的感染模型。此处，采用10至16周龄的雄性和雌性小鼠，通过静脉注射约1,000个菌落形成单位（CFU）或5 x 10⁷ 通过圆头针进行灌胃给药以测定菌落形成单位（CFU）。适用的小鼠品系包括 BALB/c 和 C57BL/6。
   注意：该方法可轻松适用于其他宿主物种。
2. 确保病原体表达荧光蛋白，以便在未染色组织中进行识别。表达 GFP.mut2 的病原体¹³YPet¹⁴，TIMER^bac15，或 mWasabi¹⁶ 均可使用940 nm激发光进行可视化¹⁷. 沙门氏菌 表达 mCherry¹⁸ 在流式细胞术易于检测的水平¹⁹ 可使用800 nm激发光进行成像，但在感染的脾脏和肝脏中信号与背景比差，这些组织具有较强的自发荧光。
3. 确保所有荧光蛋白保留 >基于流式细胞术定量分析，中性pH条件下经多聚甲醛固定后，其荧光强度保留70%。本实验使用感染小鼠的组织，即脾脏、肝脏、淋巴结和派伊尔集合淋巴结。
4. 染色宿主细胞表面标志物 在体 通过在灌注前10分钟注射藻红蛋白（PE）标记的抗体进行染色。为标记中性粒细胞，静脉注射4 µg抗-Ly-6G-PE溶于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。为标记脾脏边缘区巨噬细胞，注射4 µg抗-CD169-PE溶于100 µL PBS中（参见 材料表).
5. 通过标准的经心脏灌注固定感染组织²⁰ 用15 mL冰冷的50 mM磷酸盐缓冲液（PB；10 mM NaH₂PO₄, 40 mM Na₂HPO₄，pH 7.4），随后加入 35 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA；固定剂）的磷酸盐缓冲液（PB）图1A).
   1. 简而言之，通过腹腔注射每千克体重100 mg的氯胺酮和每千克体重16 mg的赛拉嗪，使感染动物进入深度麻醉状态。通过确认趾夹反射消失以确保麻醉效果。
   2. 使用70%乙醇对毛发进行消毒，用无菌纸巾擦干，然后用镊子和剪刀手术打开胸腔。将一根无菌针头插入心脏左心室，用无菌剪刀剪开右心房，通过泵将第一种缓冲液随后固定液经针头、左心室及整个血管系统灌注。此过程可快速且均匀地固定所有组织，并实现安乐死。
6. 灌注后收集组织，将其置于20倍体积的4%冷多聚甲醛PB缓冲液中，在4 °C摇床上固定过夜（图1B成像适用于尺寸范围为0.05至2 cm的组织。³对于较大的组织，应切割成合适大小的片段。
7. 第二天，在室温下用 PB 缓冲液洗涤组织，每次 10 分钟，共洗 3 次，同时以 40 rpm 的速度振荡以去除 PFA。
   注意：由于多聚甲醛（PFA）具有毒性，这些步骤必须在通风橱内进行。PFA 废液应根据机构规定进行处理。
8. 去除多余的 PB 缓冲液，加入 20 倍体积的冷冻保护储存缓冲液²¹ （876 mM 蔗糖，0.25 1 mM 聚乙烯吡咯烷酮，40% (v/v) 乙二醇，溶于 50 mM PB 缓冲液）中，在 4 °C、40 rpm 振荡条件下处理样本 6–8 小时，或直至组织沉降至底部。将样本在 -20 °C 下孵育至少 3 天，以有效降低组织自发荧光¹¹样品在 -20 °C 条件下保存可使用长达 5 年。
   注意：组织下沉表明保存缓冲液已充分渗透入组织。

2. 样品包埋

1. 将组织包埋于琼脂糖块中，以便使用振动切片机进行平滑切割。通过高碘酸盐氧化预先对琼脂糖进行化学活化，随后用硼氢化物还原，以形成与组织的交联，从而在切片过程中提高稳定性。执行以下步骤。
2. 通过称取2.25 g琼脂糖并加入0.21 g NaIO₄来制备4%氧化琼脂糖。向琼脂糖和NaIO₄中加入100 mL PB缓冲液。在通风橱中室温下避光搅拌2–3小时。
   注意：关键步骤：搅拌时间不得超过3小时，否则琼脂糖将难以有效聚合。
3. 使用标准真空过滤装置配合0.2 µm滤膜回收琼脂糖。用50 mL PB缓冲液洗涤3次以去除残留的NaIO₄。将氧化后的琼脂糖重悬于50 mL PB缓冲液中。
   注意：此阶段切勿使琼脂糖融化。氧化琼脂糖可在4 °C避光条件下保存2–3周。
4. 通过向1 L水中加入19 g硼砂和3 g硼酸制备硼氢化物 溶液。搅拌至完全溶解，并用1 M NaOH调节pH至9–9.5。在通风橱内的搅拌器上将100 mL硼酸盐缓冲液加热至40 °C，加入0.2 g NaBH₄，避光搅拌15–30分钟。
   注意：硼氢化物溶液可在避光条件下室温保存数周。关键步骤：向硼酸盐缓冲液中加入NaBH₄时会产生气体，因此必须在通风橱内操作。切勿在密闭容器中进行此步骤，以免发生爆炸。
5. 在组织于冷冻保护剂中充分孵育以降低自发荧光（≥3天）后，从冷冻保存状态取出组织，去除多余的冷冻保护剂储存缓冲液，并在室温下以40 rpm振荡，用PB缓冲液洗涤3次，每次10分钟。
6. 将约20 mL氧化琼脂糖悬液（步骤1制备）在微波炉中加热融化（700 W，约30秒），冷却至可操作温度（约45 °C），然后倒入塑料模具中。
   注意：关键步骤：切勿在微波加热后立即将琼脂糖直接加至样品上，以免破坏组织。
7. 使用镊子轻轻夹起组织，并迅速将其置于琼脂糖底部中央。将模具在室温下孵育15分钟，使琼脂糖完成聚合。
8. 琼脂糖聚合完成后，用手术刀从塑料模具的四个角小心打开模具，并戴手套小心取出琼脂糖块。
9. 将样品浸入硼氢化物溶液（步骤2制备）中，在4 °C下孵育2–3小时，以启动氧化琼脂糖与组织之间的交联反应，防止切片过程中组织脱落。
   注意：关键步骤：浸入硼氢化物溶液的样品必须在4 °C避光条件下孵育。
10. 用PB缓冲液洗涤琼脂糖块2次，每次10分钟。翻转琼脂糖块使组织位于上方，然后使用数滴速干胶将其固定于磁性载玻片（背面附有两个磁铁的显微镜载玻片）上。胶水固化需10–20分钟，期间在琼脂糖上方覆盖浸有PB缓冲液的纸巾，确保样品在整个过程中保持充分水合（图1C）。

3. 切片机的准备及载物台的设置

1. 将磁性载玻片放置在断层扫描仪样品盒中心的金属位置上。
2. 用磷酸盐缓冲液（PB buffer）充满样品盒，小心地将其放置在载物台上，并拧紧左侧螺丝以固定样品盒。
   注意：切勿过度拧紧螺丝，否则会损坏塑料样品盒。
3. 将切片刀安装在切片机上，并小心移动样品位置，使其靠近并位于切片刀下方。琼脂糖块的上表面应与切片机刀片处于同一水平面。
   注意：若位置过低，将浪费切片时间；若位置过高，则首次切割时会切下过大块的样品。
4. 移动载物台，使琼脂糖块位于物镜中心，然后在断层扫描仪软件中反复点击 切片 按钮，直至获得完整覆盖整个琼脂糖块的切片图像。

4. 表面区域的分配与二维图像的获取

1. 在 x 和 y 方向上将物镜对准组织样本的中心。
2. 打开激光器软件，并在软件中启动激光器。听到滴答声后，打开激光器开关，并将波长调整至 800 nm。
   注意：激光源需要至少预热 30 分钟，理想情况下为 1 小时，之后方可进行成像。
3. 关闭显微镜柜门，关闭房间内所有光源，打开光电倍增管（PMTs）并将其电压设置为 750 V。
   注意：关键步骤：光电倍增管对光极为敏感，除非柜门已关闭且房间内所有光源均已关闭，否则请勿开启。
4. 根据说明调整断层扫描软件的协议设置，并将显微镜快门设为自动模式，V1 和 V2 的电压分别设为 20 和 3。
5. 在断层扫描软件中点击 2D 按钮，以获取样本的快照图像。
6. 当出现可见自发荧光的图像时，调节 z 向压电装置，将焦平面设定在琼脂糖块的表面。首次扫描将在表面下方 20 µm 处进行，以获取样本的稳定图像。
   1. 若未见自发荧光背景，可提高对比度直至信号显现。有时可能无可见信号（例如 由于组织上方覆盖有琼脂糖）。此时，应使用 z 向压电装置调节 z 轴，直至到达琼脂糖表面。若所需位置超出 z 向压电装置的调节范围，则可能需要手动移动物镜。
7. 找到样本表面后，连续切割多个 50 µm 的切片，并在每次切割后获取 2D 图像，以确保焦平面正确对准块面表面。

5. 寻找样品边缘并设置激光起始点

1. 根据激光扫描区域的 xy 坐标（4 个角坐标），将成像区域限定在组织上，尽量减少对周围琼脂糖块的成像。
2. 关闭光电倍增管（PMTs），将激光波长设置为 800 nm，打开激光快门。激光进入琼脂糖块的位置会以散射红光点的形式可见（图 2A、B）。
   关键步骤：操作 4 类激光器时需格外小心。此类激光可迅速损伤人体组织和眼睛。操作人员需接受专门培训，以确保安全使用该仪器。
3. 在移动载物台时利用激光光斑，按照后、右、前、左的顺序确定组织边缘的坐标。
4. 再次核对坐标，并将激光光斑定位至右前角，此位置为组织成像的默认起始点。
5. 将控制台窗口中的坐标转换为仪器可识别的区块尺寸，该尺寸由 xy 步长定义。将这些步长参数输入软件的实验方案中。关闭仪器柜门。

6. 三维扫描/切片

1. 将波长调整至 940 nm，以激发 GFP、mWasabi、YPet 和 PE。
   注意：在此波长下，激光对人眼不可见。为了增强 GFP、mWasabi 和 TIMER^bac 的绿色发射组分的信噪比，可在 PMT 2 前安装一个 510/20 nm 的窄带通滤光片，以减少绿色-黄色组织自发荧光的干扰。
2. 将显微镜快门切换至自动模式，并将快门电压设置为 V1 20、V2 1.71。
3. 在软件中调整以下三个参数：切片厚度——大多数情况下设为 50 µm；由于成像深度有限，肝脏组织应设为 30 µm。物理切片数量——决定将要成像的总组织深度，应根据需要进行设置。每个切片采集的平面数——决定 z 轴分辨率。大多数情况下使用 5 个平面（可获得 10 µm 的垂直分辨率）；肝脏组织则使用 3 个或更少的平面。
4. 设置激光增益。该参数需根据不同组织类型和扫描深度进行经验性测试。
5. 设定存储所采集图像的文件夹路径和名称，并为成像元文件提供适当的信息。
6. 仔细核对所有输入的参数值。
7. 点击 3D 镶嵌设置 以启动扫描过程（图 1D）。
8. 成像完成后，小心地从水槽中取出组织切片，并将其置于储存缓冲液中，在 -20 °C 下保存以备后续使用（图 1E；图 2C,D）。

7. 图像处理与数据分析

1. 从 Linux 计算机下载 MATLAB 脚本 https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020。将脚本复制到一个文件夹中，例如 /home/user/Program/。
   注意：为了使脚本完全正常运行，必须在 Linux 计算机上安装适用于 MATLAB 的计算机视觉工具箱附加组件以及 Fiji（或 ImageJ）。
2. 按照以下说明拼接图块图像。
   1. 将数据从断层扫描仪服务器传输至Linux计算机。
   2. 打开 MATLAB 脚本 StepOneStitchingAndArchive.m，找到包含原始数据的源文件夹。在脚本中定义源文件夹和目标文件夹。
   3. 切换到编辑器选项卡并点击 运行处理进度信息将显示在命令窗口中。处理过程包括从 Mosaic 文件读取信息、在图像拼接前生成瓦片索引，以及使用 Cidre 进行背景光照校正²² (图3）以及在不同深度获取的光学层之间的照明校正。拼接后的图像位于源文件夹中名为 stitchedImages_100 的子文件夹中。使用 tar 命令压缩原始数据以用于长期存储，并保存为文件扩展名为 tar.bz2 的单个文件（图1F).
3. 使用支持向量机进行模型训练与分割。按照以下步骤训练支持向量机并执行分割。
   注意：三个荧光通道的拼接图像分别存储在 stitchedImages_100 的三个子文件夹中（文件夹名为 1、2 和 3，分别对应红色、橙色和绿色荧光）。每个子文件夹包含来自同一通道的所有拼接图像。
   1. 预览拼接后的图像。使用 Fiji（或 ImageJ）打开每个子文件夹中相同文件名的图像。将三个通道合并为一幅彩色图像。调节各通道的亮度，直至观察到细菌和组织自发荧光的清晰信号。记录下一步所需的各通道调整后的最大强度值。
   2. 打开 MATLAB 脚本 StepTwoSegmentationAndAnalysis.m 并浏览至源文件夹。定义用于训练的源文件夹和图像名称。例如，
      sourceD = '/'
      red_name = [sourceD '1/section_020_01.tif']; green_name = [sourceD '2/section_020_01.tif'];
      ​blue_name = [sourceD '3/section_020_01.tif']；
   3. 转到编辑器选项卡并单击 运行.
   4. 将弹出一个要求输入颜色阈值的对话框，请根据之前使用Fiji进行的手动检查（步骤7.3.1）填写相应数值。
   5. 根据对话框提示选择背景区域和感兴趣区域（即细菌）。图表将显示模型的训练效果，并询问是否需要添加更多区域。继续添加更多感兴趣区域和背景区域，直至细菌能够被清晰地分割出来图4A，B).
   6. 命名并保存模型。脚本将自动加载图像并应用中值滤波器（半径为2像素）。
   7. 分割过程将自动运行，命令窗口中会显示进度信息。请关注分割的进展情况。如果该模型在其他拼接图像上的分割效果不佳，请重复模型训练过程，以纳入更多的背景和细菌区域。
   8. 要查看分割结果，请检查名为 Allpositions_filter3D.txt 的文件。该文件包含每个细菌或细菌微菌落的重心坐标及其对应的积分荧光强度图1G).
4. 使用卷积神经网络去除额外的伪影，具体方法如下所述。
   注意：对于某些细菌，使用支持向量机进行简单分割仍会包含一些成像伪影，YPet表达细菌尤其如此。基于神经网络的分割可有效去除这些伪影。图 4C）。为了使脚本完全正常运行，必须在 Windows 计算机上安装适用于 MATLAB 的计算机视觉工具箱附加组件以及 Fiji（或 ImageJ）。有关底层神经网络的详细信息，请参见： https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html
   1. 准备图像。使用 Fiji 将 tif 文件转换为具有不同亮度调整的 jpg 文件。通过人工筛选，分别鉴定至少 600 个细菌和 600 个伪影，并将这些对象的裁剪图像保存至相应文件夹中。
   2. 打开 MATLAB 脚本 CNNtestV4.m，并浏览至包含步骤 7.4.1 中物体图像的源文件。
   3. 定义用于训练的图像文件夹。例如，
      digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
      定义用于训练的图像数量，例如，numTrainFiles = 600。
   4. 转到编辑器选项卡并单击 运行训练完成后，CNN 模型文件将保存为源文件夹中的 gregnet1.mat。
   5. 定义一个包含测试图像的文件夹。例如，
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp')
      结果将保存在文件 YourFile.txt 中，该文件包含图像名称以及被分类为细菌或伪影的信息。
   6. 定义包含测试图像的文件夹。例如，
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp')
      结果将保存在文件 YourFile.txt 中，该文件包含图像名称以及被分类为细菌或伪影的信息。
5. 根据下述方法，基于单个细菌的荧光强度估算微菌落的大小。
   注意：断层扫描仪的空间分辨率不足以分辨紧密堆积的微菌落中的单个细菌细胞。然而，可根据微菌落的总荧光强度与单个细菌荧光强度的相对关系，估算每个微菌落中的细菌数量。该估算的准确性取决于细菌群体中荧光强度的均一性。
   1. 通过免疫组织化学法对断层扫描获取的切片进行染色，检测脂多糖等细菌组分，以确认STP断层成像中GFP阳性事件的身份图1H; 图5).
   2. 鉴定至少30个单个细菌，并从相应的分割结果中提取其荧光强度。以单个细菌荧光强度的中位数值作为参考值。通过将每个微菌落的总荧光强度除以单个细菌的参考强度值，计算各微菌落中的细菌数量。图1I).
6. 使用可视化软件进行三维重建，具体步骤如下所述。
   1. 图像准备
      1. 获取包含胶原蛋白的二次谐波信号的蓝色通道图像，这些信号可提供有用的解剖学参考，包括组织被膜、动脉和小梁结构。将用于细菌分割的图像作为第2个^nd 通道
      2. 将图像降采样一倍^st 在 x 轴和 y 轴方向均将图像缩小 10 倍，并将缩小后的图像保存至一个新文件夹中。在同一文件夹内创建 3 份缩小后图像的副本，副本的命名应保持原有顺序。例如：section_001_01.tif，第一个副本命名为 section_001_01-copy.tif，第二个副本命名为 section_001_01-copy-copy.tif。对来自 2 的图像也执行相同步骤^nd 通道。缩小尺寸可获得更易管理的文件大小。三重图像将使z轴方向更加平滑。
      3. 使用 Fiji 将各通道的图像合并，形成图像堆栈。点击 图像 > 堆叠 > 工具 > 堆叠分选器 > 按标签排序.
      4. 执行三维滤波。点击 过程 > 滤光片 > 3D滤光片 并将Z滤波器大小设置为6。保存图像堆栈。
   2. 按照下述方法进行三维可视化。
      1. 在 Arena 视图（默认设置）中打开可视化软件包。使用“监视文件夹”图标将文件夹添加到 Arena 视图中。双击打开在 7.6.1 节中准备好的 *.ims 或 *.tif 文件。
      2. 使用 编辑>图像属性在“显示调整”窗口中，调整不同通道的颜色表示（LUT）。
      3. 点击 高级 手动设置最小值/最大值以及伽马校正值。
         点击 通道名称 更改名称和查找表（LUTs）。
      4. 调整图像外观后，使用快照工具导出当前视图。
      5. 使用动画图标将三维数据表示为视频。使用导航指针找到一个视角/视图并进行缩放，然后点击“+ 添加”以插入关键帧。移动到另一个位置后，添加下一个关键帧。按下 红色记录 按钮以生成视频。将其保存至目标文件夹，并选择所需的文件类型（图1J).

结果

该方法可检测整只小鼠器官（如脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结和派伊尔集合淋巴结）中的单个Salmonella细胞（图5和图6）¹¹。该方法还可检测小鼠脑组织中的Toxoplasma gondii寄生虫¹²。某些感染组织（包括肝脏、派伊尔集合淋巴结和脾脏）在绿色至黄色波段具有较强的自发荧光。使用甲醛固定会进一步增强自发荧光，但该步骤对于维持组织结构是必需的。为提高在自发荧光背景下对GFP、mWasabi以及TIMER^bac绿色组分的绿色荧光信号的检测效果，可在第二通道光电倍增管（用于收集绿色荧光信号）前安装510/20 nm窄带通滤光片（可透过大部分GFP发射光，同时阻断大部分自发荧光），并将在冷冻保护液中保存固定组织3天或更长时间以降低组织自发荧光¹¹。然而，细菌细胞仍需表达每细胞至少数千个拷贝的GFP或其他荧光蛋白。另一方面，应避免荧光蛋白表达水平过高，以尽量减少可能引起毒力减弱的适应性代价²³。

通过成像后对回收的组织切片进行免疫组织化学染色，可验证组织中荧光细菌的正确分割。具体而言，使用针对细菌表面组分（如脂多糖）的抗体进行染色的结构，可与STP断层扫描获得的荧光图像进行比对对齐。图5）。需要注意的是，某些染色的 沙门氏菌 细胞缺乏荧光蛋白，因此在共聚焦显微镜和STP断层扫描中均无法检测到荧光信号。这些细胞为 沙门氏菌 由流式细胞分选及单个分选细胞的培养生长实验所证实，这些细胞已被宿主免疫系统杀死，且琼脂平板上的菌落形成单位数量与荧光细胞数量之间存在密切的相关性 沙门氏菌 通过流式细胞术确定的细胞²⁴此外，质粒丢失可能导致产生无荧光但仍有活力的细胞，这需要通过在含有和不含对应于质粒上选择标记的适当抗生素的培养基上进行涂布培养来检测。对于源自pSC101的质粒，质粒丢失 体内 罕见¹⁹对于大多数染色体整合的表达盒，例如 sifB::gfp 用于¹¹，表达的丢失无法被检测到 体内如果分割结果与免疫组织化学数据不一致，则需要修改分割流程。

STP 断层扫描的分辨率不足以分辨紧密堆积的微菌落中的单个细菌细胞。然而，微菌落的总荧光强度可用于估算沙门氏菌（Salmonella）细胞的数量。这需要使用荧光水平高度均一的荧光菌株，例如 Salmonella sifB::gfp¹¹。将所有微菌落和单个细胞的沙门氏菌（Salmonella）细胞数量估算值相加，可得到与平板计数或组织匀浆流式细胞术等替代方法一致的总细菌组织载量¹¹。由于组织需经灌注固定才能进行 STP 断层扫描，因此无法从同一组织直接进行平板计数和流式细胞术检测。相反，这些检测必须使用未经固定的额外动物样本进行。如果不同方法测得的中位细菌载量差异超过 3 倍，则可能表明荧光细菌的活力受损（在菌落形成单位较低的情况下），或部分细菌丢失了荧光报告基因构建体（在菌落形成单位较高的情况下）。此时需要进行对照实验以确定此类差异的来源。

STP 断层扫描可实现细菌细胞在感染组织三维结构中的定位。胶原的二次谐波信号可提供解剖学标志，如动脉和小梁。此外，宿主细胞可进行染色 体内 通过在灌注前注射针对表面标志物的抗体（图5 和 图6）。该染色可为组织区室及特定微环境提供额外的解剖标志，包括炎症病灶（某些细胞内标记物以及具有扩散屏障的区室，如脾脏白髓或脑组织，不易被此类方法标记） 体内 染色）。该方法揭示了脾脏白髓作为一个组织区室，能够支持长期存活 沙门氏菌 在抗菌化学治疗期间¹¹.

最后，利用表达timer^bac（一种用于报告单细胞复制速率的报告系统）的菌株，可识别并定位在组织三维结构中以中等或较慢速率复制的Salmonella^11,15。

图1：利用序列双光子（STP）断层扫描进行全器官成像的流程图。（A-B）经心灌注后取出器官，并在4 °C条件下于4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。（C-E）将器官包埋于氧化琼脂糖中并交联，随后使用STP断层扫描技术对组织进行扫描和切片，切片被收集用于后续免疫组织化学分析。（F-J）用于定量细菌数量、验证荧光标记细菌以及重建细菌三维空间分布的计算分析流程。请点击此处查看该图的高清版本。

图2：连续双光子（STP）断层扫描装置。（A）断层扫描仪，包含（B）双光子成像模块和（C）自动连续切片系统。（D）收集的组织切片，用于后续分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：图像拼接与照明校正。 采用基于正则化能量最小化的校正强度分布方法（CIDRE）进行图像拼接，并对不均匀的照明进行校正。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：分割 沙门氏菌 使用支持向量机（SVM）和卷积神经网络（CNN）表达绿色荧光蛋白（GFP）。 (A) 由支持向量机（SVM）分割的GFP信号对象的代表性图像（左）及对应的SVM分割区域图像（右）（比例尺：10 µm）。B) 分割区域的红绿蓝（RGB）值聚类分布。C非GFP物体被SVM错误识别为细菌的代表性图像（左）。CNN正确将其判断为背景（右，比例尺：10 µm）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5检测 沙门氏菌 通过断层扫描显示绿色荧光蛋白（GFP）的表达，并通过免疫组织化学确认。 同一区域经断层扫描（左）或使用抗体染色后经共聚焦显微镜成像的图像 沙门氏菌 脂多糖（右侧）。中性粒细胞（红色）经染色后显示 体内 灌注前注射PE标记的抗Ly-6G抗体。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图63D 重建与定位 沙门氏菌 在感染小鼠脾脏中。 (A5毫米厚脾脏切片的三维（3D）重建及染色 体内 灌注抗CD169抗体（红色）之前。蓝色信号代表通过二次谐波检测到的胶原。B三维图像堆栈中一个光学层面的图像，如（A）所示。该层面中各位置的 沙门氏菌 细胞或微菌落由星号标示。C3D 重建 沙门氏菌 感染肝脏中的位置（星号）。动脉根据其胶原鞘（蓝色）可见。比例尺：1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

细菌病原体所处的局部组织环境对于决定宿主局部免疫攻击、细菌适应性反应、宿主-病原体相互作用的局部结局以及抗菌化学治疗的效果，以及这些因素对整体疾病结局的个体化贡献至关重要。在厘米尺度的器官中对微米尺度的细菌进行成像一直具有挑战性。连续双光子（STP）断层成像技术能够提供足够的空间分辨率，以在完整器官中检测单个细菌细胞，并实现自动化切片与成像，同时具备足够的通量（约每天1个器官）¹¹. 虽然宿主抗原可以被染色 体内，病原体细胞应表达合适的荧光蛋白，以确保对细胞内病原体细胞进行全面检测。所得数据集（0.5-1.5 TB/器官）给数据处理和存储的IT基础设施带来了巨大挑战。

该方法包含若干关键步骤。首先，需要一种能够稳定且均一表达荧光蛋白GFP或YFP的病原菌株。理想情况下，应使用染色体整合的表达盒²⁵，以最大限度减少因质粒拷贝数变异导致的荧光异质性。荧光强度需足够，但应避免荧光蛋白过量表达，以防影响病原体的适应性²³。可通过选择合适的启动子，并精细调控核糖体结合位点²⁵或整个5'非翻译区（UTR）²⁶，以获得适当的表达水平。第二，灌注固定前应先用缓冲液进行初步冲洗，尽可能清除血液循环中的红细胞。这一步骤对脾脏和肝脏尤为重要（尽管完全清除这些器官中的红细胞较为困难）。残留的红细胞会吸收可见光谱范围内的光线，从而降低成像质量²⁷。第三，将固定后的组织保存在冷冻保护剂中至关重要，可降低组织自发荧光，尤其是在炎症组织中自发荧光较强，可能掩盖病原体细胞相对较弱的荧光信号¹¹。第四，组织与周围琼脂糖块之间的有效交联对于振动切片时组织平稳切割、防止组织从琼脂糖块中弹出至关重要。第五，必须通过正交方法独立验证荧光信号并确认其为病原体细胞，例如使用针对病原体组分（如革兰氏阴性菌的脂多糖）的抗体进行染色，并对从断层成像仪获取的切片进行共聚焦显微镜观察¹¹。某些感染组织中含有形态相似且荧光光谱重叠的自发荧光颗粒，容易被误判为病原体细胞。第六，微菌落内病原体细胞的数量应与共聚焦显微镜等正交方法进行比较，以评估定量准确性。基于这些计算所得的总体细菌载量，应通过与流式细胞术和涂布计数等正交方法的比较进行验证。

对广泛使用的STP方案的重要改进包括：在光电倍增管2前放置一个510/20 nm的窄带通滤光片¹¹，以减少绿色-黄色自发荧光的干扰，这种自发荧光在受感染和发炎的肝脏、脾脏及派伊尔斑中尤为强烈。与以脑组织为主的应用（STP的其他主要应用）相比，这些器官具有更强的自发荧光和更高的光散射特性，因而需要更有效地校正照明不均问题。作为另一项改进，本方案采用CIDRE方法²²实现该目的（图3），并结合基于人工智能的细菌分割技术。最后，通过增加在-20 °C条件下进行冷冻保护剂孵育的步骤，改变了组织预处理流程，该步骤可降低组织自发荧光，从而有助于检测荧光相对较弱的小型病原菌细胞¹¹。

如果无法检测到病原体信号，或分割结果灵敏度不足（遗漏过多病原体细胞）或精确度不足（将过多背景颗粒误判为病原体细胞），则可能需要进行故障排除。若可检测到组织自发荧光，但病原体信号过少，则病原体中可能表达的荧光蛋白含量不足。可通过共聚焦显微镜观察同一感染组织的切片或通过流式细胞术分析组织匀浆物来验证这一情况^19,28。潜在原因可能包括荧光蛋白表达水平不足或表达盒不稳定。缓解策略可包括使用其他启动子驱动表达、针对病原体物种对荧光蛋白编码基因进行密码子优化、采用具有更高拷贝数的附加体质粒构建体，或通过染色体整合或平衡致死互补系统稳定表达盒²⁹。荧光蛋白的选择也很重要，但GFP.mut2、mWasabi、YPet和TIMER^bac均可用于检测。若分割不准确，可能是由于病原体荧光信号过弱（可按上述方法解决），或组织自发荧光背景过高所致。在包埋于琼脂糖块并进行断层成像前，充分灌注洗涤液或延长储存缓冲液中的孵育时间，可能有助于解决这些问题。最后，神经网络需要足够的训练以实现精确分类，但过度训练可能导致过拟合，从而降低对新样本的分析性能。

目前，尚无其他方法能够以足够的空间分辨率对整个器官进行三维成像，从而检测单个细菌。未来在组织透明化和光片显微镜技术上的改进可能达到类似的分辨率，这或将实现更高速度的成像以及更多荧光通道的同步检测。

STP 的一个重要局限性在于其平面内像素分辨率为约 0.5 µm，垂直分辨率为 5 至 10 µm，不足以分辨位置紧密的细菌，例如在密集排列的微菌落内部。然而，可在断层扫描后回收组织切片，对选定的组织区域进行二次高分辨率共聚焦显微镜成像。STP 的另一个局限性是仅有三个荧光通道，限制了可同时成像的荧光染料数量。同样，通过对回收的组织切片采用多重检测方法进行二次分析，可以揭示更多标记物在选定组织区域中的位置和强度。这些信息可整合到由 STP 确定的周围组织的整体三维结构中。

综上所述，本方案可在局部和全器官水平上对宿主-病原体相互作用进行详细研究。该方案应易于适用于其他病原体（前提是可获得荧光标记菌株）、其他器官以及不同宿主物种。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
低熔点琼脂糖	Roth	货号 6351.5 25g
硼酸	Sigma-Aldrich	6768-500G
瞬干胶 Loctite 435	Henkel
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	P5413-1kg
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma-Aldrich	PVP-100G
硼氢化钠	Sigma-Aldrich	71321-25g
氢氧化钠	Merck	106453
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	311448-100G
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	71640-250G
磷酸二氢钠二水合物	Sigma-Aldrich	71500-1KG
四硼酸钠	Sigma-Aldrich	221732-100g
蔗糖	AppliChem	A4734,1000
Tris缓冲盐水（TBS）	Merck	T5912-1L
吐温X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
真空过滤装置 500	TPP	TPP99250
仪器设备
刀片	Campden Instruments Limited	01-01-4692
MAITAI 激光器	Spectra-Physics
可剥离塑料模具	Sigma-Aldrich	E6032-1CS
TissueCyte 1000 断层扫描仪	TissueVision
抗体/染料
DAPI	Merck	D9542-5MG
一抗
抗-LPS 抗体，Salmonella，兔源	Sifin	货号 TS 1624
抗-CD169-PE，克隆号 3D6.112	Biolegend	142403
抗-Ly-6G-PE，克隆号 1A8	Biolegend	127608
二抗	Invitrogen
鸡抗兔 Alexa 647	Invitrogen	A-21443
软件	公司	版本
Fiji	Image J	1.54g 或更高版本
MATLAB	MathWorks	2017b/2018b 或更高版本
Orchestrator（断层扫描仪配套软件）	TissueVision
三维可视化软件 Imaris	Oxford Instruments	9.9.0 或更高版本