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在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

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DOI：

10.3791/66473

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2024年3月8日

 ,  ,  ,  , 
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们采用高密度微电极阵列（HD-MEA）深入研究大规模神经元群集的计算动力学，特别是在海马体、嗅球环路以及人类神经元网络中的应用。通过捕捉时空电活动并结合计算工具，可深入了解神经元群集的复杂性。该方法有助于增进对脑功能的理解，并有望为神经系统疾病发现生物标志物和治疗方法。

摘要

大规模神经元网络及其复杂的分布式微环路对于产生感知、认知和行为至关重要，这些功能源自神经元时空活动的特定模式。由相互连接的神经元集合体所构成的功能性神经群产生的动态活动模式，能够精确计算并处理多尺度神经信息，从而驱动大脑的高级功能。为了探究产生这种复杂性的神经动力学计算原理，并研究生物过程在健康与疾病状态下对神经系统的多尺度影响，大规模同步记录技术已成为关键手段。本文采用高密度微电极阵列（HD-MEA）来研究两种神经动力学模式——海马体和嗅球神经环路 离体 小鼠脑切片及神经元网络 体外 人诱导多能干细胞（iPSCs）的细胞培养。该HD-MEA平台配备4096个微电极，能够在高时空分辨率下非侵入性地同时记录数千个神经元集合的多部位、无标记细胞外放电模式。该方法可用于表征多种全网络电生理特征，包括单/多单元放电活动模式以及局部场电位振荡。为深入分析这些多维神经数据，我们开发了多种计算工具，整合了机器学习算法、自动事件检测与分类、图论及其他高级分析方法。通过将这些计算流程与该平台相结合，我们提供了一种研究从细胞集群到神经网络的大尺度、多尺度及多模态动态的方法学。该方法有望增进我们对健康与疾病状态下复杂脑功能和认知过程的理解。秉持开放科学的理念，并深入探索大规模计算神经动力学，有望推动类脑建模、神经形态计算和神经学习算法的发展。此外，阐明大规模神经计算功能障碍及其相互关联的微环路动力学的潜在机制，可能有助于发现特异性生物标志物，为神经系统疾病的精准诊断工具和靶向治疗策略开辟新途径。

引言

神经元集合，常被称为细胞群，对神经编码至关重要，能够促进复杂计算以处理多尺度的神经信息1,2,3。这些神经元集合构成了广泛的神经网络及其精细的微环路4。此类网络及其振荡模式推动了包括感知和认知在内的高级脑功能。尽管已有大量研究探讨了特定类型的神经元和突触通路，但神经元如何协同形成细胞群，并影响跨回路与网络的时空信息处理，目前仍不清楚5。

急性， 离体 脑切片是研究完整神经回路的关键电生理工具，可提供受控环境，用于探究神经功能的振荡活动模式、突触传递和连接性，同时在药理学测试和疾病建模中具有重要应用价值6,7,8本研究方案重点介绍两个关键脑回路——参与学习与记忆过程的海马-皮层（HC）回路9,10，以及负责气味分辨的嗅球（OB）11,12,13在这两个区域，哺乳动物大脑终生通过成体神经发生持续产生新的功能性神经元。14两个回路均表现出多维的动态神经活动模式和内在可塑性，这些特性参与重构现有神经网络，并在需要时促进替代性的信息处理策略15,16.

急性， 离体 脑切片模型对于深入探究脑功能及在微环路水平上理解疾病机制至关重要。然而， 体外 源自人诱导性多能干细胞（iPSCs）神经元网络的细胞培养为转化研究提供了有前景的途径，可将动物实验的研究发现无缝衔接至潜在的人体临床治疗17,18. 这些以人为中心的 体外 检测方法为评估药理学毒性提供了可靠平台，有助于精确的药物筛选，并推动基于细胞的创新治疗策略的研究19,20认识到iPSC神经元模型的关键作用，本方案研究的第三部分致力于深入探究其衍生神经网络的功能特性，并优化相关的细胞培养方案。

这些具有电生理活性的神经模块通常采用钙离子（Ca2+成像）、膜片钳记录以及低密度微电极阵列（LD-MEA）等技术进行研究。尽管Ca2+成像能够实现单细胞水平的活动图谱绘制，但它依赖于细胞标记，且受限于时间分辨率较低以及长期记录困难等问题。LD-MEA空间精度不足，而膜片钳作为一种侵入性单点技术，操作繁琐，通常成功率较低21,22,23。为应对这些挑战并有效探测全网络范围的神经活动，大规模同步神经记录已成为理解大脑复杂性背后神经动力学计算原理及其在健康与疾病中意义的关键方法24,25。

在本 JoVE 实验方案中，我们展示了一种基于高密度微电极阵列（HD-MEA）的大规模神经记录方法，用于捕捉多种脑组织模式下的时空神经元活动，包括来自海马体和嗅球回路的神经活动 离体 小鼠脑急性切片图1A-C）和 体外 人iPSC来源的神经元网络（图1D-E），此前已由本课题组及其他同事报道26,27,28,29,30,31,32,33,34,35基于互补金属氧化物半导体（CMOS）技术的高密度微电极阵列（HD-MEA）具有片上电路和放大功能，可实现跨7 mm区域的亚毫秒级记录2 阵列大小36该非侵入性方法利用4096个微电极，以高时空分辨率同时记录数千个神经元集群的多部位、无标记细胞外放电模式，揭示局部场电位（LFPs）和多单元放电活动（MUA）的复杂动态特征26,29.

由于该方法产生的数据量巨大，因此需要一个复杂的分析框架，但这同时也带来了挑战37。我们开发了涵盖自动事件检测、分类、图论、机器学习及其他先进分析技术的计算工具（图1F）26,29,38,39。通过将高密度微电极阵列（HD-MEA）与这些分析工具相结合，构建了一种整体性研究方法，可用于探究从单个细胞集群到跨多种神经模式的更大规模神经网络的复杂动态过程。这种综合方法加深了我们对正常脑功能中计算动态的理解，并为病理状态下存在的异常提供了新的见解28。此外，该方法所获得的洞察有望推动类脑建模、神经形态计算以及神经学习算法的发展。最终，该技术有望揭示神经网络功能紊乱的核心机制，发现潜在的生物标志物，并指导针对神经系统疾病的精准诊断工具和靶向治疗策略的开发。

方案

所有实验均遵循适用的欧洲及国家法规（Tierschutzgesetz），并经当地主管部门（Landesdirektion Sachsen；25-5131/476/14）批准。

1. 离体 海马-皮层和嗅球环路的脑切片在高密度微电极阵列上的记录

  1. 实验用切片与记录溶液的配制（图2A）
    1. 实验当天，配制0.5 L高蔗糖切片溶液和1 L人工脑脊液（aCSF）记录溶液（表1A,B）。
      1. 将所有固体化学试剂加入干燥的容量瓶中，然后加入部分双蒸水（dd水）。
      2. 从1 M储备液中加入MgCl2和CaCl2，再用双蒸水定容至刻度。使用磁力搅拌器持续搅拌，直至可见固体完全溶解，约需5分钟。
    2. 使用冰点渗透压计测定高蔗糖切片溶液的渗透压为350–360 mOsm，aCSF记录溶液的渗透压为315–325 mOsm。
    3. 使用pH计测定高蔗糖切片溶液的pH值为7.3–7.4，aCSF记录溶液的pH值为7.25–7.35。开始持续通入95% O2和5% CO2混合气体（carbogen）。
    4. 在切片前至少30分钟将高蔗糖切片溶液置于冰上，并开始持续通入95% O2和5% CO2。
    5. 在通入carbogen气体10分钟后，取30 mL切片溶液加入50 mL烧杯中，放入冷冻室（-20 °C）冷冻20–30分钟，直至部分结冰。
      注：所有溶液均应每次实验前新鲜配制。此处使用的双蒸水为室温（RT）保存的经高压灭菌的超纯水。溶液配制量应根据具体研究问题进行调整。
  2. 脑片实验工作区的准备（图2A）
    1. 将实验动物带入实验室内。
      注：本方案中使用8–16周龄的C57BL/6J雌性小鼠，如先前所述26,29,32。动物运输后应至少适应环境30分钟。避免在实验当天进行远距离转运（如跨机构运输）。动物的年龄、性别和品系需根据具体研究问题确定。
    2. 在动物适应环境且高蔗糖溶液冷却期间，将所需工具放置于各自指定的工作区域（见材料表）。
    3. 准备脑片恢复与维持工作区。将脑片恢复室中加入已通入carbogen气体的aCSF记录溶液，并将其置于设定为32 °C的水浴中。整个实验过程中保持持续通入carbogen气体。
    4. 准备脑片制备工作区。安装振动切片机——将刀片装入振动切片机刀架中，并校准至正确参数（刀片行进速度：0.20 mm/s，振幅高度：95 µm，刀片角度：45°）。在振动切片机的冰盘中加入冰块，在缓冲槽中加入高蔗糖切片溶液，并开始对该槽中的溶液通入carbogen气体。
    5. 准备脑组织处理工作区。将150 mm玻璃培养皿中加入冰块，并在其内放置一个含滤纸的90 mm塑料培养皿。向塑料培养皿中加入高蔗糖切片溶液并开始通入carbogen气体。在冷却的样品板上滴加一滴超级胶水，并固定琼脂糖模具。
      注：琼脂糖模具应至少提前一天制备，使用3%琼脂糖水溶液在定制的小鼠脑模具中成型。
    6. 最后，准备脑组织提取工作区。在铝箔上覆盖一层纸巾，取出盛有高蔗糖切片溶液冰浆的50 mL烧杯，并向麻醉室中加入异氟烷。
      注：在将动物放入麻醉室前约1分钟加入麻醉剂。在断头前约2分钟，从-20 °C冰箱中取出装有30 mL高蔗糖切片溶液冰浆的50 mL烧杯。
  3. 小鼠脑组织的取出与切片
    注：整个操作过程应尽可能迅速，以避免脑组织缺氧。从断头到脑组织浸入高蔗糖切片溶液冰浆中，整个取出过程应控制在1–2分钟内。
    1. 使用适当剂量的异氟烷（0.5 mL/1 L麻醉室）对动物进行麻醉。通过足底夹捏测试判断麻醉深度；确认无足部回缩反射后方可继续操作。
    2. 将动物转移至脑组织提取工作区的纸巾上，使用手术剪迅速断头。
    3. 将虹膜剪插入脑干处，使剪刀下部紧贴颅骨外表面。沿矢状缝剪开，直至冠状缝。将虹膜剪插入眼眶，剪开额缝。使用弯头镊向下翻开颅骨两侧，充分暴露整个脑组织。
      注：使用虹膜剪和镊子时需小心，避免在剪开颅缝时刺破脑组织。
    4. 用弯头镊的钝边将脑组织滑入盛有30 mL高蔗糖切片溶液冰浆的50 mL烧杯中，静置1分钟。
    5. 将脑组织转移至脑组织处理工作区中盛有冷却且已通入carbogen气体的切片溶液的90 mm塑料培养皿中，调整脑组织方向以便放入琼脂糖模具。
    6. 在琼脂糖模具的前端滴加少量超级胶水。使用刮勺将脑组织放入模具中，确保背侧朝下，以利于水平切片。
      注：胶水在模具中的位置应根据感兴趣区域（ROI）进行调整。对于海马-皮层（HC）和嗅球（OB）切片，应确保嗅球固定良好，而脑组织两侧不接触胶水。过多胶水会影响切片质量，并在振动切片过程中导致组织撕裂。
    7. 将样品板移入缓冲槽中，调整刀片至正确角度，并升高缓冲槽高度，使刀片尽可能接近脑组织。
    8. 以0.20 mm/s的速度进行切片，切取厚度为300 µm的HC和OB组织切片，每轮切片后使用玻璃巴斯德吸管收集切片。
    9. 将切片置于盛有aCSF的恢复室中，在32 °C水浴中孵育45分钟，随后在室温下继续孵育1小时。确保切片不重叠，并完全暴露于通入carbogen气体的溶液中。
      注：务必保持所有溶液及含溶液的容器持续通入carbogen气体。可使用压力调节器以维持稳定的气体通入。

2. 体外 基于人iPSC的神经元网络在高密度微电极阵列上的研究

注意：本研究中使用的所有诱导多能干细胞（iPSC）神经元均购自商业来源（见材料表）。这些人类细胞由源自人外周血或成纤维细胞的稳定iPS细胞系分化而来。

  1. HD-MEA芯片的包被 体外 人iPSC细胞培养图2B)
    1. 将HD-MEA芯片放置在信号采集记录平台上，向储液池中加入PBS缓冲液，并在包被前对芯片进行测试。启动Brainwave软件。选择 文件 > 新建录制会话设置记录参数以具有 记录频率 50 Hz 和一个 采样频率 18 kHz/电极。更改 放大器偏移 校准芯片。参见 表 2 有关故障排除的建议。
      注意：记录频率和采样频率参数将根据数据类型和各个系统的要求而定。
    2. 对高密度微电极阵列（HD-MEAs）进行灭菌和预处理。
      1. 在生物安全柜内，用蘸有96%乙醇（EtOH）的纸巾擦拭芯片和玻璃环，然后将每个装置放入无菌的100 mm × 20 mm培养皿中，并向MEA储液池中加入70%乙醇，浸泡20分钟。
      2. 吸除乙醇，用无菌过滤的dd水清洗储液池3次。加入1 mL预处理培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2.
        注意：预处理培养基必须是基于盐溶液的，以使高密度微电极阵列（HD-MEA）表面更具亲水性。这可以包括先前配制的BrainPhys（BP）完全培养基（不 >3个月大）（表1C).
    3. 包被高密度微电极阵列（HD-MEAs）。次日，吸除预处理培养基。加入1 mL浓度为0.1 mg/mL的多聚-DL-鸟氨酸（PDLO），覆盖整个活性区域。置于37 °C培养箱中孵育过夜。
    4. 准备培养基并升温至室温。本实验方案使用来自两家商业供应商的功能性人iPSC神经元，因此不同供应商的培养基成分有所不同。其中一种方案见于(表1C、D) .
    5. 吸去 PDLO，用 dd-水洗涤 3 次 在通风橱中静置芯片干燥10分钟。
    6. 用无菌过滤的去离子水填满一个35 mm × 10 mm的培养皿，置于芯片旁边，以维持适当的湿度，防止后续步骤中接种细胞发生蒸发。
  2. 在高密度微电极阵列中培养和维持人源iPSC神经元图2B)
    1. 解冻细胞并稀释至所需浓度（例如，1000 个细胞/µL，以便在 HD-MEA 上 50 µL 液滴中获得 50,000 个细胞的密度）表 1C).
    2. 使用高浓度层粘连蛋白点样培养基，将细胞悬液移液至芯片活性区域表面表 1D).
    3. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 45–60 分钟。
    4. 轻轻向HD-MEA储液池中加入2 mL培养基（表 1C).
    5. 接种后第1天（DIV1）使用RT培养基进行100%换液表 1C）。每3-4天更换50%的培养基。将HD-MEA置于37 °C、5% CO₂条件下持续培养。2 在整个实验过程中。
      注意：移液时动作要轻柔，避免使细胞脱落。检查培养基颜色，观察是否存在污染。培养基更换的间隔时间和更换量可根据具体研究问题或细胞的需求/特性来确定。
    6. 可选：在 DIV4 至 DIV8 期间，使用直立式微分干涉差（DIC）显微镜观察细胞培养生长情况，观察前需用适当方法清洁载物台 >70% EtOH

3. 离体 和 体外 使用高密度微电极阵列进行大规模神经记录

  1. 脑片记录工作区的准备（图2A)
    1. 脑片恢复期间，将所需工具放置于各个指定的工作区域（参见 材料表).
      注意：主要系统设置必须在脑片实验日前充分优化和测试。灌流系统（输入管路、泵输出管路、管子和接地）需使用PBS或人工脑脊液（aCSF）在记录平台上连接高密度微电极阵列（HD-MEA）进行测试，以确保信号干净、信噪比提高且无灌流噪声。
    2. 用 0.1 mg/mL 的 PDLO 包被 HD-MEA 芯片以增强组织-芯片耦合，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。
    3. 芯片孵育期间，使用记录用人工脑脊液（aCSF）填充重力驱动灌流系统及管路。确保灌流系统持续通入碳氧混合气体（carbogen）。设定流速为4.5 mL/min，温度为37 °C。
    4. 将HD-MEA芯片放置在信号采集记录平台上，向储液池中加入aCSF，测试灌流系统，并排除任何残留的系统噪声。
      1. 启动 Brainwave 软件。选择 文件 > 新建录制会话设置记录参数以具有 记录频率 1 Hz 和一个 采样频率 14 kHz/电极。更改 放大器偏移 校准芯片。参见 表2 有关故障排除的建议。
        注意：记录频率和采样频率参数将根据数据类型和各个系统的要求而定。
    5. 确保通过房间照明系统或在光学平台上使用遮光笼来使记录区域保持黑暗。
    6. 将体视显微镜与HD-MEA芯片的储液区及活性区域对齐，以进行图像采集。
    7. 将锚定物置于芯片储液池中以达到平衡。
      注意：Anchor 是一种定制的铂金丝网，导线极少，以促进氧气交换；但目前也有一些商用产品可供选择。
    8. 将药理学化合物加入相应的灌流管中。
      注意：在本方案中，自发性记录和100 µM 4-氨基吡啶（4-AP）药理学诱导记录均按先前所述方法获得。药理学化合物可根据具体研究问题进行调整。
    9. 在脑切片制备工作区，将一个新的90 mm塑料培养皿放入150 mm玻璃培养皿中。加入aCSF并开始通入碳酰气。
  2. 使用高密度微电极阵列对耳蜗核和嗅球脑片进行全回路记录
    注意：应尽快完成切片耦合，以避免切片缺氧。从将显微解剖的切片放置到芯片活性区域开始，至最终灌注系统启动为止，整个耦合过程应仅需约1分钟。
    1. 用玻璃移液管将脑片从脑片恢复室中取出，放入持续通入碳氧混合气的90 mm塑料培养皿中。使用显微解剖工具分离海马体或 从周围脑片组织中分离出OB。
    2. 用玻璃移液管将分离的耳蜗（HC）或嗅球（OB）急性切片转移至高密度微电极阵列（HD-MEA）储液池中。使用细刷轻轻将切片对齐至微电极阵列（MEA）的活性区域。利用抽吸系统吸除高密度微电极阵列（HD-MEA）芯片孔中的全部溶液。
    3. 使用镊子将锚轻轻放置在切片上。
      注意：应避免切片移动来放置锚点，以防止耦合丢失。
    4. 轻轻将溶液加入芯片储液池，并启动灌注系统。
      注意：为获得最佳记录参数，需确保灌注入口和泵出口的层流流动。
    5. 确保通过房间照明系统或在光学平台装置上使用遮光笼，使记录区域光线足够昏暗。
    6. 让切片适应10分钟，然后再开始记录或进行额外的药理学干预。
    7. 启动 Brainwave 软件。选择 文件 > 新建录制会话设置记录参数以具有 记录频率 1 Hz 和一个 采样频率 14 kHz/电极。更改 放大器偏移 校准芯片。
      注意：如第 3.1.4.1 节中先前所述，在进行系统测试时，务必应用相同的记录参数。
    8. 按压 记录 使用预设的实验条件开始数据采集。
    9. 在最后一次记录结束后，立即对急性脑片进行光学成像。将脑片移回切片恢复室，用刷子清除芯片上附着的任何有机物质，然后继续处理下一片脑片。按照第3.4节所述方法清洗高密度微电极阵列（HD-MEAs）。
  3. 人源iPSC记录工作区的准备及在高密度微电极阵列上的全网记录图2B)
    注意：在记录人iPSC的前一天或记录后立即更换培养基（表 1C）。在使用功能性神经元的研究中，每4天更换一次培养基，并在第4、8、16和24天体外培养日（DIV）时，在iPSC记录完成后立即更换培养基。
    1. 通过使用无菌操作清洁高密度微电极阵列（HD-MEA）信号采集平台，确保工作环境的无菌性 >70% EtOH
    2. 在通风橱内，轻轻将带有参照标记的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底盖放置在高密度微电极阵列（HD-MEA）环上。将HD-MEA芯片转移至iPSC记录工作区，并将其连接至数据采集平台。
    3. 确保通过房间照明系统或在光学平台上使用遮光笼来适当调暗记录区域。
    4. 在开始记录或进行额外的药理学调节之前，让高密度微电极阵列（HD-MEA）芯片平衡10分钟。
    5. 启动 Brainwave 软件。选择 文件 > 新建录制会话. 将记录参数设置为 记录频率 50 Hz 和一个 采样频率 18 kHz/电极。更改 放大器偏移 校准芯片。
      注意：如第 2.1.1 节所述，在进行包被和镀膜前的系统测试时，务必使用相同的记录参数。
    6. 记录 实验计划中每一天（即4、8、16、24 DIV）人iPSC神经网络的自发性放电活动或药物诱导反应。
      ​注意：切勿让芯片在孵育箱外停留过久 >30 分钟，以维持稳定的温度和湿度，防止细胞受到温度骤变的影响。
    7. 将HD-MEAs置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在实验过程中。
    8. 实验结束后，按照步骤3.4所述，对芯片上的神经网络进行固定并染色以进行进一步光学成像，或直接清洗高密度微电极阵列（HD-MEAs）。
  4. 高密度微电极阵列芯片的清洗
    1. 实验结束后，按照正确的废液处理方法丢弃溶液，并用dd水冲洗。
    2. 加入选定的去垢剂，用棉签清洁工作区域和整个储液槽，然后弃去去垢剂。重新加入去垢剂，孵育20分钟，随后弃去去垢剂。
    3. 用实验级水彻底冲洗，然后用dd水冲洗3-4次。
    4. 使用气压彻底干燥高密度微电极阵列（HD-MEA）芯片。

基于高密度微电极阵列的大规模神经记录分析

注意：虽然步骤 4.1 特定于 Brainwave 软件，但步骤 4.2 可根据每位用户所使用的商用高密度微电极阵列（HD-MEA）设备类型进行调整。

  1. 原始数据预处理与事件检测
    1. 在 Brainwave 软件中打开一个已记录的原始数据文件（.brw）。选择 分析 > 局部场电位检测 或 尖峰检测.
      注意：局部场电位检测采用具有4 Hz低通的IIR滤波th 四阶巴特沃斯滤波器（1-100 Hz）。硬阈值算法包括150 µV的高阈值、-150 µV的低阈值、70-120 ms的能量时间窗、10 ms的不应期以及最长事件持续时间为1 s。单单位和多单位放电检测采用IIR滤波，高通截止频率为4th 八阶巴特沃斯滤波器（300-3500 Hz）。应用PTSD算法，标准差因子为8，峰寿命周期为2 ms，不应期为1 ms。
    2. 对于HC和OB环路记录，添加 高级工作区 在检测到的事件文件（.bxr）中选择导入从体视显微镜捕获的结构光图像。在研究大规模海马体（HC）环路时，创建包含齿状回（DG）、门区（hilar region）、阿蒙角1区（CA1）、阿蒙角3区（CA3）、内嗅皮层（EC）和围嗅皮层（PC）的结构层。在研究大规模嗅球（OB）环路时，创建包含嗅神经层（ONL）、嗅小球层（GL）、外丛状层（EPL）、僧帽细胞层（MCL）和颗粒细胞层（GCL）的结构层。将EPL和MCL视为投射层（PL），并包括嗅皮层（OCx）。
  2. 使用自定义 Python 计算流程进行数据处理
    1. 去噪
      1. 使用自定义编写的 Python 脚本读取 .bxr 文件26,29,32 以及 h5py 3.6.0 Python 软件包。
      2. 提取与iPSC神经网络记录相关的脉冲序列，以及与海马和嗅球脑片电路记录相关的局部场电位事件序列。
      3. 将活动电极总数少于平均事件中平均活动电极数的0.1%或10%，或检测到的事件超出统计学上合理放电频率范围的事件判定为随机事件并予以剔除。此外，应用振幅和事件持续时间的阈值进行筛选。
        注意：放电频率范围设定为0.1–15 spikes/s，LFP事件频率范围为0.1–60次/分钟。这些是针对所分析数据集采用的示例性频率阈值。实际的频率、幅度和持续时间阈值将根据具体数据而定。
      4. 将结果事件序列数据及其伴随的时空信息以 .npy 文件格式保存。
    2. Rastergrams
      1. 读取经过滤的事件 .npy 和 .bxr 文件，并使用 Matplotlib 的 pyplot 函数生成点阵图（https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html）。
      2. 此外，对于具有层特异性的脑片记录，根据步骤 4.1.2 中产生的层对电极 ID 进行分类和分组。
    3. 平均放电活动
      1. 处理来自 .bxr 文件的时间序列数据，计算每个电极的平均放电率（事件数量/记录时间）。
      2. 构建一个数据矩阵，其中行和列表示高密度微电极阵列（HD-MEA 64 × 64）中电极的坐标，每个矩阵值代表平均放电率。
      3. 使用 Python 中的绘图库，例如 Matplotlib 的 imshow 函数或 Seaborn 的 heatmap 函数。
      4. 使用“hot”颜色映射，生成一幅信息丰富的热图，直观呈现电极阵列上平均放电率的空间分布。
    4. 代表性波形轨迹
      1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并使用 Matplotlib pyplot 函数生成波形轨迹。（https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html）
      2. 输入所需的电极编号、时间窗和代表性波形轨迹的频段。本分析中定义的频段包括低频局部场电位振荡（1-100 Hz），经带通滤波后分为δ、θ、β和γ频段；尖波涟漪（SWR）（140-220 Hz）；以及高频单单位放电和多单位放电活动（MUA）（300-3500 Hz）。其中，δ、θ、β和γ频段分别为1-4 Hz、5-12 Hz、13-35 Hz和35-100 Hz。
    5. 功率谱密度
      1. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并计算周期图以识别各时间序列中振荡活动的主导频率。
      2. 构建频率-时间动态的伪彩色频谱图。
        注意：通过使用快速傅里叶变换对记录的局部场电位（LFP）进行频谱功率密度估计，采用Welch法计算频谱41.
      3. 输入所需的电极编号、时间窗和频段以生成谱密度图。本分析中定义的频段包括步骤 4.2.4 中描述的频段。
    6. 功能连接性
      1. 进行脑片电路记录时，遵循步骤 4.2.6.2–4.2.6.4。
      2. 从 .brw 文件中读取时间序列数据，并利用皮尔逊相关系数（PCC）计算 64 × 64 电极阵列中每对活跃电极之间的互协方差42.
      3. 使用多元格兰杰因果关系法，对时间序列拟合向量自回归模型，以量化一个时间序列对另一个时间序列的影响。
      4. 应用有向传递函数（DTF）评估相关连接中的方向性信息流。
        注意：多层网络中的功能连接是通过设定相关性阈值来建立的，该阈值基于所有互协方差值的均值加两个标准差以上的相关系数。43,44.
      5. 对于iPSC记录，遵循步骤4.2.6.6-4.2.6.8。
      6. 从 .bxr 文件中读取脉冲序列数据，并使用 spike_train_correlation 函数（https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html）计算所有分箱后脉冲序列组合之间的皮尔逊相关系数（PCC），生成一个 64×64 的相关系数矩阵。
        注意：多层网络中的功能连接是通过设定相关性阈值来建立的，该阈值基于所有互协方差值的均值加两个标准差以上的相关系数。
      7. 此外，对连接矩阵实施时空滤波（STF）和距离依赖性潜伏期阈值（DdLT）过滤步骤，以剔除超出最大传播速度（设定为 400 mm/s）的潜在成对连接45.
      8. 利用滤波和归一化的互相关直方图（FNCCH）算法，通过对所得互相关矩阵进行滤波和阈值处理，提取负向峰以识别抑制性连接45.
      9. 将每个连接矩阵转换为动态图（.gexf）文件。
    7. 网络连接图谱
      1. 开放 数据实验室 在 Gephi 程序 9.2 版本（https://gephi.org）中 用于动态图绘制特定的时间区间。
      2. 应用 地理布局 在空间映射的布局窗口中。
      3. 设置参数约束 学位范围 和 边权重 用于比较。
      4. 分配 节点颜色，边大小 和 度大小 为了更清晰地观察。

结果

多模态时空映射与振荡性放电特征提取
为了量化由动态神经元集合产生的全网络LFP和脉冲事件，我们研究了海马体（HC）和嗅球（OB）回路以及人源iPSC神经网络中的同步大规模放电模式。对步骤3.2中记录的脑片回路和步骤3.3中记录的iPSC神经网络，依据本方案的步骤4.1–4.2进行分析。首先，对所有记录的数据集进行事件检测与去噪处理，并根据各回路的区域特性进行空间分辨。随后，绘制平均大规模LFP和脉冲放电模式的拓扑伪彩色空间图、已检测事件的点阵图，以及滤波后波形的代表性5秒轨迹图图3A-I). 将大规模局部场电位（LFP）和脉冲放电率模式的地形伪彩色图叠加在显微镜拍摄的海马体（HC）光学图像上图3A)，OB（图3B）以及人iPSC神经元网络（图 3C）。这使得能够研究单个环路及基于网络的振荡模式和响应。HC和OB的点阵图包含了在60秒时间窗内，按HC环路的DG、Hilus、CA3、CA1、EC和PC层以及OB网络的ONL、OCx、GL、PL和GCL层分类记录的LFP事件检测次数。图3D,E）。人类诱导多能干细胞（iPSC）栅格图显示了互连培养网络在20秒时间窗内同步记录到的尖峰事件图3G）。接下来，来自大规模高密度微电极阵列（HD-MEA）记录位点的5秒代表性事件轨迹显示了海马体（HC）中记录到的多种振荡频率（即CA3区选定电极）图3G) 和 OB（即 GL 中选定的电极）(图 3H）神经回路及来自阵列中四个选定有源电极的人类iPSC神经网络的多单元簇状放电活动图 3I）。这些典型信号展示了生物信号特征，包括低频局部场电位振荡（1-100 Hz），经带通滤波的δ、θ、β和γ频段；尖波涟漪（SWR）（140-220 Hz）；以及高频的单单位放电和多单位放电活动（MUA）（300-3500 Hz）。最后，采用功率谱密度（PSD）分析，对从高密度微电极阵列（HD-MEA）记录的海马（HC）与嗅球（OB）相互连接回路中特定振荡频段的功率强度进行同步量化。 (图3J,K).

多模态全网络功能连接组
为了从同时活跃的神经元集合的同步放电模式中推断多层神经网络的大尺度连接性，根据方案第4.2.6步计算了检测事件中活跃电极对之间的互协方差。在此，相关系数依据海马体（HC）和嗅球（OB）回路中的层次进行排序，而在诱导多能干细胞（iPSC）网络中则不进行排序，随后存储于一个对称矩阵中。通过应用多元格兰杰因果性分析和有向传递函数（DTF）来量化一个时间序列对另一个时间序列的影响，并评估不同网络中相关连接内的定向信息流，从而生成HC和OB回路的功能连接组图谱。HC（图4A）和OB（图4B）的连接组映射及网络可视化使用Gephi程序9.2版本（https://gephi.org）完成。为比较HC和OB脑片回路，在功能连接上施加了类似的参数约束，并展示了检测到的局部场电位（LFP）事件100秒内的功能连接性。节点根据其度强度进行缩放，节点颜色表示所在层次，连接线颜色用于区分层内和层间连接。人类iPSC网络的功能连接组通过应用时空滤波器（STF）和距离依赖性潜伏期阈值（DdLT）生成，以增强显著连接的选择，并通过滤波和归一化的互相关直方图（FNCCH）分析进一步优化有意义连接的识别。在全高密度微电极阵列（HD-MEA）芯片上的人类iPSC网络连接组映射（图4C）可视化亦使用Gephi完成。节点颜色表示兴奋性或抑制性输入，连接线颜色标识连接关系。

多模态生物杂化神经电子平台示意图；神经回路、光学成像、数据分析。
图 1：基于大规模高密度微电极阵列（HD-MEA）的实验与计算平台概览。 （A）我们采用基于CMOS的高密度微电极阵列（HD-MEA）构建的多模态生物杂化神经电子平台的等轴测示意图，用于记录海马体（HC）、嗅球（OB）以及人诱导多能干细胞（iPSC）来源神经回路和网络的神经动态。 （B）小鼠脑切片及其工作流程示意图，用于获取海马体（HC）和嗅球（OB）脑片。 （C）大规模放电模式的拓扑图，显示同时记录的整个海马体（HC）和嗅球（OB）脑片的放电活动，并与提取的细胞外动作电位波形叠加于脑片的光学图像上。 （D）来源于人类的诱导多能干细胞（iPSC）神经元网络的示意图。 （E）荧光显微图像，显示位于HD-MEA芯片上整个人类神经元网络中细胞核c-fos表达以及胞体/树突MAP-2标记（左图），并与全网平均放电活动图匹配（右图）。 （F）计算框架，包含先进的数据分析、连接性图谱绘制以及人工智能/机器学习工具，用于分析从大规模HD-MEA记录中获得的多维神经数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

在高密度微电极阵列上进行脑片离体实验，用于神经网络记录与成像的装置设置。
图2：布局用于 离体 脑切片和 体外 人iPSC培养准备与记录工作区 (A) 示意图显示了制备HC和OB脑片的实验流程，包括各工作区所需的工具和设备。 (B人iPSC培养制备的示意图，包括所需的工具和设备。完整的材料清单见步骤1.2.2、2.1、2.2、3.1.1、3.3及后续部分 材料表. 请点击此处以查看此图的放大版本。

海马-嗅觉环路；神经元活动热图；脉冲图；频谱数据。
图 3：绘制并提取网络动态的时空模式。 （A-C）基于五分钟记录数据计算得到的平均局部场电位（LFP）和脉冲频率空间图，叠加于显微镜明场图像之上。 （D-F）栅格图，显示在60秒数据子样本中检测到并去噪后的LFP事件，以及在20秒数据子样本中的脉冲。 （G-I）从栅格图数据子样本中一个5秒片段（在栅格图中以红色高亮标出）提取的代表性波形轨迹，显示为原始LFP振荡频带（1-100 Hz）；包括δ（1-4 Hz）、θ（5-12 Hz）、β（13-35 Hz）和γ（35-100 Hz）频带；尖波涟漪（SWR，140-220 Hz）；以及高频单单位和多单位活动（MUA）脉冲（300-3500 Hz）。 （J,K）快速与慢速振荡LFP（1-100 Hz）及SWR（140-220 Hz）的功率谱密度图。 请点击此处查看该图的放大版本。

海马体、嗅球和iPSC神经元网络示意图；神经回路图及连接性。
图4：多模态全网络功能连接组的组织结构。（A-C） Gephi图谱展示节点功能连接性，其中节点对应于下方示例颜色条图例（下方），连接线（或边）的颜色则与所连接的节点匹配。图（A）海马体（HC）、（B）嗅球（OB）和（C）诱导多能干细胞来源神经元（iPSC）层的示例图例显示在一个64 × 64阵列上。为便于可视化，HC和OB层的数据在100秒的时间窗口内进行绘制，以有效减少可见节点和连接的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：脑片制备用溶液及iPSC神经元培养基质。（A）用于离体脑片制备的高蔗糖切割溶液。（B）用于离体脑片制备与记录的aCSF记录溶液。（C–D）人神经元iPSC培养基质方案，其中（C）为BrainPhys完全培养基，用于细胞复苏、HD-MEA芯片包被及培养中HD-MEA的维持；（D）为用于HD-MEA细胞铺板的点样培养基。请点击此处下载该表格。

表2：常见高密度微电极阵列（HD-MEA）记录采集问题的故障排除。 列出了与高密度微电极阵列芯片、记录平台、系统噪声及软件相关的常见问题、可能原因及相应的故障排除解决方案。请点击此处下载该表格。

讨论

由相互连接的神经元群体所产生的时空神经元活动的复杂动态，长期以来一直是神经科学领域引人关注的研究课题。传统的研究方法，如膜片钳、标准多电极阵列（MEA）和钙离子（Ca2+）成像，已为揭示大脑的复杂性提供了宝贵的见解。然而，这些方法往往难以全面捕捉整个神经网络范围内的计算动态21,22,23。本 JoVE 研究中详述的高密度多电极阵列（HD-MEA）平台的技术操作流程代表了重大进步，能够从细胞集群到大规模神经网络（即急性离体小鼠脑片以及体外人诱导多能干细胞神经网络）等多种模型中，全景式地观测神经动态26,29,30,32。

急性， 离体 小鼠脑切片一直是神经元研究中的基础工具，有助于在分子和神经环路水平上开展研究6,7然而，维持组织活性的难题一直是该领域持续存在的瓶颈。本研究中详述的方案引入了若干关键性改进，以优化脑片的质量与存活时间，从而充分发挥其在高密度微电极阵列（HD-MEA）平台上的优势。该方案强调了以下要点：i）实现脑片的均一性，推荐使用振动切片机（vibratome）而非组织切片器（tissue chopper），因其具有更高的精度并可最大限度减少组织损伤，尽管切割时间相对较长；ii）从组织提取到记录全过程持续通入碳氧混合气（carbogen），以维持组织活性；iii）严格调控温度，并在记录前给予充分的恢复时间；iv）使用琼脂糖块或模具固定脑组织，以防止撕裂并减少胶水接触面积；v）在HD-MEA储液池中维持适宜流速的碳酸化人工脑脊液（carbogenated aCSF），以保障脑片健康，同时避免去耦合、噪声和信号漂移等问题。表 2).

对于小鼠脑切片和人源iPSC样本，增强电极与组织界面的耦合至关重要30,46,47。本方案强调使用促进黏附的分子聚-DL-鸟氨酸（Poly-dl-ornithine, PDLO）的重要性。该分子不仅能增大用于检测电信号的表面积，还可提高电导率46。通过这种方式，PDLO促进细胞黏附、生长以及功能性神经网络特性的形成。此类优化在提升高密度微电极阵列（HD-MEA）平台效能方面发挥关键作用，从而确保对微尺度ex-vivo和in-vitro连接组及其时空放电序列进行准确且一致的分析。值得注意的是，已有研究表明，PDLO在促进神经元培养物的自发性放电活动以及对电刺激的响应能力方面优于其他基质材料，如聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）和聚-L-鸟氨酸（poly-l-ornithine, PLO）。此外，PDLO已被用于HD-MEA表面的功能化修饰，可增强电极与脑切片之间的界面耦合，提高嗅球（OB）和海马体（HC）切片记录中的信噪比26,29。通过添加定制的铂金锚定装置，可进一步增强电极与脑切片之间的界面耦合，从而获得更高信噪比的记录结果。

利用高密度微电极阵列（HD-MEA）进行两者 离体 小鼠脑切片和 体外 人类诱导多能干细胞网络引入了一种擅长探索广泛、多尺度和多模态动态的方法。然而，这种创新方法也带来了相当大的挑战，尤其是在数据管理方面48,49,50,51单次高密度微电极阵列（HD-MEA）记录以每电极18 kHz的采样频率运行，可产生高达155 MB/s的数据量。当涉及多个脑片、不同药理条件或长时间记录时，数据量迅速增长。如此庞大的信息流对强大的存储基础设施和先进的计算工具提出了迫切需求，以实现高效的数据处理。HD-MEA平台能够同时采集数千个神经元集合的信号，这一优势既是突破，也带来挑战。它为揭示大脑功能的计算动态提供了前所未有的洞察力，但也要求建立更为精细的分析框架。在本JoVE实验方案中，我们展示了大规模事件检测、分类、图论分析、频域分析及机器学习等计算策略的应用实例。这些方法体现了科研人员为应对复杂神经数据解析难题所付出的持续努力。然而，针对此类多维神经数据集，仍需进一步开发更先进的计算分析工具。借助恰当的技术手段与方法体系，HD-MEA平台的潜力将被显著放大，为深入理解健康与疾病状态下大脑功能的复杂机制提供重要支持。

本质上，当高密度微电极阵列（HD-MEA）平台与本文讨论的详细实验方案及计算工具相结合时，为理解大脑复杂的运作机制提供了一种变革性的方法。通过捕捉大规模、多尺度和多模态的动态活动，该平台为学习、记忆和信息处理等过程提供了宝贵的见解。此外，其在体外人源诱导多能干细胞（iPSC）神经网络中的应用有望彻底改变药物筛选和个性化医疗。然而，尽管该平台代表了神经科学研究的重大进步，仍必须认识到并解决其固有的技术挑战。随着持续的优化以及先进计算工具的整合，HD-MEA平台有望 usher in 一个精准诊断工具、特异性生物标志物识别以及神经系统疾病靶向治疗的新时代。

披露

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

致谢

本研究得到了德国神经退行性疾病中心（DZNE）机构资金、亥姆霍兹协会亥姆霍兹验证基金（HVF-0102）以及德累斯顿国际生物医学与生物工程研究生院（DIGS-BB）的支持。我们还要感谢DZNE德累斯顿行为动物测试平台（Alexander Garthe、Anne Karasinsky、Sandra Günther 和 Jens Bergmann）提供的支持。我们谨此说明，图1的部分内容使用了BioRender.com平台绘制。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
150 毫米玻璃培养皿通用的通用的脑组织准备工作站，脑切片记录工作站
0.22 μm 无菌滤器单元 混合混合各种
90 mm 塑料培养皿TPP93100脑组织准备工作站，脑切片记录工作站
琼脂糖Roth6351.5脑组织制备工作区
琼脂糖模具定制定制脑组织制备工作区；定制设计的3D打印机，可根据需求提供
铝箔通用的通用的脑提取工作区
麻醉室通用的通用脑提取工作区；各种烧杯、垫料等
抗坏血酸Sigma AldrichA4544-25G溶液配制工作区
各种烧杯通用通用的溶液配制工作区；50 mL
各种鲁尔接头Cole Parmer45511-00脑片记录工作站
各种规格的容量瓶通用的通用的溶液配制工作区；500 mL，1 L
B27 补充剂Life Technologies17504-044BrainXell 商业供应商操作规程
BDNFPeprotech450-02BrainXell 商业供应商方案
带有紫外灯的生物安全柜各种各种高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作区
BrainPhys神经元培养基 STEMCELL Technologies 05790 CDI 和 BrainXell 商业供应商方案
脑电波软件3Brain AG版本 4脑切片与人源iPSC记录工作站
BrainXell 谷氨酸能神经元检测 BrainXell BX-0300 BrainXell 商业供应商方案
CaCl2Sigma Aldrich21115-100ML溶液配制工作区
碳合气通用的通用的所有工作区；95% O₂/5% CO₂2 和 CO2 混合物
细胞培养箱 各种各种各种
基于CMOS的高密度微电极阵列芯片3Brain AG定制脑切片与人源iPSC记录工作站
锥形管，50 mL，Falcon（离心管） STEMCELL Technologies 38010 CDI 商业供应商方案
鳄鱼夹接地线JWQIDIB06WGZG17W脑片记录工作区
弯头镊子FST11052-10脑提取工作区
DMEM/F12 培养基Life Technologies 11330-032BrainXell 商业供应商方案
杜尔贝科’不含钙的磷酸盐缓冲液2+ 和 Mg2+ (D-PBS)STEMCELL Technologies 37350 CDI 商业供应商方案
滤纸Macherey-Nagel531 011脑组织制备工作区
细毛刷Leonhardy773脑片制备工作站，脑片记录工作站
镊子VITLAB67895脑片记录工作站
GDNFPeprotech450-10BrainXell 商业供应商方案
GeltrexLife TechnologiesA1413201BrainXell 商业供应商方案
巴斯德玻璃吸管Roth4518脑片制备工作区，脑片记录工作区
葡萄糖Sigma AldrichG7021-1KG溶液配制工作区
GlutaMAXLife Technologies35050-061BrainXell 商业供应商方案
重力驱动灌注系统ALAVC3-8xG脑片记录工作站
高密度微电极阵列记录平台3Brain AG定制脑切片与人源iPSC记录工作站
加热器Warner InstrumentsTC-324C脑片记录工作站
血细胞计数板或自动细胞计数仪混合各种高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作流程
低流量针头Warner Instruments641489脑片记录工作站
iCell GlutaNeurons 试剂盒，01279 CDIR1061 CDI 商用供应商方案
虹膜剪VantageV95-304脑提取工作区
异氟烷巴克斯特HDG9623脑提取工作区
KClSigma AldrichP5405-250G溶液配制工作区
层粘连蛋白 Sigma-Aldrich L2020 CDI 商业供应商方案
液氮储存装置 各种各种高密度微电极阵列（HD-MEA）包被、接种与维护工作流程
磁力搅拌器通用的通用的溶液配制工作区
金属螺钉ThorlabsHW-KIT2/M脑片记录工作站
MgCl₂2Sigma AldrichM1028-100ML溶液配制工作区
MgSO₄4Sigma Aldrich63138-250G溶液配制工作区
显微解剖工具架 Braun4606108V脑片制备工作站，脑片记录工作站
显微解剖工具针布劳恩 9186166脑片制备工作区，脑片记录工作区
模块化体视显微镜Leica定制脑片记录工作站；定制规格与改造
N2 补充材料Life Technologies17502-048CDI 和 BrainXell 商业供应商方案
NaClSigma AldrichS3014-1KG溶液配制工作区
NaH2PO4Sigma AldrichS0751-100G溶液配制工作区
NaHCO₃3Sigma AldrichS5761-500G溶液配制工作区
Neurobasal 培养基 Life Technologies21103-049BrainXell 商业供应商方案
光学笼系统Thorlabs各种脑片记录工作站
带面包板的光学平台ThorlabsSDA7590脑片记录工作站
PDLOSigma AldrichP0671高密度微电极阵列涂层，脑切片记录工作区
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩 赛默飞世尔科技 15140-122 CDI 商业供应商方案
移液器吸头TipONES1120-8810脑片记录工作站
移液器 各种各种各种
铂金锚定器定制定制脑片记录工作站
聚乙烯管各种各种脑片记录工作站
泵MasterFlex78018-22脑片记录工作站
剃刀刀片阿波罗10179960脑组织制备工作区
参比电极细胞培养帽定制定制人类诱导多能干细胞记录工作站；定制设计的3D打印机设计，可根据要求提供
橡胶移液球Duran Wheaton Kimble292000205脑片制备工作站，脑片记录工作站
血清移液管，1 mL，2 mL，5 mL，10 mL，25 mL各种各种各种
切片恢复室定制定制脑片恢复工作区；定制设计的3D打印装置，可根据要求提供
刮勺ISOLAB047.06.150脑组织制备工作区
蔗糖Sigma Aldrich84100-1KG溶液配制工作区
超级胶水UHU358221脑片制备工作区
手术剪Peters InstrumentsBC 344脑提取工作区
台式离心机 各种各种各种
TGF-β1Peprotech100-21CBrainXell 商业供应商方案
纸巾通用的通用的脑提取工作区
台盼蓝STEMCELL Technologies 07050 CDI 商业供应商方案
正置显微镜奥林巴斯定制成像工作区；自定义规格与改造
VacusipIntegra159010脑片记录工作站
振动切片机LeicaVT1200s脑切片制备工作台；包含：样本托盘、缓冲液托盘、冰盒、样本托盘固定工具、振动切片机刀片调节工具
振动切片机刀片PersonnaN/A脑片制备工作区
水浴锅LaudaL000595脑片恢复工作区

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