本文介绍了一种快速且简便地采集成年Xenopus六种重要且具有代表性的器官的取样指南，这些器官包括心室、肝叶、胰腺、脂肪体、成对的肾脏以及皮肤。
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本文内容
摘要
摘要
Xenopus 作为研究脊椎动物发育与疾病的模式生物已有百余年历史。尽管胚胎的实验分析与解剖技术已有详尽记载，但有关成体 Xenopus 的结构与器官描述，以及成体操作技术，尚未根据定量蛋白质组学和单细胞转录组学等现代研究方法的需求进行更新。细胞类型和基因中心的研究视角，要求对胚胎期与成体组织进行对比观察。在从幼体到成体的转变过程中，幼体器官在整体结构、形态以及解剖位置上均发生显著变化，尤其在大规模变态重塑期间尤为明显。建立可靠的器官鉴定与解剖标准，对于确保不同实验室研究所得数据的一致性至关重要。本实验方案鉴定了成体 Xenopus 的六个器官，展示了成体 Xenopus 心室、肝脏、脂肪体、胰腺、成对肾脏以及皮肤的解剖与取样方法。根据保存方法的不同，所获取的组织可用于定量蛋白质组学、单细胞/单细胞核转录组学、原位 杂交、免疫组织化学、组织学等分析。本方案旨在标准化组织取样流程，促进多实验室对成体器官系统的联合研究。
引言
尽管已有成年"数字解剖"的Xenopus资源1，但在缺乏针对其他成年模式生物（如小鼠2,3,4）所具备的详细操作指南的情况下，成年Xenopus的可重复性器官与组织取样仍具挑战性。本文旨在提供清晰的操作指导，以实现成年Xenopus准确且可重复的器官取样，类似于目前已有针对其幼体的方案5。本方法注重操作简便性，以最大限度保持样本新鲜度，并确保该方案适用于所有使用者。
尽管已有针对Rana属物种的详细解剖指南6，以及大量其他无尾目动物的课堂解剖指南7，目前尚无适用于Xenopus的解剖与取样操作指南。对于不熟悉取样操作或两栖动物解剖结构的研究者而言，Xenopus与其他无尾目动物之间存在的细微差异，使得这些现有资源在实现可重复的组织取样方面效果不佳。
目前的指南未包含许多有价值的组织，甚至会将其丢弃，这是为了确保组织的新鲜度。将样本数量限制为六个，足以保证无论操作者经验或技能水平如何，均可在心脏开始跳动后一小时内完成这些组织的采集。针对多种其他组织的更高级、更详细的采集指南正在作为独立的配套论文进行准备。
对于经验较少的操作者，建议在对难以替代的动物（如转基因动物、高龄动物等）进行取样之前，先在因非实验原因而实施安乐死的动物身上尝试本方案。理想情况下，所有取样的动物均应健康，且若为雌性，近两周内未发生排卵。
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方案
所有实验均按照哈佛医学院动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行（批准号：IS 00001365_3）。图中展示了灌注与未灌注的成年白化雄性Xenopus laevis的代表性结果。
1. 实验准备
注意：如果在取样前遵循灌注方案8，请跳至步骤 2.2。
- 确保研究机构已批准本方案中所述的安乐死技术。
- 配制含有 5 g/L MS-222（三卡因甲磺酸盐）和 5 g/L 碳酸氢钠的溶液（参见材料表）。溶液体积必须大于完全浸没待安乐死动物所需的体积。检测 pH 值，确保其 ≥7。
- 通过将Xenopus放入安乐死溶液中实施主要安乐死程序；动物需完全浸没持续 1 小时。
- 设置解剖工作站，以便在取样后立即用预冷的 PBS 或 0.7x PBS9（根据实验需求选择）冲洗所有组织，并在 5 倍或更高倍率的体视显微镜下检查和修整组织。该工作站还应允许操作者在每次使用之间更换所有镊子和剪刀，或将其彻底擦拭清洁。
- 当青蛙在溶液中放置 1 小时后，主要安乐死程序即已完成。取出青蛙，并通过脚部夹捏测试确认痛觉反应是否消失。
- 记录动物的相关信息，如物种、品系、性别、年龄、健康状况以及是否经过灌流。称量Xenopus体重，并测量其他所需参数，例如吻肛长。
- 将青蛙仰卧放置，并用针固定四肢靠近躯干的位置（图 1）。
- 使用解剖剪沿中线向上剪开皮肤，然后横向剪开，形成两个皮瓣。
- 参考图 2，辨认白线（linea alba），用镊子夹住并将其从体腔拉开。小心使用剪刀沿肌肉层向上剪开，将体腔壁分成两个瓣膜。将所有瓣膜剪开或固定至一侧，以便暴露操作区域。
- 辨认仍在跳动的心脏。使用解剖剪剪除喙骨（图 2），以更好地暴露心脏。
注意：如果在取样前心脏已停止跳动，应注明样本的新鲜度已受影响。
2. 取样
注意：如果动物已经灌注，请跳至步骤 2.2。
- 辨认出薄薄的心包膜，并用组织镊将其拉紧（图3）。
- 使用虹膜剪的尖端轻轻刺破心包膜，注意不要剪到下方的组织。将心包膜从心脏的三个腔室上剥离。
- 用镊子夹住心室的顶端，辨认其与耳状房和动脉干的连接位置（图4），并在这些连接下方进行剪切（图5）。如有需要，修剪心室，确保耳状房或动脉干的组织不可见，而心室内仍可见浅色的瓣膜组织。
注意：在未灌注的动物中，移除心室可能构成二次安乐死。 - 肝脏的三个叶将可见（图6 和 图7）。抓住左侧叶（观察者的右侧）边缘，轻轻抬起，使肝管和胆囊管可见（图8）。取该叶连接下方的底部三分之一部分进行取样（图9）。
- 为了更好地接触雌性蛙的组织，可先移除卵巢。辨认被一层称为生殖上皮的脏层腹膜包裹的卵巢。轻轻移动卵巢叶，使其分别位于各自的一侧，以便显露其附着区域（图10）。这些附着点位于成对肾脏的正腹侧。
- 使用剪刀尽可能靠近肾脏但不损伤肾脏的情况下切除卵巢（图11）。
- 检查肝脏的中叶（也称为前叶），注意其如何通过肠系膜和肝胰管（也称胆总管）与胃和十二指肠相连（图6、图7 和 图8）。
- 使用虹膜剪切断肠系膜和肝十二指肠韧带，以及肝胰管与十二指肠连接处。切断胰腺和肝胰管与肝脏中叶的连接，确保无深色肝组织残留（图12）。
- 用有齿镊夹住胃部，用组织镊夹住胰腺的上端。在5倍放大下，轻轻将胰腺从胃部分离（图13）。
注意：若无法完整分离，残留的胰腺组织仍可见，可分段挑除。或者，也可系统性地使用虹膜剪和组织镊将胰腺剥离。 - 参照 图14A，辨认出膀胱并将其移除，尽可能靠近泄殖腔处剪切。丢弃该组织。
- 参照 图14B，辨认出大肠并将其拉紧，尽可能靠近泄殖腔处切断大肠。移除并丢弃整个消化道，在其与脾脏连接处切断腹膜。此时脂肪体将完全暴露。
- 将脂肪体分开，使其位于各自的一侧。肾脏上方脂肪体与腹膜连接的区域将可见。夹住左侧脂肪体（观察者的右侧）基部，用剪刀将其从腹膜上剪下，保留一小边缘，避免损伤肾脏（图15）。
- 移除并丢弃剩余的脂肪体。成对的肾脏此时将完全可见。
- 在雌性蛙或具有明显退化输卵管的雄性蛙中，夹住一侧输卵管并将其从肾脏和泄殖腔上拉开（图16）。在输卵管与泄殖腔连接处剪断，并继续将其从肾脏上拉开，当出现透明的腹膜连接时即剪断。丢弃该组织。
- 对另一侧输卵管重复此操作。
- 肾脏仍被透明的腹膜（后腹膜）覆盖10。用镊子夹住肾脏，并在其下端切断腹膜。
- 将肾脏从体腔中抬起，使用剪刀尽可能靠近肾脏但不损伤肾脏的情况下切断腹膜（图17）。
- 在5倍放大下，剪除多余的腹膜及其他残留组织（脂肪体、脾脏）。若为雌性蛙，确保移除所有残留的卵巢组织（图18）。若为雄性蛙，小心移除睾丸，并检查是否存在退化的输卵管，后者在无放大条件下可能不可见（图19）。
- 移除动物身上的大头针，将其翻转至腹侧朝下，并重新固定四肢。
- 选择任一后肢进行取样，并将该肢的足部固定。
- 从腓肠肌/胫腓骨上方取下一瓣杏仁状的皮肤（图20）。
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结果
通过利用图1至图20并遵循本方案的全部步骤，可在动物安乐死后一小时内干净地切除心脏心室、肝脏左叶、胰腺、左侧脂肪体、成对的肾脏以及一块皮肤。在此期间，对样本进行冲洗和修整，使其外观如图21所示。
图 1： 被固定的 Xenopus。 一只成熟的雌性 X. tropicalis，其每条肢体均被针固定。
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讨论
由于本方案旨在最大限度地保持样本新鲜，某些样本中可能包含不需要的组织。例如，胰腺样本中可能包含肝胰管和部分肠系膜，而配对的肾脏样本中总会包含部分腹膜组织、肾上腺和输尿管。 如果对新鲜度无特殊要求，则可通过改进的技术实现更精确的取样。
Xenopus 属不同性别和物种之间的器官形态和位置具有可比性。然而，组织的颜色会因动物是否经过灌注而表现出显著差异。因此，本文同时提供了经过灌注和未灌注动物的图像。
本方案的一个限制在于，优先考虑了速度和可重复性，而牺牲了采集最能代表目标组织整体性的样本。例如，此处采集的肝脏左叶样本无法充分代表肝脏全部三个叶的组织。如果采样过程中出现误差，其故障排除的选择将受到不同组织区域之间潜在变异的影响。例如，尚不清楚肝脏右叶、右侧脂肪体或皮肤的其他部位是否可作为目标组织的功能性替代物。在这些情况下，应根据研究需求谨慎判断，再决定是否替换组织区域。
本方案的另一个局限性在于，如果被采样的动物存在严重的解剖学缺陷或具有临床意...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）所属机构发展办公室（OD）资助项目 R24OD031956 支持。我们感谢 Samantha Jalbert、Jill Ralston 和 Cora Anderson 提供的帮助与支持，同时感谢我们的编辑以及匿名同行评审专家提供的有益反馈。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带LED灯和支架的5倍放大镜 | amazon.com | B08QJ6J8P1 | 光源不得产生热量 |
| 一次性移液管 | VWR | 414004-036 | |
| 解剖用尖头镊子 | Fisher Scientific | 08-875 | |
| 解剖剪，锐头，直型，6.5" | VWR | 76457-374 | |
| 解剖托盘 | Fisher Scientific | 14-370-284 | 泡沫聚苯乙烯板可作为可接受的替代品 |
| 安乐死容器 | US Plastic | Item 2860 | 其他不透明容器亦可接受 |
| 安乐死容器盖 | US Plastic | Item 3047 | |
| 虹膜剪，6" | vwr | 470018-938 | 虹膜剪可作为可接受的替代品 |
| MS-222：Syncaine（原名 tricaine） | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| 碳酸氢钠粉末，USP级 | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| 带齿镊（标本用） | VWR | 82027-442 | |
| 解剖用T型针 | Fisher Scientific | S99385 |
参考文献
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重印与许可
