通过遥测系统，实现了对母鼠从妊娠期到哺乳期自主神经活动和详细母性行为的同步记录。该方法有助于理解母鼠从妊娠到断奶期间生理和行为特征的动态变化。
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摘要
摘要
母体与后代关系的变化可能伴随着自主神经系统的动态变化。尽管已对人类母亲和婴儿的自主神经活动进行过时间上的测量，但长期变化的分析仍属未知领域。小鼠母亲能够与幼崽建立社会纽带，并且具有较短的妊娠期和哺乳期，这使其成为研究从妊娠到育幼期间生理变化的理想模型。因此，本研究采用遥测系统连续数周监测小鼠母亲自主神经系统及行为的变化。结果显示，无论母鼠活动或分娩过程如何，心电图（ECG）均能被稳定记录。心电图分析表明，心率从妊娠期到哺乳期逐渐下降，而随着幼崽的发育，交感神经活性显著升高。此外，在家笼中同步记录行为与心电图，使我们能够理解不同行为对心电图的影响，从而揭示各种行为期间自主神经活动的特征。因此，本实验方法有助于阐明母亲从妊娠到育幼过程中生理特征的变化，进而支持幼崽的健康发育。
引言
在各种动物物种所建立的关系中，母子关系因其对后代未来发展具有重大影响而显得尤为独特1。在人类中，儿童的发育及其内外行为受到养育方式以及虐待和忽视程度的影响2,3。类似地，在啮齿类动物中，母体行为的质量对幼崽的发育和行为具有显著影响4,5,6。因此，对母体抚育行为进行详细追踪和观察，有助于揭示个体在后代发育及健康支持方面差异的机制。
行为学和生理学研究表明，哺乳动物母亲从妊娠期到哺乳期会经历动态的行为和生理变化。当雌性哺乳动物怀孕后，雌激素和其他激素的分泌发生变化，从而影响母性行为7。随着后代的生长，哺乳频率逐渐降低，激素分泌也随之动态地向妊娠前状态恢复，母性行为的表达也随之终止8,9,10。这些发现表明，内分泌系统、母性行为与后代发育之间的相互作用，在哺乳动物母亲经历妊娠和哺乳期变化过程中发挥着重要作用。
从妊娠到哺乳期，哺乳动物母亲的行为和生理变化不仅与内分泌系统密切相关，也与自主神经系统密切相关11,12。人类研究表明，母婴接触会引起母亲和婴儿自主神经系统的改变13。多项研究已测量了人类母亲和婴儿的心电图（ECG）及心率变异性，表明各自的行为会改变对方的心率和RR间期14,15,16。然而，从妊娠到哺乳期，自主神经系统、母体行为和子代发育这三个因素之间如何相互作用尚不明确。此外，由于人类哺乳期约为两年，长期监测这些相互作用在人类中存在困难。
在这些研究中，通常使用啮齿类动物代替人类。啮齿类动物的自主神经系统通常在麻醉状态下或将其与幼崽分离后进行测量，以避免记录不稳定以及测量设备受损；因此，这种测量仅能在行为受限的情况下短暂进行17,18,19。然而，观察啮齿类动物在可自由活动并能与其他个体交流的环境中的自主神经系统至关重要，因为母体与幼崽之间的互动会改变母体的行为和生理状态8,9,10,15。
本实验方法旨在允许母体自由活动。在此方法中，将心电遥测仪植入妊娠母鼠皮下，以防止设备受损，并实现从妊娠期到哺乳期的稳定长期心电图记录。母鼠可在其饲养笼内表现出正常的自主行为（如自我理毛、进食等）以及典型的母性行为；因此，可在同一只小鼠中方便地观察和比较各种行为与心电图变化。通过录像记录设备连续四周、每天24小时记录小鼠的行为。该实验方案使我们能够追踪从妊娠期到育幼期间自主神经活动和行为的动态变化。
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方案
所有实验程序均经 Azabu 大学伦理委员会批准（#210319-30）。本研究使用妊娠第 14 天（GD 14）、体重超过 22 g 的 C57B/6J 小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。本研究所需的试剂和设备列于材料表中。
1. 实验准备
- 打开面板加热器，并用铝箔覆盖。用70%乙醇擦拭所有表面。
- 所有手术器械（剪刀、镊子、精细镊子和普通镊子）均已预先进行高压灭菌处理。
- 将无菌缝合线剪至所需长度，并准备好备用。
- 在麻醉面罩上覆盖橡胶罩，以确保无菌性和患者舒适度。
- 使用安装在具备记录功能的计算机上的tBase和LabChart（生理数据分析软件）程序，检查小鼠生物电遥测仪（图1A）是否存在任何异常或损坏。
2. 遥测仪植入
- 将小鼠放入含4%异氟烷的诱导麻醉盒中。
- 在达到手术麻醉平面后，将小鼠俯卧于加热板上。摆放体位 将麻醉面罩戴在小鼠上，维持异氟烷浓度为1%-2.0%，氧气流速为0.5-2 L/min。
注意：在本方案中，考虑到镇痛药对胎儿及行为观察的影响，未使用任何镇痛剂。 - 使用剪毛器去除耳间毛发，并用碘伏和70%酒精交替消毒皮肤三次。
- 为确认小鼠麻醉的手术平面，使用镊子夹捏其后肢脚趾。使用剪刀在小鼠两耳之间皮肤上做一长度为2-3 cm的切口。将镊子插入切口，分离颈部及腹侧的皮肤与肌肉，在腹侧预留出用于植入遥测仪的空间。
- 将遥测仪通过耳间切口插入，并置于腹侧间隙中。
- 使用镊子将正极和负极导线卷起并捆成束，将导线置于颈部空间（图 1B).
- 使用13 mm针头和20 cm缝线缝合切口，注意避免损伤导线。
- 将小鼠置于仰卧位，使用剪毛器去除锁骨周围的毛发。用碘类消毒剂和70%酒精交替消毒皮肤三次。
- 用剪刀在锁骨皮肤周围做一个小切口，并将颈部皮肤与肌肉分离。使用镊子从颈后部取出正极和负极导线。
- 使用镊子分离唾液腺并暴露 "V形" 胸锁乳突肌（SCM）的外观，该肌起自锁骨，斜向跨越颈部两侧图1C，D).
- 调整负极导联的长度，使其能够到达锁骨附近的胸锁乳突肌（SCM）。小心地将负极导联的导管移除，并使用精细镊子拉直其中盘绕的不锈钢电极。
- 用一根10 cm的缝线穿过胸锁乳突肌（SCM）V形弯曲处的缝合针（7 mm），形成一个环。将负极导线的不锈钢电极穿过此环，并置于靠近锁骨处的胸锁乳突肌下方。
- 轻轻打结固定环线，避免损伤胸锁乳突肌（SCM），重复三次以确保不锈钢电极稳固。通过在胸锁乳突肌头侧放置第二根缝线，并将其缠绕在负极导线的导管周围打结，进一步固定负极导线。图1E).
- 在剑突周围进行切开，从剑突至锁骨处仔细分离皮肤与肌肉。
- 将正极导联延长至剑突部位。与负极导联类似，从正极导联上取下导管，使用精细镊子拉直其内部盘绕的不锈钢电极。
- 使用18 G针头在剑突周围的肌肉下方创建一条隧道，然后将不锈钢电极置入针头中，并穿过剑突周围的肌肉。
- 移除针头后，使用缝合针（7 mm）和10 cm缝线，将盘绕的不锈钢电极轻轻缝合固定于剑突周围的肌肉上图1D为了进一步固定正极导线，在剑突头侧位置打第二针缝线，并将其结扎在正极导线的导管上。
- 使用缝合针（13 mm）和20 cm缝线长度关闭所有切口图1E，F).
- 植入后，将小鼠放入清洁的笼具中，并将笼具置于tBase上，tBase作为小鼠遥测信号的接收器图1G）。打开可记录的计算机，使用已安装的数据分析软件应用程序采集心电图数据。检查心电图数据是否显示正常的波形（图2A，B).
注意：如果出现异常波形或噪声（如图所示） 图2C），在麻醉状态下重新连接阴性和阳性导联。 - 在为期两天的恢复期内，通过将水凝胶和食物放置在笼底，确保小鼠得到适当照料。在此恢复期间，仅使用记录仪记录小鼠在居住笼内的行为。
3. 从妊娠到断奶期间心电图及家庭笼内行为的记录
- 在黑暗阶段打开红光，因为行车记录仪在无光条件下无法工作。将行车记录仪放置在动物饲养笼旁以记录行为。使用可记录电脑上的 LabChart 软件记录心电图（ECG）。在采集心电图数据前，需确认 LabChart 中心电图的采样率。
注意：本实验方案选择行车记录仪，是因为其可灵活放置于任意位置。此外，与视频摄像机相比，行车记录仪具有更广的视角，且数据存储占用更少（例如，使用行车记录仪连续记录 24 小时约占用 70 GB 存储空间）。在本演示中，数据分析软件中的心电图采样率设定为 1 k/s。 - 开启行车记录仪后，在计算机上启动 LabChart 软件，以同步记录行为和心电图数据。
注意：在本演示中，使用了一个宏命令来持续记录心电图，并每 2 小时自动保存一次文件。该重复性操作贯穿整个实验过程。此外，选用了一张 256 GB 的 SD 卡进行数据记录，可支持每天约 24 小时的数据采集。 - 检查小鼠是否分娩及是否存在身体异常，并从行车记录仪和可记录电脑中采集数据。小鼠产下幼崽的当天记为出生后第 0 天（PD 0）。幼崽出生后每日测量其体重。
注意：在本研究中，每天早晨 7:30 至 8:30 采集行车记录仪的视频和可记录电脑的心电图数据文件。此外，为避免因多只幼崽接触母鼠而引起振动干扰导致心电图噪声，每窝幼崽数量被缩减至 4 只（其中一半为雄性，另一半为雌性）。 - 检查小鼠并完成数据采集后，将所有设备恢复至原始位置。重新开启行车记录仪和可记录电脑，并启动 LabChart 应用程序。
注意：若使用宏命令记录心电图，请点击 macro 按钮，并在 manage 选项中选择 run 按钮以初始化宏程序。 - 每周更换一次笼具。更换过程中，垫料一半使用旧垫料，另一半使用新垫料。
注意：该操作流程（包括数据采集和小鼠检查）从妊娠第 17 天（GD 17）持续至出生后第 21 天（PD 21）。
4. 分析心电图
- 为分析心电图（ECG）数据，请使用数据分析软件。启动 LabChart 并打开记录时段的 数据文件。为分析心率变异性（HRV），点击 HRV 按钮，并调整心跳检测设置。
注意：在本演示中，选择 自定义 设置，并将检测调整中的最小峰值高度更改为 1.2。 - 调整设置后，检查所有心跳波形，并删除任何噪声数据（如 图 2C 所示）。
注意：若未检测到 R 波，可使用 HRV 按钮添加或修改该波形。 - 点击 HRV 按钮，选择 心跳分类视图。在心跳分类视图中选择 所有心跳，然后从 HRV 按钮中选择 报告视图。从报告视图中复制数据，并粘贴至 Excel 中。
注意：HRV 结果（如 表 1 所示）通过数据分析软件显示时域和频谱域参数，便于观察分析。
5. 家居笼内行为谱的分类
- 回看所有录制的视频，检查是否存在异常情况，例如黑暗阶段红灯未亮起或行车记录仪无法正常工作。
注意：视频的录制方式与心电图相同，每 2 小时采集一段视频片段。 - 根据母体行为时的姿势、行为持续时间以及行为发生的位置等参数对行为谱进行分类（表 2），然后观察行车记录仪中的视频。
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结果
将遥测仪植入妊娠小鼠后，我们在其饲养笼内记录了从妊娠期到哺乳期的心电图。采样频率设置为 1 k/s。为了在避免昼夜节律影响的前提下比较母鼠各生理状态下的心电图，我们分析了 GD 17、分娩期、PD 0 和 PD 21 这四个时间点的 2 小时数据文件中从 23:32 至 23:42 的 10 分钟数据（图 3，表 1）。选择 23:32 至 23:42 这一时段，是因为它代表了分娩过程中第一只幼崽出生前的 10 分钟。选择这一特定时间段旨在展示在存在肌肉收缩的情况下，于分娩期间进行数据分析的可行性。在所有分析阶段，小鼠均表现出一般行为（饮水、挖掘、进食、自我理毛）和母性行为（筑巢、舔舐/理毛），这些行为来自 表 2 所列 16 个行为图谱中的 6 个。
在妊娠第17天（GD17）胎儿尚在母体内时（图3A），以及分娩过程中出现肌肉收缩等生理变化时（图3B<...
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讨论
在本方法中，将遥测仪植入妊娠小鼠体内，可在同一只小鼠中持续追踪从妊娠期到哺乳期的心电图。该小鼠在妊娠第17天（GD 17）至产后第21天（PD 21）的所有分析时段（23:32–23:42）均表现出包含活动行为的谱图，表明其处于清醒状态。此外，本研究结果表明，心率从妊娠期到哺乳期逐渐下降。这种下降被认为是由心率恢复正常所致，因为已有多个研究显示，由于血流量增加，妊娠雌性个体的心率会升高11,12。
此外，同一只小鼠从出生后第0天（PD 0）到第21天（PD 21）交感神经活动增强。然而，从妊娠第17天（GD 17）到出生后第0天（PD 0），交感神经或副交感神经活动均未发生改变。与妊娠期间的交感神经数据相似，既往研究未报道大鼠在妊娠第4天至第18天的交感神经和副交感神经活动与未交配大鼠相比存在任何变化20。在小鼠中，母体自主神经活动可能受到仔鼠发育的影响。然而，尚需进一步研究以确定这些自主神经活动特征是否在小鼠母亲中普...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由日本学术振兴会科研费（JSPS KAKENHI，资助编号 JP 21H04981 和 30974521）及多元、公平中心（Center for Diversity, Equity）提供支持 & 入选，Azabu 大学。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24小时循环定时器 | Panasonic | WH3311BP | |
| 5-0 尼龙缝合线 | Natsume Seisakusho Co | -23s-N2 | |
| 麻醉箱 | Natsume Seisakusho Co | KN-1010 | W110×D110×H110mm |
| 麻醉面罩 | Natsume Seisakusho Co | KN-1019-1 | |
| 麻醉机 | Natsume Seisakusho Co | KN-1071-E | |
| C57BL6/J 小鼠 | Clea Japan, Inc | 妊娠14天的小鼠 | |
| 夹式照明灯 | Yazawa corporation | CLX60X02WH | |
| 配置系统 | Adinstuments | TR190 | |
| 行车记录仪 | Transcend | TS-DP250A-32G | |
| 饲料架 | Clea Japan, Inc | CL-2802 | |
| 异氟烷 | FujiFilM | 099-06571 | |
| LabChart Pro V8 | Adinstuments | MLU260/8 | |
| LabChart8 | Adinstuments | MLS060/8 | |
| 小鼠生物电遥测仪 | Adinstuments | MT10B | |
| 18 G 1 1/2 针头 | Terumo | NN-1838R | |
| 面板加热器 | SANKO | 4976285145407 | |
| PowerLab 4/26 | Adinstuments | PL2604 | |
| 可记录计算机 | Mouse computer | mouse K7-H | |
| 红色灯泡 | ELPA | LDG1R-G-GWP254 | |
| 橡胶面罩 | Natsume Seisakusho Co | KN-1019-M | |
| SD卡（256GB） | Transcend | TS256GUSD350V | 可记录约24小时 |
| 13 mm缝合针 | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0 | |
| 7 mm缝合针 | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0000 | |
| tBase | Adinstuments | MT110 |
参考文献
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