作者无任何利益冲突需要披露。

一次性诊断中的微流控应用

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

在本次访谈中，Klapperich 博士讨论了热塑性微流控装置的制备及其在新型诊断技术开发中的应用。

在这次访谈中，Klapperich 博士讨论了热塑性微流控装置的制备及其在新型诊断方法开发中的应用。

在本次访谈中，Klapperich 博士讨论了热塑性微流控装置的制备及其在新型...开发中的应用

我叫Catherine CloudBridge，是波士顿大学制造工程和生物医学工程的教授，同时也是生物医学微器件与微环境实验室的主任。我们的研究主要致力于开发适用于资源有限环境的一次性诊断工具。因此，我们利用微流控技术来制造这些装置。我们的研究主要涉及两个领域：首先是关注生物分子和细胞如何与塑料聚合物表面相互作用。这是我们的主要研究方向。这项工作体现在一次性诊断的微流控应用中。因此，在实验室中，我们制造的是微流控装置。在热塑性材料中，我们通常不使用PDMS（聚二甲基硅氧烷），PDMS是一种橡胶状材料，大多数人在实验室中用它来制作微流控芯片。我们的设备是用热塑性塑料制成的。我们致力于利用这些热塑性塑料设备在微尺度上进行分子生物学实验，从而使分子生物学操作能够在远离中心实验室的现场环境中开展。在实验室中，其工作方式是制作小型塑料卡片，这些塑料卡片内部包含固相萃取柱、细胞裂解柱或混合柱。我们还在芯片上进行聚合酶链式反应，作为检测手段。所有这些功能都集成在一个小型装置中；从长远的研究展望来看，最终将形成一种可手持的集成设备，能够在野外或缺乏大型实验室条件（如离心机、加热培养箱等配套设备）的环境中使用。因此，我们希望理想情况下能够从人体样本（例如血液、尿液、粪便或鼻咽拭子，后者含有黏液）开始，经过芯片检测后直接得到结果，明确判断某人是否感染了特定的微生物。实现这一目标的方法是，在患者的样本中检测该特定微生物的 DNA 或 RNA（具体检测哪种核酸取决于目标微生物）。因此，技术上的挑战主要出现在该过程的样品制备环节。当你从血液、粪便或尿液等样本开始时，必须将初始状态——即含有大量可能的颗粒物或对PCR及其他扩增技术具有抑制作用的复杂人源样本——转化为最终获得的、高度纯净的核酸洗脱样本。只有这样，才能用于扩增或检测特定的DNA或RNA，从而判断你所关注的微生物是否存在于原始样本中。因此，为了处理这些样本，您需要进行几个步骤。首先，必须对样本进行过滤，具体方法取决于样本类型，可能包括粗过滤或在将样本上芯片前进行短暂离心。因此，我们始终尽量直接使用临床医生提供的原始样本开始实验。对于尿液、粪便和鼻咽拭子样本，我们的目标是让临床医生像往常一样正常完成采样工作。然后我们取这些样本并将其加载到芯片上。如果在此步骤中还需要进一步过滤，则该过滤过程将在芯片内完成。第二步是裂解细胞和样本中的微生物，因为我们要进行分子检测。因此，我们会执行一个裂解步骤，通常是将样本强行通过一个孔径很小的滤膜。有时该滤膜中还含有纳米颗粒，例如具有锋利边缘的碳纳米管，可用于破坏某些具有较强细胞壁的微生物，比如我们研究的艰难梭菌（C difficile），这是一种革兰氏阳性细菌，其细胞裂解非常困难。因此，我们需要更坚固的裂解柱。但通常情况下，我们会在芯片内部进行化学和机械裂解的结合。在此之后，我们的目标是收集裂解液，并从中提取纯化的核酸。因此，我们将裂解液通过微流控芯片内的固相萃取柱。该固相萃取柱由塑料制成，是在微流控通道制备完成后，通过光引发化学反应在通道内部形成的。此外，该柱通常还浸渍有二氧化硅颗粒，因为我们希望结合并释放核酸。在某些情况下，如果我们希望特异性结合并释放 mRNA，可以使用带有寡核苷酸 DT 的磁珠；或者，如果我们希望结合并释放特定蛋白质，则可使用带有特定抗体的磁珠。我们可以制备能够实现上述所有功能的提取柱。但今天我们将向您展示如何使用二氧化硅磁珠制备 SASE 提取柱。完成上述步骤后，将裂解液通过硅胶柱，其原理与大规模实验室中使用的高纯度试剂盒相同。随后进行洗涤，以去除所有不需要的成分，包括细胞裂解液中的碳水化合物、脂质以及其他存在于人源样本中的杂质。最后，我们用水进行洗脱。这些微尺度固相萃取柱的优点在于，我们可以用非常少量的水进行洗脱，通常仅为一到五微升。而且我们能够回收几乎全部加入的核酸，在该通道中最初回收的10微升洗脱液中，回收效率约为70%至90%。因此，如果我们用两到十微升的溶液冲洗两次，就能回收几乎全部最初加入的核酸。因此，所获得的样本不仅可用于PCR扩增且纯度较高，而且其浓度也远高于使用常规台式试剂盒所能获得的样本。因此，所有这些样本制备技术的最终目标是制备出能够与人们已开展的其他工作相兼容的样本。这项工作在该领域非常出色，表明你可以在芯片上进行PCR扩增。如果你处理的是RNA病毒，或希望开展基因表达实验，也可以在芯片上完成逆转录反应。我们的样品制备技术可直接与芯片上的PCR相结合，因此无需在实验台上进行任何后续纯化和样品制备操作。此外，还需要进行浓缩步骤，以获得在小型芯片上进行多重PCR所需的微量体积。因此，今天我们向您展示的实验将说明如何组装由热塑性材料而非PDMS制成的微流控芯片，以及如何密封这些芯片。该制备过程与通常使用的方法略有不同。然后介绍我们如何在芯片内部通过光引发化学反应来制备聚合物整体柱，这些整体柱可用于细胞裂解和固相萃取。该过程目前在实验室中为模块化操作，但这些步骤已经可以且已被整合，最终可获得溶于水的高度浓缩的核酸样本（包括RNA和DNA），可用于后续的PCR模块或其他扩增模块，从而实现对微生物或感染的鉴定。目前我们正在开展一项资助项目，已开始从波士顿医学中心收集人类样本，这些样本来自可能感染或未感染甲型流感病毒的患者。由于正值流感季节，我们正在收集这类样本。然后在实验室中，我们采用金标准检测方法来判断患者是否感染了甲型流感病毒，即进行病毒培养检测，该方法通常需要数天时间才能完成。与此同时，我们将这些样本平行地通过我们芯片的各个模块，即将样本依次通过裂解柱和固相萃取柱，随后进行PCR检测，以评估我们的方法与金标准方法相比的检测效果。目前我们正处于这一阶段。如果这些实验能够成功，在接下来的四到六年里，我们或许能够实现一种集成芯片，并建立针对甲型流感的完整检测方法。同时，我们也在开展艰难梭菌及粪便样本的相关研究。我们不仅在设备集成方面已非常接近目标，在检测方法的集成方面也已取得显著进展。因此，检测方法的开发与芯片设计必须同步进行。对于特定的应用，要实现床旁检测，这实际上是一个以目标为导向的过程。必须明确起始样本以及需要检测的微生物种类，才能针对床旁应用对芯片进行优化。因此，我认为我们已经非常接近以原型方式实现这一目标了。这些是我们的最终目标，希望我们能够达成。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微流控一次性诊断的应用

Boston University.  在这次采访中，博士Klapperich讨论制造热塑性塑料微流控设备和开发新的诊断方法中的应用。

Summary

在本次访谈中，Klapperich 博士讨论了热塑性微流控装置的制备及其在新型诊断技术开发中的应用。

一次性诊断中的微流控应用

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