本文描述了一种成年斑马鱼新的腹腔（IP）注射方法。在处理多柔比星等有毒化合物时，该方法比此前报道的两种腹腔注射方法更有效。该技术设计为斑马鱼模型研究经验有限的研究人员也能轻松掌握。
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方法文章
一种可最大限度减少机体损伤及相关死亡率的成年斑马鱼腹腔注射技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
成年斑马鱼（Danio rerio）具有良好的遗传可操作性，现已被用作研究人类疾病（如心肌病）的重要脊椎动物模型。腹腔（IP）注射是一种重要的给药方法，可用于测试药物的治疗效果，或构建疾病模型，例如阿霉素诱导的心肌病（DIC）。目前，腹腔注射主要有两种方法。然而，这两种 方法在处理阿霉素等毒性化合物时均存在局限性，常导致副作用，表现为鱼体形态严重受损及鱼类死亡。尽管通过大量研究人员的训练可在一定程度上克服这些缺点，但仍亟需一种副作用更小的新型腹腔注射方法。本文报道了一种独特的腹腔注射技术，能够安全处理毒性化合物，可稳定诱导心脏功能下降，同时不引起显著的鱼类死亡。该技术易于掌握，即使对成年斑马鱼操作经验较少的研究人员也能快速学会。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其与人类具有高度的基因和器官同源性、体外 受精、易于进行遗传操作以及在发育早期身体透明等特性，已成为研究人类疾病的实验模型并受到广泛关注，这些特点为多种成像应用提供了便利1。与将药物直接加入水中以处理斑马鱼胚胎和幼鱼的简便方法不同，对成年斑马鱼给药则是一项更为复杂且具有挑战性的任务2。
在成年鱼类中，化合物可通过被动给药技术（例如直接加入水中）或口服给药方法（如灌胃）进行递送2其他方法包括将化合物涂覆于鱼食表面，随后喂食鱼类3，以及在预定浓度下直接给予难溶于水的药物，包括眶后注射或腹腔注射4,5腹腔注射给药为首选方法 体内 因其独特的药代动力学优势而被用于疾病模型研究6该方法可在腹腔内维持高药物浓度和延长的半衰期，为药物递送提供了一条有效途径7,8该方法在研究环境中常被用于确保药物的最佳吸收与分布 9. 尽管基于注射的方法在单次递送中表现出高效性，但长期反复注射常导致机体损伤和慢性感染2.
目前，成年斑马鱼的腹腔注射有两种方法4,10。然而，这两种方法在递送阿霉素等有毒化合物时均存在局限性，可导致鱼体形态严重受损及鱼类死亡。这些副作用会显著增加数据分析的复杂性。尽管通过大量训练可能缓解上述问题10，但仍迫切需要一种能最大限度减少副作用的新型腹腔注射方法。
本研究旨在建立一种优化的腹腔注射方法，以高效地将阿霉素递送至成年斑马鱼体内，从而在尽量减少机体损伤及相关死亡率的前提下，可靠地构建阿霉素诱导的心肌病（DIC）模型。
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方案
所有操作程序均经梅奥诊所机构动物护理与使用委员会批准，遵循《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，2011年）中规定标准。本研究中使用的所有斑马鱼均属于野生印度卡型（Wild Indian Karyotype, WIK）品系。实验所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 阿霉素储备液的配制与保存
- 从商业来源获取多柔比星（doxorubicin）储备液。
注意：多柔比星对光敏感，因此应以粉末形式获取，并储存于不透光容器中以避免光照。多柔比星粉末的全部配制操作均应在化学通风橱内进行。 - 将多柔比星粉末完全溶解于蒸馏水中，配制成终浓度为 5 mg/mL 的储备溶液。
- 将储备液分装至 1.5 mL 离心管中。
- 用铝箔包裹离心管，以避免光照。
- 分装后的多柔比星溶液可于 4 °C 短期保存（<1 个月），或于 -20 °C 长期保存10。
2. 根据体重对鱼类进行分组
- 将体重（BW）差异小于10%的鱼类分组，用于后续注射。
注意：为减少此阶段的工作量，将体重变异小于10%的鱼类归为同一规格。 - 在注射前使鱼类禁食24小时。
- 使用含有0.16 mg/mL 三卡因的胚胎水对鱼类进行麻醉，持续1分钟。
- 将鱼类从含三卡因的水中取出，并用干净的滤纸轻拭鱼体两侧，去除多余水分。
- 测量并记录每条鱼的体重（BW），然后立即将其放回装有新鲜系统水的恢复缸中。
注意：多西环素（Dox）注射在鱼类达到3个月龄后进行。本研究中研究人员使用了3至10月龄的鱼类。成熟WIK品系斑马鱼的体重（BW）范围可能为0.2 g至0.5 g。若麻醉时间超过5分钟，再进行多西环素注射，会导致鱼类死亡率显著升高。
3. 注射用针头及注射台的准备
- 根据斑马鱼的平均体重，确定每条鱼所需注射的多柔比星（Dox）储备液（例如，5 mg/mL）体积，以达到目标剂量 20 µg/g。
- 使用以下公式计算注射体积：
- 加入 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS）稀释第 1 步中计算出的多柔比星溶液，使总体积达到 5 µL。
注意：根据每组鱼的体重制备批量溶液，并在每组中额外增加 3 条鱼，以确保实验过程中注射溶液不会短缺。 - 轻轻敲击离心管，然后在室温下以最高速度短暂离心 10 秒，使溶液沉降至管底。
- 将配制好的溶液置于冰上，并避免光照。
- 在体视显微镜下放置一个洁净的 100 mm 培养皿，培养皿下方垫一块带有 4 cm 长凹槽的海绵，然后调节焦距。
注意：海绵中的凹槽可通过弹性回缩为斑马鱼提供支撑，固定鱼体位置。该海绵可重复使用。 - 为 10 µL 微量注射器装配一根 34 G 斜面针头。
- 用 1× HBSS 缓冲液冲洗针头，以排除任何气泡并清除注射器中可能存在的堵塞物。
- 量取第 4 步中配制好的溶液 5 µL，用于注射。
4. 腹腔注射 Dox 操作步骤
- 将成年鱼置于含有 0.16 mg/mL 三卡因的水中 1 分钟，以诱导其进入无意识状态。
- 将鱼腹面朝上放置于嵌入式海绵的凹槽中（图 1A）。
- 以接近 0° 的角度插入针头，从胸鳍中点开始，向心腔后侧推进（图 1B）。
注意：操作过程中避免接触心脏。 - 将针头朝尾部方向推进，并进入银膜下方。
注意：针头应紧贴银膜，注意避免刮伤或刺穿。 - 在整个操作过程中，持续观察针尖在腹腔内的位置（图 1C）。
注意：避免损伤肝脏、肠道、 swim bladder（ swim bladder 为原文术语，保留）及其他器官。确保针头到达肠道末端，靠近泄殖腔孔。 - 缓慢且均匀地注入 5 µL Dox 溶液，然后沿原路径缓慢撤出针头，以防止泄漏（图 1D）。
- 通过观察 Dox 溶液的红色染色现象，监测腹腔内是否存在 Dox（图 1E）。
- 迅速将注射后的鱼转移至装有新鲜系统水的清洁交配缸中，以帮助其恢复。
注意：每次注射之间，用 1x HBSS 缓冲液冲洗针头一次。
5. 注射后鱼类管理
- 注射后将鱼放回循环系统中。
- 注射后的鱼禁食额外24小时，以促进其恢复。
- 在第一周内密切观察鱼的状态。一旦发现死亡个体，应立即移除，以避免感染其他鱼。
注意：注射后最初24小时内出现的鱼死亡，可能源于注射造成的物理损伤或麻醉时间过长。记录鱼的数量以绘制生存曲线。 - 在注射后第56天对注射多西环素（Dox）的鱼进行超声心动图检查，以进行表型分析11。
注意：确保注射HBSS溶液的相应对照组在条件和操作上保持一致。
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结果
此前，已有两种腹腔内（IP）给药方法用于成年斑马鱼的阿霉素给药4,10。方法I即Kinkel等人所描述的经典腹腔注射法4，将针头以45°角插入腹鳍之间的中线位置，腹部朝上。方法II即Ma等人所述的替代性腹腔注射法10，将针头从鱼体背部一侧穿入（图2A(i,ii)）。相比之下，我们的方法III具有两项主要改进：第一，改变了注射部位，保持腹部朝上，针头从胸鳍中点朝向腹部方向刺入，穿刺位置由该区域的自然孔隙引导；第二，减小了针头的进针角度，应接近0°（图2A(iii)，图1）。
三种腹腔注射方法的比较...
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讨论
不同于现有的两种IP注射方法4,10，新的腹腔注射方法具有以下显著特征：首先，采用独特的进针角度（接近零度）；其次，针头刺入鱼体 通过 一个独特的位置，即鱼类腹面的天然孔洞，有助于注射；最后，针头的移动方向为从前向后。这些调整有效减少了器官损伤，原因是阿霉素（Dox）在穿刺过程中的泄漏量被降至最低。针头路径位于银膜下方，研究者可对此过程进行持续观察。因此，可有效避免针尖与内脏器官的直接接触。注射后，所有注入的阿霉素均保留在腹腔内，而唯一的出口（穿刺点）在鱼苏醒并开始向前游动时即可闭合。
与现有的两种腹腔注射方法4,10相比，新的腹腔注射方法始终能够显著减少机体损伤并提高存活率。这一优势进一步体现在可对同一条鱼进行多次注射，从而成功建立慢性斑马鱼弥散性血管内凝血（DIC）模型。尤为重要的是，与先前的两种腹腔注射方法
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：HL107304 和 HL081753）以及梅奥基金会 （生物医学发现中心和心血管研究中心）资助，资助对象为 X.X。J.L. 受中南大学中央高校基本科研业务费资助，项目编号：56021702。特别感谢 Beninio Gore 和 Quentin Stevens 对斑马鱼实验设施的管理。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 μL NanoFil-注射器 | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | 注射工具 |
| 34 G 针头 | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | 注射工具 |
| 60 mm 培养皿 | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | 放置海绵 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800 | 注射多柔比星 |
| 盐酸多柔比星 | Sigma | D1515-10MG | 构建扩张型心肌病模型的药物 |
| 超声心动图仪 | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | 测量心脏功能 |
| 泡沫海绵 | Jaece Industries | L800-D | 放置斑马鱼 |
| 汉克平衡盐溶液（HBBS） | Thermo Fisher | 14025076 | 多柔比星的溶剂 |
| 微量离心机 | southernlabware | MyFuge/C1012 | 收集多柔比星溶液 |
| 精密电子天平 | Torbal | AD60 | 数字天平 |
| 三卡因 | Argent | MS-222 | 麻醉斑马鱼 |
| 离心管 | Eppendorf | 1.5 mL | 储存 |
| vevo LAB 软件 | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | 心脏定量分析 |
参考文献
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