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利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

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DOI：

10.3791/66501

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Structure and Function, Institute of Medicine and Pharmacy, Qiqihar Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。

摘要

DNA 双链断裂（DSBs）是最危险的 DNA 损伤形式，可导致大量遗传信息丢失并引发细胞死亡。为应对此类损伤，细胞主要采用两种修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。分别定量 NHEJ 和 HR 的修复效率，对于研究各自相关的机制和影响因素至关重要。NHEJ 检测和 HR 检测是用于测量这两种修复通路效率的成熟方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，其中包含一个被破坏的绿色荧光蛋白（GFP）基因，并含有可被内切酶 I-SceI 识别的位点，从而诱导 DSB 的产生。本文描述了染色体外的 NHEJ 检测和 HR 检测方法，该方法涉及将 EJ5-GFP/DR-GFP 质粒、表达 I-SceI 的质粒以及表达 mCherry 的质粒共同转染至 HEK-293T 细胞中。通过流式细胞术计数 GFP 阳性细胞与 mCherry 阳性细胞的比例，即可获得 NHEJ 和 HR 效率的定量结果。与染色体整合型检测方法相比，这种染色体外检测方法更适用于对多个已建立的稳定细胞系进行比较研究。

引言

DNA双链断裂（DSB）是最具危害性的DNA损伤形式，若未及时修复，可能导致基因组不稳定、染色体重排、细胞衰老以及细胞死亡1。目前公认有两种有效的修复通路可应对DNA双链断裂，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）2,3。HR被认为是一种无错误的DSB修复机制，利用姐妹染色单体上的同源序列作为模板，恢复受损DNA分子的原始结构3。而NHEJ则是一种易错的DSB修复通路，它在无需模板的情况下直接连接断裂的DNA末端2。

NHEJ检测和HR检测是经典的实验方法，最初由纪念斯隆-凯特琳癌症中心Jasin实验室开发，分别用于定量分析NHEJ和HR的修复效率4,5,6,7。这些检测方法在研究与NHEJ和HR相关的机制及影响因素方面发挥着关键作用8,9,10,11,12,13,14。这两种检测均依赖于两个断裂的GFP报告系统——EJ5-GFP和DR-GFP，用以监测由I-SceI内切酶诱导的DNA双链断裂（DSB）的修复情况。其中，EJ5-GFP报告系统用于NHEJ检测，而DR-GFP报告系统则用于HR检测。每个报告系统均经过精细设计，使得I-SceI诱导产生的DNA双链断裂只能通过特定的修复途径修复，从而恢复GFP表达盒的功能4,5。

NHEJ检测和HR检测可采用染色体整合或染色体外方法进行15,16。染色体整合方法需要将断裂的GFP报告系统整合到基因组中，从而可在染色体环境中分析DSB修复过程6,15。然而，该方法需要长时间的细胞传代，且由于整合位点随机，除细胞系本身的固有差异外，还会引入额外的混杂因素，因此不适用于涉及多个细胞系的比较研究。在本实验方案中，我们描述了染色体外NHEJ检测和HR检测方法，即通过将断裂的GFP报告质粒和I-SceI质粒瞬时转染至HEK-293T细胞，随后进行流式细胞术分析（实验流程见图1）。这些非整合型报告系统最初由Jasin实验室报道，用于研究DNA链间交联修复16，并已被多个实验室用于评估NHEJ效率和HR效率9,10,11,12,13,14,17,18,19，包括我们实验室11。这些染色体外方法便于在涉及多个已建立的稳定细胞系的比较研究中分析DSB修复。

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方案

1. 质粒提取

  1. 按照标准转化方案20，将感受态E. coli转化以下质粒：EJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI（表达I-SceI的质粒）和PCI2-HA-mCherry（表达mCherry的质粒）（见材料表）。
    注意：PCI2-HA-mCherry可用其他表达mCherry或DsRed的质粒替代。
  2. 将转化后的E. coli在500 mL液体LB培养基中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，于37 °C振荡过夜。
  3. 按照生产商说明书，使用市售的无内毒素大提质粒提取试剂盒分离质粒（见材料表）。
  4. 使用纳米微量分光光度计测定质粒浓度，并将质粒浓度调整至1 µg/µL。

2. 细胞准备与转染

  1. 在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养HEK-293T细胞。确保HEK-293T细胞或已建立的HEK-293T稳定细胞处于良好的生长状态。
    注意：冻存细胞在转染前应至少传代两次。
  2. 转染前一天，将HEK-293T细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，使次日细胞融合度约为60%。
  3. 转染当天，确认细胞融合度约为60%。进行NHEJ检测时，在6孔板中使用商用转染试剂（遵循制造商说明，参见材料表），向实验样本细胞共转染1 µg EJ5-GFP质粒、1 µg pCBASceI质粒和1 µg PCI2-HA-mCherry质粒。进行HR检测时，将EJ5-GFP质粒替换为DR-GFP质粒。
  4. 为FACS校准设置对照：留一孔细胞不进行转染，作为阴性对照；另取6孔板中的细胞，分别转染以下组合之一作为单色对照：(1) 1 µg EJ5-GFP（用于NHEJ检测）或1 µg DR-GFP（用于HR检测），同时加入1 µg pCBASceI，作为GFP单色对照；或(2) 1 µg PCI2-HA-mCherry，作为mCherry单色对照。

3. 通过流式细胞术分析GFP阳性与mCherry阳性细胞

  1. 转染后两天，使用荧光显微镜确认 GFP 和 mCherry 蛋白的表达。
  2. 转染后三天，从孔中移除培养基，用 PBS 洗涤一次，每孔加入 500 µL 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 5 分钟，使所有细胞从培养板上脱落。在此步骤及后续步骤中，均需避免细胞暴露于直射光线下。
  3. 每孔加入 500 µL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞，确保无可见细胞团块。
  4. 将每孔中的全部细胞转移至 1.5 mL 离心管中，于室温下以 1000 × g 离心 2 分钟。
  5. 小心用移液器吸除上清液，并用 1.0 mL PBS 洗涤一次。
  6. 再次小心用移液器吸除上清液，将细胞重悬于 500 µL PBS 中，转移至流式细胞术检测管中（见材料表）。
    注意：为获得最佳结果，建议在收获细胞后立即进行流式细胞术分析。若需延迟，细胞可在冰上保存数小时。
  7. 使用未转染的细胞（阴性对照）、EJ5-GFP/DR-GFP 细胞、pCBASceI 转染细胞（GFP 单色对照）以及 mCherry 转染细胞（mCherry 单色对照）对流式细胞仪进行校准。调节电压和补偿参数，以最小化 GFP 与 mCherry 之间的荧光溢出。
  8. 从每根管中采集并记录至少 10,000 个完整细胞。

4. 数据分析

注意：以下步骤使用 FlowJo 软件（参见材料表）分析 FACS 数据。类似的操作也可在其他分析软件中进行。

  1. 将所有 FACS 文件拖入仪表盘。双击其中一个文件以显示 FSC/SSC 图。
  2. 创建一个多边形门以选择完整细胞，排除左下角的碎片。将此亚群命名为 "Intact Cells"，并将该门拖至 "All Samples" 栏。使用 Next Sample 按钮逐一样本滚动，确保每个样本的设门恰当（图 2A）。
  3. 双击阴性对照样本（未转染细胞）的 Intact Cells 亚群以打开新图。将坐标轴更改为 FL1-H（x 轴，GFP）和 FL2-H（y 轴，mCherry）。
  4. 选择 Quad Gating 工具，点击阴性细胞群的右上极端区域（图 2B）。将四个矩形门拖至 "Intact Cells" 栏。使用 Next Sample 按钮滚动查看 GFP 单色对照或 mCherry 单色对照样本，确保设门适当，以区分 GFP 阳性或 mCherry 阳性细胞与阴性对照细胞（图 2C,D）。如有必要，微调象限设门，并将此设门应用于所有 "Intact Cells" 亚群。
  5. 点击 Layout Editor。右键单击代表性图谱，选择 Copy to Layout Editor。选中所有代表性图谱后，双击打开 Graph Definition。根据需要调整坐标轴标签、注释和图例。
  6. 实验样本中 mCherry 阳性细胞的百分比作为转染效率的对照。通过比较同一图谱中 GFP 阳性细胞数量与 mCherry 阳性细胞数量，计算相对 DNA 修复效率。

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结果

为确保非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）分析的准确性，必须进行适当的补偿调节并采用合理的设门策略。通常情况下，使用530 nm滤光片时，mCherry荧光不会出现在GFP检测通道中。然而，当细胞中GFP表达水平极高时，使用575 nm滤光片可能导致GFP荧光信号渗入mCherry检测通道。为解决这一问题，实验中使用了阴性对照、GFP单色对照和mCherry单色对照样本进行补偿调节，并优化设门策略。对照细胞的典型流式细胞术结果如图2所示。补偿调节和设门策略应使大多数GFP阳性细胞位于右下象限（图2C），而大多数mCherry阳性细胞位于左上象限（图2D）。

最终的代表性结果图见图3A、B。在I-SceI诱导产生DNA双链断裂（DSB）后，成功的修复事件将重建GFP基因。因此，GFP阳性细...

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讨论

本文所述方法已在多篇论文中用于评估NHEJ效率和HR效率9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。该方法适用于阐明DNA双链断裂（DSB）修复的潜在机制，并鉴定与NHEJ和HR相关的新因子。例如，通过应用这种染色体外方法，已揭示或验证了DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）9、coilin相互作用核...

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披露

不存在需要披露的利益冲突。

致谢

本研究由黑龙江省自然科学基金（YQ2022C036）和齐齐哈尔医学院研究生创新基金（QYYCX2022-06）资助。图1使用MedPeer制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 cm 培养皿 BBIF611202-9001
6 孔板Corning3516
氨苄青霉素BeyotimeST007工作浓度：100 μg/mL
DH5α 感受态细胞TIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi 质粒 提取试剂盒TIANGENDP117可使用其他无内毒素质粒提取试剂盒
FACS 管FALCON352054
胎牛血清CLARKFB25015
流式细胞仪BD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestar可使用其他分析软件
HEK-293T 细胞国家实验细胞资源共享平台1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015可使用其他转染试剂
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477表达 I-SceI 的质粒
PCI2-HA-mCherry可使用含有 DsRed 的其他质粒
胰蛋白酶Gibco25200-056

参考文献

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
  3. Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
  4. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
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  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
  7. Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
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  17. Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
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  20. Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
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