通过反应性充血期间的近红外光谱法评估下肢血管功能

摘要

本文介绍一种利用近红外光谱技术无创评估下肢反应性充血的方法。该方案可对血管及微血管反应性进行标准化评估，可用于判断是否存在血管功能障碍，以及评估治疗干预措施的有效性。

摘要

下肢血管疾病对人类健康造成了重大影响 心血管疾病及其共病（如糖尿病）的全球负担。重要的是，微血管功能障碍可能在大血管病变发生之前或同时出现，二者均可能对患者的症状和疾病负担产生影响。本文介绍一种在反应性充血期间使用近红外光谱技术（NIRS）的非侵入性方法，可对下肢血管（功能障碍）进行标准化评估，并有望用于治疗干预效果的评价。与对比增强超声等其他方法不同，该方法无需静脉穿刺或复杂的图像分析，具有成本低、操作者依赖性小的优点。本文对NIRS方法的描述包括代表性结果、标准术语，以及对测量注意事项、局限性和替代方法的讨论。本研究的未来应用将有助于提高血管研究设计、数据采集流程和报告标准化水平，从而增强下肢血管（功能障碍）、疾病及治疗领域转化研究的成果。

引言

心血管疾病（CVD）是全球死亡率的首要原因¹。尽管心肌梗死和脑卒中是CVD最常见的表现形式，但下肢血管疾病（如外周动脉疾病（PAD）和糖尿病足病）也显著加重了CVD对个人、社会以及医疗系统的负担^2,3,4。重要的是，这些疾病状态的特征是微血管和大血管功能障碍⁵，可导致症状（例如间歇性跛行）、功能受损、活动能力下降，以及社会孤立和生活质量降低⁶。传统上，上肢血管评估技术被用作系统性血管功能及相关心血管风险的衡量指标；然而，这些方法可能对下肢局部血管功能障碍的检测不够敏感^7,8。尽管目前已有多种用于评估下肢血管功能的技术，如血流介导的血管扩张（FMD）和对比增强超声，但每种方法均存在缺点和局限性，例如设备成本高、操作者技术要求高，或需要侵入性静脉通路。因此，亟需建立标准化且有效的技术，以更便捷地在科研和临床环境中评估下肢血管（功能障碍）。

连续波近红外光谱法（CW-NIRS）是一种无创、低成本且便携的方法，可定量检测体内血红蛋白氧合的相对变化。in vivo。由于NIRS检测的氧合与脱氧血红蛋白信号来源于直径较小（<1 mm）的血管，因此可用于评估局部骨骼肌代谢和微血管功能⁹。具体而言，组织饱和度指数（TSI）[TSI = 氧合血红蛋白 /（氧合血红蛋白 + 脱氧血红蛋白）× 100] 可提供组织氧合的定量指标⁹。在缺血阻断及反应性充血前后测量TSI的变化，可反映相对于阻断前基线的“终末器官”血管反应性。重要的是，该方法对与衰老¹⁰、疾病进展¹¹以及临床干预（例如血管重建手术^12,13或运动康复^14,15,16,17）相关的肌肉微血管反应性和灌注变化具有敏感性，适用于存在或有微血管功能障碍风险的个体。

近红外光谱（NIRS）系统的普及导致报告微血管功能的研究数量迅速增加¹⁸。然而，反应性充血 检测方案存在差异，NIRS方法缺乏详细且可重复的描述，以及NIRS反应参数在描述、呈现和分析方面缺乏统一标准，使得不同研究之间的比较十分困难。这限制了数据的汇总以进行荟萃分析，也阻碍了临床评估建议的制定^9,15。

因此，本文介绍了我们实验室用于评估下肢反应性充血的标准化近红外光谱（NIRS）和血管闭塞测试方案。通过推广这些方法，我们旨在促进数据采集流程的标准化和可重复性，以及报告方式的统一。

方案

本文所述所有方法均已获得阳光海岸大学人类研究伦理委员会的批准。此外，所有参与者均签署了书面知情同意书，同意参加本方案中所述的测量。请注意，对于既往接受过涉及股动脉或腘动脉血管移植或支架植入血管重建手术的个体，下肢血管阻断测试是禁忌的。在准备好设备后，指导受试者仰卧休息10分钟。此时开始近红外光谱（NIRS）数据采集，初始采集2分钟，以确保NIRS信号达到稳定状态。随后采集1分钟的基线数据，紧接着迅速充气位于大腿处的袖带，以实现动脉阻断。阻断持续5分钟后，迅速放气。在反应性充血期间，数据采集持续进行，直至信号恢复至基线水平。图1展示了反应性充血方案的概览，详细步骤如下所述。本研究所用设备列于材料表中。

图 1：近红外光谱反应性充血测量方案及时间安排示意图。 NIRS：近红外光谱法。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 仪器准备

注意：可使用多种近红外光谱（NIRS）、袖带充气/阻断及数据采集系统来获得下述代表性结果。研究人员应查阅各自设备的具体使用手册，并注意特定软件、校准、环境光以及受试者/队列相关的特殊事项。

1. 确保所有测量均在安静、温度受控的房间（21-23 °C).
2. 确认所有设备和材料（参见 材料清单) 是可获得的。
3. 确保 CW-NIRS 设备及其连接的计算机均已充满电并已开机。
4. 检查近红外光谱设备是否已与显示近红外光谱数据的计算机配对 通过 蓝牙，且根据实验地点和研究设计定义NIRS设备的测量参数（示例：定义近红外光的微分路径长度因子（DPF））。
   注意：近红外光谱（NIRS）检测的大部分操作步骤和系统设置均基于设备制造商的建议、研究人员的经验以及专家共识。需注意，测量过程中所得数值取决于所使用的特定设备、探头类型以及设备软件中的参数设置。此外，采集到的信号可能存在较大的个体间差异。为进一步提高不同研究之间的可比性，在发表这些测量结果时，应详细报告NIRS仪器的具体信息（例如探头设计、光源-探测器间距、所用波长）、系统设置、探头相对于肌肉解剖结构的位置/方向，以及数据分析参数和数据处理方法。
5. 根据NIRS设备软件的具体要求输入参与者的数据。
6. 将快速充气泵连接至气源和电源。

2. 受试者准备

1. 确保受试者已阅读受试者信息说明和知情同意书，并在开始测量前签署同意参与测量。
2. 向受试者说明测量过程中可能出现的情况，同时让其脱去鞋袜，并保持静止，以便进行相关的人体测量。
3. 在计划的近红外光谱（NIRS）测量部位（例如，小腿最大周径处的内侧区域）进行皮褶厚度测量（重复三次）。
   注意：这有助于确认皮肤与脂肪组织的厚度（通常称为脂肪组织厚度，ATT），以评估其与NIRS信号穿透深度的关系。也可使用超声测量脂肪组织厚度。需始终注意，NIRS信号/测量的穿透深度约为发射器与接收器间距的一半⁹。
4. 为最大限度提高信号质量，检查计划放置NIRS发射/接收探头的部位是否存在可能吸收光线的毛发，并在必要时通过剃除毛发进行处理。
   注意：若皮肤存在损伤（例如蜂窝织炎）或存在水肿，应评估测量的适宜性，因为这些问题可能影响信号质量、信号穿透深度/测量所来自的组织，以及受试者伤口的无菌状态。
5. 测量并/或标记NIRS探头计划放置位置与相关解剖标志（例如内侧髁上表面）的相对位置，以确保在不同受试者之间及同一受试者内部探头放置的准确性（取决于研究设计和探头设计/形状），因为不同肌肉之间甚至同一肌肉不同区域的氧合反应可能存在显著异质性。
6. 要求受试者仰卧于检查台或床上，随后静息10分钟。
7. 在膝关节近端的大腿处放置一个袖带，确保管路不与小腿或NIRS设备接触（图2）。
8. 用泡沫支撑物将下肢抬高约10 cm，使足部和踝关节置于其上，保持小腿稳定且便于测量（图3）。
   注意：若需在多次测试中对双侧下肢进行测量，测试顺序应在首次测试前随机化，并在后续每次评估中对每位受试者保持相同的测试顺序。
9. 打开快速充气装置模块。
   注意：确保快速充气装置的模式和压力设置符合制造商说明书及血管阻断方案的具体要求。
10. 打开袖带充气装置的气源，检查气体是否能通过管路，并将管路连接至大腿袖带。
11. 确保袖带充气装置的管路仍未与小腿接触。
12. 将NIRS发射/接收探头牢固地固定在测量部位（通常为腓肠肌内侧区域；但根据研究设计和受试者具体情况，也可选择足背或胫骨前肌等其他部位）的皮肤上。
    注意：部分NIRS系统支持同时进行多部位测量。
13. 用黑色肌内效贴布或类似材料覆盖探头，注意密封边缘，防止环境光影响NIRS信号质量/数值（图3）。
    注意：固定探头及粘贴覆盖物时，应避免探头移动，但切勿压迫皮肤/脂肪组织/肌肉。

图 2：大腿部位止血带放置示例。 （A）俯视图。（B）侧视图。请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：近红外光谱探头放置位置示例。（A）探头固定于腓肠肌内侧部已剃除毛发的皮肤上。（B）踝关节置于泡沫支撑物中以方便操作并确保稳定的探头放置状态。（C）环境光屏蔽装置已就位。请点击此处查看该图的高清版本。

3. 基线数据采集

1. 要求受试者保持放松，不要说话，并在整个数据采集过程中保持腿部静止。
2. 启动近红外光谱设备记录 通过 计算机界面
   注意：如果启用了首选的离线数据采集，请直接启动 NIRS 设备。
3. 在开始测量之前，至少采集 2 min 的数据，以确保在数据采集前达到稳态信号。
4. 监测计算机屏幕，以确保数据信号的完整性和生理学上合理的数值。例如，数据采集（DAQ）值可提供有关信号质量以及近红外光谱（NIRS）设备检测到的环境光强度的信息。在整个测量过程中，这些值应保持在可接受的范围内。
5. 如果2分钟后仍未观察到近红外光谱（NIRS）信号的波动（例如由于运动伪影所致），请按下计算机/设备/同步单元上的相应按钮，设定NIRS数据基线。该基线代表测量的比较起点，氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白的变化将相对于此基线进行解读。
   注意：在数据采集过程中，插入基于软件的事件标记，以标明特定里程碑，例如基线期的开始与结束、袖带阻塞的开始与结束等，以辅助后续数据分析。
6. 至少采集1分钟的基线数据，并确保在此期间无任何波动或运动伪影产生。
   注意：基线数据的波动会影响某些潜在变量的解释，例如充血储备（参见代表性结果部分）。

4. 血管闭塞

1. 在切换到袖带模式（或其它系统的相应设置）之前，将快速充气装置的袖带压力设定为 200 mmHg。
   注意：尽管一些研究者建议在大腿部位充气至 250 mmHg^9,19，但根据我们的经验，部分受试者对此耐受性较差，可能导致测量中断。对于大多数受试者群体而言，充气至 200 mmHg 已足以在静息状态下完全阻断动脉血流，同时具有较好的耐受性，且不会引起皮肤瘀斑。为确保在 200 mmHg 时实现有效阻断，我们团队常规联合使用应变容积描记法与近红外光谱技术，以确认充气期间下游血流确实停止。
2. 向受试者说明在袖带充气至 200 mmHg 并维持 5 分钟、随后完全放气的过程中可能产生的感觉（如不适感、刺痛感等）。再次提醒受试者在整个数据采集期间保持放松、避免说话，并保持腿部静止不动。
   注意：据我们观察，阻断开始后的前 30–60 秒是受试者感觉最不适的阶段。当受试者让腿部完全放松时，通常会感觉阻断更易耐受。
3. 准备开始袖带充气时，在近红外光谱仪器软件中标记基线期的结束。
4. 将大腿袖带充气至高于收缩压的压力，通常为 200 mmHg；在极少数 200 mmHg 无效的情况下，可选择充气至 220 mmHg。
5. 在阻断期间，持续监测计算机或屏幕，以确保数据的完整性。
6. 当接近 5 分钟袖带阻断结束时，提前告知受试者在袖带放气后约 3 分钟内仍需尽可能保持腿部静止，并避免说话（此期间正在采集反应性充血引发的血管反应数据）。
   注意：此提醒非常重要，因为在血流恢复过程中，受试者可能会因缓解不适而产生移动肢体的冲动。

5. 反应性充血

1. 股动脉阻塞5分钟后，迅速将大腿袖带完全放气至0 mmHg。同时，在近红外光谱（NIRS）软件中标记阻塞期结束。由于血流恢复及相关因素引起的反应性充血反应将在NIRS软件显示中可见（图4）。
2. 阻塞结束后至少3分钟，或 alternatively，在NIRS数据恢复至基线水平后，在NIRS软件中标记恢复期结束并停止测量。
   注意：恢复期的持续时间部分取决于所研究的科研或临床问题，因此也取决于所选择用于分析的具体NIRS参数，以及是否同时进行其他测量（如内皮依赖性血管舒张功能FMD），后者可能需要更长的恢复时间。
3. 启动数据保存，并导出NIRS结果以进行后续数据处理与分析。

6. 随访程序

1. 从受试者身上取下近红外光谱（NIRS）设备及袖带。
2. 如有需要，按照制造商说明及相关卫生标准清洁近红外光谱（NIRS）设备（及阻断袖带）。
3. 检查近红外光谱（NIRS）设备，确保发射器/接收器的完整性以及电池性能，以保障后续测量的正常进行。

结果

近红外光谱法
连续波近红外光谱设备测量含氧（O₂Hb）和脱氧血红蛋白（HHb），可反映局部 O₂ 递送与利用 通过 发光光源与光电探测器，设定为特定间距。发射波长范围约为700 nm至850 nm的光，对应于O₂Hb的吸收峰波长。₂Hb 和 HHb。当近红外光穿透骨骼肌后，光的散射和吸收程度取决于其波长。骨骼肌是一种非均质组织，因此光在其中传播时的散射系数、吸收系数以及实际光程长度无法精确量化。因此，连续波近红外光谱（CW-NIRS）技术采用修正的朗伯-比尔定律，该定律引入了微分光程因子（DPF），从而能够估算 O₂Hb 和 HHb 的相对浓度。₂Hb 和 HHb 的计算。此外，O₂Hb 和 HHb 是由连续波近红外光谱（CW-NIRS）导出的指标，包括总血红蛋白（THb = O₂Hb + HHb），反映血容量/总信号强度的指标，以及组织饱和度指数（TSI = O₂Hb / (Hb + HHb)）₂Hb/THb*100)。组织...

讨论

本文概述了使用连续波近红外光谱（CW-NIRS）组织饱和度指数（TSI）评估下肢反应性充血以评价微血管功能的标准化操作流程。该方案通过研究袖带阻断持续时间对反应幅度的影响、反应性充血期间NIRS的重复性测试可靠性，以及NIRS与其他微血管评估方法（如对比增强超声）之间的一致性而得以优化^23,24。较长的袖带阻断时间对应更低的TSI_MIN²³，如图8和图9所示，反映出更强的缺血刺激。与1分钟和3分钟的袖带阻断相比，5分钟阻断后反应幅度更大，表明对更强低氧刺激产生了更显著的血管舒张反应。在针对特定程度缺血刺激进行研究时，这些因素尤为重要；例如，当采用固定阻断时间时，TSI_MIN的差异已被发现与年龄相关²⁵。此外，已有研究采用5分钟袖带阻断时间，证实了NIRS获取的阻断后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
袖带充气器气源	Hokanson	AG101 AIR SOURCE
弹性自粘绷带	MaxoWrap	18228-BL	用于遮蔽环境光
OxySoft	Artinis	3.3.341 x64
PortaLite（近红外光谱仪）	Artinis	0302-00019-00
PortaSync MKII（远程控制装置）	Artinis	0702-00860-00	用于在测量过程中标记关键时间点
快速袖带充气器	Hokanson	E20 RAPID CUFF INFLATOR
大腿袖带	Hokanson	CC17
透气胶带（外科用）	3M	1527-1	用于将探头固定于皮肤