方法文章

从幼虫到幼鱼阶段无菌斑马鱼模型的建立、维持与鉴定

DOI：

10.3791/66512

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2024年4月12日

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1School of Public Health, Chongqing Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了获取无菌（GF）鱼类胚胎并将其从幼虫期饲养至幼鱼阶段的主要步骤，包括取样及检测其无菌状态。在研究微生物对宿主健康作用的过程中，利用无菌模型进行感染实验具有重要意义。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于斑马鱼与哺乳动物具有基因组相似性，其胚胎在相对洁净的卵膜环境中发育且透明，幼体发育速度远快于啮齿类模型，因此成为研究生长、免疫和肠道微生物群的宝贵模型。Danio rerio的无菌（GF）斑马鱼对于评估污染物毒性以及建立与微生物功能相关的人类疾病模型至关重要。与常规饲养（CR）模型（即普通养殖条件下的鱼类）相比，无菌斑马鱼可更精确地操控宿主微生物群，有助于确定微生物与宿主之间的因果关系，因此在深化对这些关系的理解方面发挥着关键作用。然而，由于免疫功能和营养吸收能力的限制，目前无菌斑马鱼模型通常仅在早期生命阶段（从胚胎到幼体）进行构建和研究。本研究优化了无喂养及长期喂养无菌食物（如卤虫 Artemia sp.）条件下早期无菌斑马鱼模型的构建、维持与鉴定方法。在整个过程中，通过平板培养和16S rRNA测序等多种检测手段进行每日取样与培养鉴定。记录了无菌率、存活率及发育指标，以确保所构建模型的质量与数量。尤为重要的是，本研究详细介绍了针对无菌鱼的细菌分离与感染技术，使得在无菌食物支持下，能够高效地将无菌鱼模型从幼体阶段延续至稚鱼阶段。通过在生物医学研究中应用这些操作流程，科研人员可更深入地理解肠道细菌功能与宿主健康之间的关系。

引言

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微生物群（即Archaea、Bacteria、Eukarya和病毒）通过在肠道屏障、上皮表面以及黏蛋白功能中与宿主的共生相互作用，影响生理和病理过程，在维持宿主健康及多种疾病的发生发展中发挥关键作用1,2,3。从婴儿期、青少年期、成年期到衰老阶段，不同生命时期的微生物群组成，以及其在鼻腔、口腔、皮肤和肠道等不同部位的分布，均受到多种生境和环境因素的动态塑造4。生物体内的肠道微生物群参与营养吸收、免疫应答、病原体入侵防御、代谢调控等过程5,6。针对患者的研究所表明，肠道微生物群的失衡与人类肥胖、睡眠障碍、抑郁症、炎症性肠病（IBD）、神经退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默病）、衰老以及多种癌症相关7,8,9。此外，既往利用小鼠和鱼类模型的研究发现，肠道微生物群与宿主之间的相互作用通路涉及炎症因子、神经递质、代谢产物、肠道屏障及氧化应激等机制10,11。

近年来，在临床和动物模型中，已探索了多种与细菌相关的方法或疗法（包括潜在的益生菌和粪便微生物群移植（FMT））用于治疗这些疾病。这些探索基于微生物群-肠-脑/肝/肾轴、微生物群衍生产物以及受体活性改变等方面的发现12,13。然而，由于微生物群落的复杂性以及构建强有力的人类疾病模型所面临的挑战，微生物群-宿主系统的发育过程、多种功能及其作用机制仍未被完全阐明和认识。

为了解决这些问题，无菌（GF）动物模型在20世纪中期被紧急提出th 世纪，并主要在20世纪发展完善th 世纪。随后的改进包括使用抗生素处理和已知菌群模型，以及微生物检测与观察技术的进步，进一步完善了这些模型14,15,16无菌动物通过消除自身背景微生物并避免环境微生物的干扰，为研究微生物与其宿主之间的相互作用提供了优良的策略17通过应用动物模型和优化的实验方案，研究人员已成功在无菌小鼠和鱼类中复制出与患者相似的微生物组成。此外，其他无菌动物模型，如狗、鸡和猪，也为研究提供了多样化的实验对象选择。18,19,20,21该方法已推动了对共生微生物组在多种疾病中潜在治疗作用的研究，包括人体癌症免疫治疗16,18无菌动物模型能够更准确地揭示特定细菌在宿主内的定植、迁移、增殖及相互作用的特征与机制，为微生物群相关疾病的发生与发展提供重要的新见解。22,23从2004年Rawls等人和2006年Bates等人的报告，到2017年Melancon等人的实验方案，无菌斑马鱼在微生物研究中的建立与应用历史不断发展。16,24,25然而，成年或可繁殖的无菌动物模型的建立仍然是一个耗时较长的过程，伴随着寿命差异、成功率波动以及健康方面的挑战。

在各种动物模型中，斑马鱼（Danio rerio）因其在器官结构和基因组方面与人类具有高度相似性、发育周期短、繁殖力高以及胚胎透明等优势，成为基础研究和生物医学研究中的重要工具19,26。斑马鱼作为可靠的人类疾病模型，能够在体内直观呈现生理与病理过程，有助于深入理解宿主-微生物相互作用的特征。值得注意的是，斑马鱼具有明确的细胞谱系，可用于成像观察肠道生理、微生物动态、性腺与生殖发育、宿主免疫系统的成熟过程、行为以及代谢活动27。斑马鱼胚胎在受精后被保护性绒膜包裹，直至孵化，于受精后3天（dpf）发育为幼鱼。它们在5 dpf时开始主动捕食，并在受精后约3个月（mpf）达到性成熟28。Rawls 等人首次成功培育出无菌（GF）斑马鱼24，研究发现，在卵黄吸收后喂食高压灭菌饲料的幼鱼，自8 dpf起出现组织坏死，并在20 dpf时全部死亡。该结果揭示了饲料因素的影响，也提示在长期（>7 dpf）无菌鱼实验中需充分考虑外源性营养供给的重要性29。后续研究通过采用无菌饲料以及在不同鱼类模型中优化的方法，进一步改进了无菌鱼的制备流程16。

然而，目前关于无菌斑马鱼模型的研究主要集中在早期生命阶段，通常在受精后5天（5 dpf）进行24至48小时的细菌感染，并在实验结束前（即7 dpf之前）采集样本25,30,31。普遍认为，包括人类和斑马鱼在内的生物体，其微生物群在生命初期即开始定植，并在生长发育过程中逐步形成。成体阶段微生物群组成趋于稳定，且其在宿主一生中的作用至关重要，尤其在衰老、神经退行性疾病、代谢相关性肥胖以及肠道疾病等方面尤为突出3。因此，通过具有较长存活期的无菌动物模型，有助于深入理解微生物在宿主器官发育与功能中的作用机制，特别是考虑到鱼类幼体在早期生命阶段免疫系统和生殖系统尚未成熟。尽管先前研究已分离并鉴定了斑马鱼肠道中的细菌菌株，为利用无菌动物模型筛选益生菌或研究细菌在宿主体内的功能提供了可能19,25，但无菌鱼模型的构建与应用仍主要局限于早期生命阶段。这一局限性主要归因于复杂的制备流程、高昂的维持成本以及与营养供给和免疫相关的技术难题，从而制约了针对微生物群在宿主体内发育性及慢性效应的研究进展。

鱼类的存活率、行为、生长、成熟及整体健康状况，尤其是在无菌（GF）模型中，受到摄食方式的显著影响，包括从早期仔鱼到幼鱼开口期的营养摄入与吸收32,33。然而，无菌鱼类养殖面临的一个挑战是缺乏合适的无菌饲料，这限制了营养支持在维持仔鱼生长和存活方面的有效性。解决这一问题对于恢复无菌鱼的生命活动至关重要，因为这些鱼类由于缺乏肠道微生物组，其发育过程中的防御机制较弱，消化能力也较差。在饲料选择方面，活体卤虫（Artemia sp.）被证明是从开口期仔鱼到幼鱼阶段最适宜的饲料。研究表明，以活体卤虫喂养的鱼类比以煮熟的蛋黄或其他天然或合成饵料喂养的鱼类具有更高的生长率和存活率34。尽管无菌鱼的早期生命模型可以依赖卵黄维持生存，且无菌仔鱼模型可通过无菌喂养进行维持，但要建立从仔鱼到幼鱼的长期模型并实现性成熟仍具挑战性。此外，片状或粉状饲料受限于营养成分不均，且可能影响水质。相比之下，活体Artemia具有诸多优势，例如可在海水和淡水中存活、体型小适合从仔鱼到成鱼各阶段摄食、易于批量培养以及具有较高的孵化质量35。在先前方法16,24,30的基础上，我们简化了复杂的处理流程，并通过建立易于孵化的无菌活体Artemia sp.，解决了饲料难题，使其可作为无菌鱼在早期之后更长时间内的无菌食物来源。

本研究提出了一种优化的实验方案，涵盖（1）无菌斑马鱼的制备、（2）维持、（3）无菌率鉴定，以及（4）无菌饲养管理，以确保无菌（GF）斑马鱼从胚胎发育至幼虫和幼鱼阶段的正常生长。研究结果提供了关于GF斑马鱼孵化率、存活率、生长状况及无菌状态的初步证据，同时给出了以无菌Artemia sp.作为无菌饲料的关键指标。模型构建及无菌活体饲料制备的详细步骤，为建立和应用长期的无菌鱼类模型以及在微生物-宿主互作研究中使用无菌Artemia sp.提供了重要的技术支持。该方案还涉及在无菌鱼模型上进行细菌的分离、鉴定与感染操作，详细描述了细菌荧光标记的方法，并介绍了如何在显微镜下观察细菌在鱼类肠道内的定植过程。无菌鱼、定菌鱼（经细菌感染）或移植了人类菌群的模型将接受多种检测，以阐明其在宿主免疫、消化、行为、转录调控及代谢等方面的功能与影响。从长远来看，该方案可拓展至不同野生型鱼类物种，如海洋青鳉，甚至可能适用于其他与特定组织或疾病相关的转基因斑马鱼品系。

方案

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鱼类实验严格按照中国重庆动物护理与使用委员会以及重庆医科大学动物护理与使用委员会的指南进行，并遵循国家质量技术监督局发布的实验动物标准（批准号：GB14922-2001 至 GBT14927-2001）。斑马鱼（Danio rerio，野生型，AB 品系）来自中国科学院水生生物研究所，实验室饲养条件依照先前报道的方法进行36。

1. 成年斑马鱼的饲养与胚胎收集

注意：参考既往研究和报告的改进方法16,37,38,39，本实验室中成年斑马鱼的饲养、幼鱼培育以及无菌（GF）模型的建立均按照下述步骤进行。用于鱼类培养的超纯循环系统为商业获取（见材料表）。养殖用水经循环过滤，维持均衡的pH值、盐度和碱度，以确保清洁的培养环境。

  1. 在自动循环系统中按照以下标准流程饲养成年鱼类（参见 材料表暗:光 = 10 h:14 h 光照周期，28 °C ± 0.5 °C 条件下培养，并饲以新鲜培养的 卤虫 sp. 每日两次
  2. 将性成熟的成年斑马鱼（雄性:雌性 = 2:1）于前一晚放入盛有新鲜洁净水的养殖箱中。
  3. 让鱼在实验室常规光照刺激下于次日上午（约8:30）产卵。1–2小时后，将鱼转移至另一鱼缸中。
  4. 使用一次性巴斯德吸管，从自动循环系统中采集胚胎至培养皿的水中作为培养介质。

2. 从胚胎到幼鱼的无菌斑马鱼的制备

注意：无菌（GF）鱼类的制备流程见图1，传统（CR）和无菌（GF）模型的基本发育指标见补充图1。请在洁净室内的台式生物安全柜或层流罩中，采用无菌操作技术，按照以下步骤进行操作。

  1. 用鱼类培养水清洗胚胎，去除粪便杂质以及死亡或未受精的卵。
  2. 将2 hpf的胚胎转移至已灭菌的培养皿中（每皿直径10 cm，最多可容纳480个胚胎），加入含抗生素的无菌斑马鱼培养基（AB-GZM，参见材料表）溶液，在28.5 °C条件下培养6–8小时。
    注意：AB-GZM用于处理胚胎数小时以清除表面微生物，后续则使用不含抗生素的GZM培养无菌（GF）鱼。通常最佳培养时间为6小时。
  3. 剔除出现白色斑点或呈灰白色外观的卵，选择发育正常、具有透明且完整包膜的胚胎用于后续操作。
  4. 在10分钟内用AB-GZM清洗胚胎三次。
  5. 将胚胎浸入0.2 g/L聚维酮碘溶液（PVP-I）中1分钟（参见材料表）。
    注意：浓度过高或处理时间超过2分钟会影响胚胎的存活率和孵化率。
  6. 在10分钟内用无菌斑马鱼培养基（GZM）清洗胚胎三次。
  7. 将胚胎加入次氯酸钠（NaClO）工作液中，盖紧50 mL离心管，漂白处理15分钟。在此期间，通过轻轻摇动使胚胎悬浮于漂白液中。
  8. 在10分钟内用GZM清洗胚胎三次。
  9. 将胚胎转移至无菌6孔板中，每孔放入5个胚胎并加入10 mL GZM。在超净工作台或培养箱中，以黑暗:光照 = 10 h:14 h的光周期、28 °C ± 0.5 °C条件下进行培养。培养密度会影响无菌率。
  10. 每天更换培养基，移除用过的GZM并收集作为无菌状态检测样本，然后向每孔补充等体积的无菌GZM。
  11. 记录无菌（GF）胚胎/幼鱼的基本发育指标，包括存活率、孵化率、心跳次数、体长和体重等19。
  12. 将无菌鱼转移至合适容器（如培养皿、细胞培养瓶或带盖玻璃瓶）中，并扩大培养体积，在整个生长过程中提供无菌食物。

3. 从幼虫到幼鱼阶段无菌斑马鱼的维持

  1. 在7 dpf之前更换GZM但不喂食，并每日检测无菌状态（见步骤5）。
  2. 从8 dpf开始至幼鱼阶段，每天在更换GZM前用无菌蛋黄喂养斑马鱼幼体（每孔加入10 µL制备好的储存液）一次。
  3. 从14 dpf开始，每天用灭菌蛋黄混合无菌Artemia sp.喂养无菌幼鱼一次（每尾幼鱼1-3只Artemia，见步骤4），并随着无菌鱼的生长发育逐步增加食物量。
  4. 持续提供蛋黄直至所有鱼能够摄食Artemia nauplii。
    注意：使用前应对接种的无菌Artemia进行无菌检测。通过评估剩余Artemia nauplii的数量、观察追捕行为及摄食过程，并检查鱼体内是否有摄入的食物，以判断喂养是否成功。
  5. 从28 dpf至早期成鱼阶段，每天用无菌Artemia喂养一次（每尾幼鱼3-5只Artemia），并将未摄食或死亡的Artemia以及死亡个体清理至废弃GZM中作为日常样本。
  6. 在无菌鱼生长过程中，7 dpf后更换6孔板，在8至21 dpf期间使用无菌培养板或细胞培养瓶，21 dpf之后改用无菌瓶。根据每个容器中无菌鱼的数量和体重，相应增加培养基和食物量。
  7. 每天更换GZM，并检查样本以确保无菌模型构建成功。
    注意：维持无菌（GF）鱼模型至早期成年及性成熟阶段具有挑战性，在30 dpf时平均存活率较低，通常低于10%。这主要归因于免疫力低下、发育延迟以及肠道功能受损。

4. GF 的制备 卤虫 无节幼体 作为慢性无菌鱼模型的无菌食物

注意：无菌（GF）Artemia 的培养与制备方法如图2所示。需注意，以下所有步骤均在台式生物安全柜中进行，并采用无菌的无菌操作技术。

  1. 使用 2.4 g/L 次氯酸钠（NaClO，参见材料表）冲洗 0.25 g 的Artemia囊卵，持续 5 分钟。
  2. 用灭菌的超细滤网（孔径约 170 目）过滤已冲洗的Artemia囊卵，并用灭菌超纯水洗涤三次，每次 1–2 分钟。
  3. 将洗涤后的Artemia囊卵转移至 100 mL 的 2.5% 灭菌盐水中，混匀后进行无菌孵化包装，具体步骤如下所述。
  4. 将 50 mL 处理后的Artemia囊卵混合液装入体积为 100 mL 的无菌瓶中，用封口膜密封，在光照条件下，于 150 rpm、30 °C 的摇床中培养 18 至 24 小时。
  5. 使用一次性巴斯德吸管从孵化液的中下层吸取约 30 mL 孵出的Artemia nauplii。
    注意：防止未孵化的卵和空壳漂浮至表层。无菌（GF）Artemia囊卵及其孵化 24 小时后的nauplii指标见图3。
  6. 用灭菌滤膜过滤Artemia，并在灭菌烧杯中用灭菌超纯水洗涤三次，每次约 30 秒至 1 分钟。最后加入 4 mL 灭菌超纯水，制备Artemia混合液。
  7. 使用一次性巴斯德吸管从上层收集活跃游动的Artemia，洗涤后制备用于喂养和无菌鉴定的nauplii溶液。

5. 全生命周期中无菌鱼模型的鉴定

注意：在整个无菌（GF）鱼类的生命阶段中，关键指标和日常样本检测对于确保模型的成功至关重要。此步骤总结了样本的常见分类及常用的鉴定方法（图4）。

  1. 每日观察并记录无菌斑马鱼幼鱼的存活状态及存活率。在计算相关比率的实验中，将无菌鱼培养于24孔板或48孔板中，每孔一条鱼。
    1. 存活率 = （观察时存活鱼的数量 / 总卵数）× 100%。
    2. 无菌率 = （无菌鱼数量 / 存活鱼数量）× 100%。
      注：本方案重点关注存活鱼的无菌率。无菌鱼数量通过在存活鱼中多次检测后成功建立的无菌鱼模型数量来确定。在后续无菌操作过程中，任何死亡个体或因细菌污染导致建模失败的存活鱼模型均被剔除。
  2. 采集以下无菌斑马鱼幼鱼样本。
    1. 来自每个孔或瓶装容器的无菌斑马鱼培养液。
    2. 鱼饲料，如无菌蛋黄和无菌卤虫（Artemia）。
    3. 废弃培养液，包括孵化后残留的卵膜碎片，以及从幼鱼到稚鱼喂养期间的食物残渣或粪便。
    4. 死亡鱼体样本，用于检测是否存在细菌。
    5. 胚胎处理过程中使用的鱼用培养液及试剂，作为无菌对照。
    6. 来自实验材料、操作平台、培养箱等环境的样本。
  3. 采用多种方法对每日采集的样本进行检测。
    1. 首先，使用涂布平板法，并将培养平板置于30 °C培养箱中培养。
      1. 在需氧条件下，将20–50 µL废弃培养液样本涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板（见材料表）。
      2. 在厌氧条件下，将20–50 µL废弃培养液样本涂布于TSA平板。
      3. 在需氧条件下，将20–50 µL废弃培养液样本涂布于含血TSA平板（见材料表）。
      4. 在厌氧条件下，将20–50 µL废弃培养液样本涂布于含血TSA平板。
    2. 其次，使用液体培养法。
      1. 取200 µL样本加入含脑心浸出液肉汤（BHI）培养基的需氧管中（见材料表），在30 °C摇床培养箱中以150–180 rpm振荡培养。
      2. 将200 µL样本加入含BHI培养基的厌氧管中，在30 °C培养箱中培养。
      3. 将200 µL样本加入含胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基的需氧管中，随后在30 °C摇床培养箱中以150–180 rpm振荡培养。
      4. 将200 µL样本加入含TSB培养基的厌氧管中，在30 °C培养箱中培养。
    3. 第三，采用分子生物学技术——16S聚合酶链式反应（PCR）检测。
      1. 使用两对引物27F与1492R，以及63F与1387R对废水样本进行分析（表1）。
        注：PCR预混液根据表2使用市售DNA聚合酶试剂盒（见材料表）配制，PCR仪程序设置参照表3。
      2. PCR程序完成后，通过1%琼脂糖凝胶电泳40检测扩增产物，在目标条带1465 bp（使用引物27F与1492R）或1324 bp（使用引物63F与1387R）处判断样本是否无菌。
  4. 记录并观察无菌检测结果，包括平板和液体培养基在24小时至3天及7天内的生长情况。若平板上无菌落生长且液体培养基无浑浊，则表明无菌模型构建成功。分别在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h观察并记录平板与液体培养基的结果。

6. GF 的鉴定 卤虫 在喂食无菌鱼之前的样本

注意：为检测无菌（GF）Artemia 样品（在喂食无菌鱼类前，这些样品是必不可少的活体饲料，见图4），请遵循以下步骤。

  1. 收集无菌 Artemia 模型样品。
    1. 未经处理的 Artemia 休眠卵。
    2. 经处理的无菌 Artemia 休眠卵。
    3. 孵化后的无菌 Artemia nauplii。
    4. 灭菌超纯水作为对照。
  2. 采用以下方法检测无菌 Artemia。
    1. 采用涂布平板法，将样品涂布于营养琼脂（TSA）平板和血营养琼脂（blood TSA）平板，在有氧和无氧条件下进行检测，于 30 °C 培养。
    2. 使用液体培养基，在有氧和无氧的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）及脑心浸液（BHI）试管中检测样品，于 150–180 rpm 摇床、30 °C 条件下培养。
    3. 采用 PCR 检测法，利用 16S 核糖体 RNA 靶基因引物 27F 与 1492R、63F 与 1387R（表 1）检测所采集样品中的细菌存在情况。反应体系与程序见 表 2 和 表 3。
  3. 记录结果：通过 1% 琼脂糖凝胶电泳40 检测 PCR 产物，观察目标条带大小是否为 1465 bp（使用引物 27F 和 1492R）或 1324 bp（使用引物 63F 和 1387R）。平板和液体培养基的检测结果可用于确认无菌 Artemia 在作为无菌鱼类饲料使用前的无菌状态。

7. 斑马鱼肠道细菌菌株的分离与鉴定

注意：为了探究肠道功能 体外 和 体内有必要从斑马鱼中分离细菌菌株，这些菌株也可作为潜在益生菌的物种来源，通过使用无菌动物进行感染筛选获得图5）。在本方案中，我们描述了获取肠道内容物的传统解剖方法，同时样本也可直接从活体麻醉的鱼中采集（数据未显示）。

  1. 选择健康的成年斑马鱼，并用无菌水清洗。在超净工作台中进行以下步骤。
  2. 使用 100 mg/L 的 MS-222 对鱼进行 5–10 分钟的麻醉。
  3. 用 75% 酒精处理鱼体表面。
  4. 解剖鱼的肠道，并用 TSB 或 BHI 培养基挤出肠内容物。
  5. 将肠内容物上清液分别接种于 TSA、血琼脂平板、TSB 和 BHI 培养基中，在有氧和厌氧条件下培养。
  6. 对细菌进行传代培养以获得信号菌株，并记录不同菌落的特征。
  7. 将细菌保存于含 30% 甘油的冻存管中，置于 -80 °C 保存。
  8. 随后通过基因组 DNA 提取和 PCR 测序鉴定肠道细菌。
    注意：细菌基因组 DNA 提取的主要步骤包括液体离心、RNase A 和蛋白酶 K 消化、乙醇抽提、洗涤以及溶解，可使用市售试剂盒并按照制造商说明书操作（见 材料表）。
  9. 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）和针对细菌与古菌数据库的局部比对搜索工具（BLAST）分析 16S 序列40,41（见 材料表）。
  10. 选取匹配度最高的细菌及其特征，用于在属水平上鉴定分离的肠道菌株。
  11. 使用市售试剂盒检测细菌菌株的代谢功能（见 材料表）。

8. 无菌斑马鱼肠道中细菌的荧光标记、感染与定植

注意：在感染无菌斑马鱼之前，需用染料标记分离出的细菌并进行计数，以实现对微生物定植与迁移的持续可视化观察。 体内 (图6).

  1. 选择在宿主中丰度较高、具有潜在益生作用的细菌或优势菌株，用于感染无菌（GF）鱼模型。
    注意：本研究使用的细菌为气单胞菌属（Aeromonas sp.）和弧菌属（Vibrio sp.）（见材料表），这些菌株系从实验室中从野生型成年斑马鱼体内分离并鉴定出的8个属中筛选获得42。
  2. 使用CM-Dil染料标记新鲜细菌（见材料表），并在5日龄（dpf）时以106-108菌落形成单位（CFUs）/mL的浓度暴露于无菌斑马鱼幼鱼。
  3. 在荧光显微镜下以3×放大倍数观察荧光信号，以指示细菌在无菌斑马鱼幼鱼肠道内的定植情况和分布状态，观察时间点为6 dpf至14 dpf。
  4. 通过平板培养法在每个时间点手动计数无菌鱼体内的细菌数量。
  5. 检测菌落形态及序列，确认目标菌株成功感染。
  6. 收集经细菌感染的无菌鱼样本，用于后续各项检测，包括神经行为学、发育指标、组织病理学分析及激素水平测定等43,44,45。
    注意：感染实验所用细菌应为新近复苏并经液体培养基新鲜培养的菌种。

结果

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利用斑马鱼配对后产生的大量卵可高效建立无菌（GF）斑马鱼模型，该方案基于先前的无菌鱼类模型进行了优化35。单个6孔板可培养约30–48枚胚胎/幼鱼，有利于充分收集数据并进行统计分析。经无菌处理后，无菌胚胎在洁净培养箱中培养至48–72小时孵化为幼鱼，并每日更换无菌培养液（GZM），同时检测所收集的样本，这对维持无菌状态至关重要（图1）。7日龄后，需为幼鱼向稚鱼阶段发育准备卵黄和活体丰年虾（Artemia）作为食物。在鱼类生长发育过程中，应适时调节或更换GZM的体积、容器及培养密度，以避免死亡及无菌状态的丧失。若检测结果显示无细菌污染，成功的无菌模型可从稚鱼阶段持续维持至早期成鱼阶段作为慢性模型，但在实际操作中其存活率显著较低。最终，可通过检测无菌鱼与常规饲养鱼（CR）的无菌率、存活率、发育指标、行为学、组织病理学分析及转录谱，研究微生物群的影响及药物筛选领域相关问题。本研究比较了关键发育指标（补充图1），结果显示，无菌鱼在72小时的孵化率为60%，比常规饲养鱼低45.7%。在7日龄时，无菌幼鱼的心率为18.2次/10秒，显著低于常规饲养鱼的22.6次/10秒；但在14日龄时，两组间心率无差异，分别为23.5–23.8次/10秒。无菌鱼在7日龄时的存活率为86.7%，与常规饲养鱼相同，但在14日龄时下降至60%，而常规饲养鱼为80%。然而，在开口摄食期后，当鱼类获得摄食能力或形成摄食习惯时，无菌鱼和常规饲养鱼的存活率均下降至25%–10%。鱼类无菌状态的维持失败是导致存活率降低的原因之一。因此，从稚鱼到早期成鱼阶段的喂养与营养维持是鱼类培养中的关键挑战。

影响鱼类生长和发育的另一个关键因素是喂养。在本研究中，我们探索了多种获取无菌Artemia的方法，作为无菌斑马鱼从幼体到成体长期饲养的活体饵料（流程见图2）。由于无菌鱼类每日需投喂食物，因此无菌Artemia的优化方案在实际操作中应简便、省时且经济。通过比较显微镜下观察到的nauplii活动能力及其死亡/不动状态，以及nauplii、未孵化卵和卵壳的特征，对该方法进行了完善。每日孵化后，在显微镜下观察并测量从瓶中获得的新鲜无菌Artemia的各项指标，包括孵化率、存活率和畸形率，以及nauplii的体长和体重（图3）。经处理后，Artemia囊卵的孵化率较高，平均达88.15%，游动nauplii的存活率为77.83%，畸形率为1.87%。nauplii体长为546.70 µm，体重指数为3.80 mg/100，适合从幼体开口期至幼鱼及成鱼阶段的摄食与喂养。

检测无菌鱼类和无菌Artemia对于模型维持也至关重要。根据样本采集和多种检测方法，结果可反映经处理的斑马鱼胚胎和培养板及液体培养基中Artemia卵囊的处理是否成功（图4）。每日采集的各种样本在所有检测方法中均应显示为无菌状态，从而表明采集时无菌模型的有效性。在将无菌Artemia投喂给无菌鱼类之前，应对其进行检测；或者，培养板和培养基的孵育结果应能反映新鲜活体nauplii的无菌状态。具体方法是将无菌Artemia从卵囊开始，在TSA平板或TSB、BHI液体培养基玻璃瓶中通过振荡培养进行培育，该方法可同时用于制备无菌Artemia并验证其无菌性。无菌Artemia的制备方案仅能支持有限数量的幼体用于投喂。在投喂过程中，可明显观察到无菌Artemia在GZM中游动，随后被无菌鱼类幼体捕获并摄食。

GF鱼模型的应用涵盖生物学和医学的多个领域，可用于研究微生物功能、生长与发育、疾病机制以及益生菌或药物筛选等46例如，在本研究中，两种主要的肠道细菌， 气单胞菌属 sp. 和 弧菌属 sp. 从斑马鱼中分离得到。进行了菌落特征观察和鉴定，并测定了多种代谢功能。 体外 使用市售试剂盒（图5这些细菌通过16S测序进行分离和鉴定，其BLAST结果已在先前的报告中公布。42鉴定出的细菌菌株可通过感染无菌鱼模型，用于科学研究单一种或复合微生物群对宿主健康的影响。鱼 larvae 的透明特性使得利用 CM-Dil 荧光染料标记的细菌细胞可通过共聚焦显微镜观察，揭示细菌在无菌鱼肠道内的定植与分布情况（如图所示） 图6）。在5 dpf进行细菌感染后，可使用荧光显微镜对无菌斑马鱼幼鱼进行成像，并于6至14 dpf期间持续观察，从而结合微生物功能与发育指标、组织病理学变化及分子水平改变提供深入见解47.

斑马鱼胚胎处理示意图：消毒、培养条件、微生物检测流程。
图1：无菌斑马鱼从胚胎到幼鱼和稚鱼的实验方案。 无菌斑马鱼制备的关键步骤包括：（1）采集野生型斑马鱼的胚胎，并将其置于AB-GZM培养基中；（2）使用聚维酮碘（PVP-I）和次氯酸钠（NaClO）进行冲洗处理，以确保完全无菌；（3）将无菌胚胎/幼鱼在6孔板中用GZM培养基进行培养，每日更换培养液；（4）调控培养条件以实现最佳生长与发育；（5）在不同发育阶段取样，随后采用平板培养法和液体培养基法进行无菌检测。请点击此处查看该图的放大版本。

Artemia cyst preparation diagram with rinse, incubation, and GF nauplii solution process.
图2：无菌小鼠方案 卤虫 作为无菌鱼的活体饵料制备。 关键步骤包括：（1）冲洗处理 卤虫 囊以确保完全无菌。（2）在培养基中制备无菌囊。（3）在盐溶液中孵育24小时以促进孵化。（4）过滤未成功孵化的卵和空卵，收集活动的 无节幼体.（5）洗涤收集物 无节幼体 以去除杂质，确保获得高质量且无污染的活体饲料。（6）对无菌级（GF）进行无菌检测 卤虫 在喂食无菌鱼幼体之前。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Microscope image of pollen grains, various magnifications, scale bars indicating size in micrometers.
图3：GF的指数 卤虫 囊肿和 无节幼体 孵育24小时。 (A未处理 卤虫 带有杂质膜的囊肿（比例尺：500 µm）。(B) 处理后的 卤虫 吸水后表面略呈凸起且更清洁的包囊（比例尺：500 µm）。(C) 孵育后新鲜活体GF的显微镜检查 卤虫无节幼体 （比例尺：2000 µm）和（D) 放大倍数，标尺为 1000 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

微生物生长实验；试管、琼脂平板；细菌培养物、生化检测。
图 4：各生命阶段无菌鱼及无菌 Artemia 的无菌检测。（A）利用TSB和BHI液体培养基、TSA及血琼脂平板，在有氧和无氧条件下对常规饲养（CR）鱼和无菌（GF）鱼样品进行的无菌检测。（B）利用TSB和BHI液体培养基、TSA及血琼脂平板，在有氧和无氧条件下对未经处理的 Artemia 囊、无菌 Artemia 囊及其无节幼体（nauplii）进行的无菌检测。请点击此处查看该图的放大版本。

细菌培养、测序色谱图、系统发育分析表和比色法检测结果。
图 5：斑马鱼肠道细菌的分离与鉴定。 （A）细菌菌株、菌落特征及16S测序图谱（示例：Aeromonas sp. 和 Vibrio sp.）。 （B）属名及NCBI登录号。 （C）从斑马鱼肠道分离细菌的代谢功能。 请点击此处查看该图的放大版本。

Microbial growth, inoculation tubes, zebrafish fluorescence, growth curve chart, bacterial analysis.
图6无菌斑马鱼中肠道菌株的感染与定植 (A用于感染实验的分离与鉴定菌株的复苏B用荧光染料标记细菌，并感染5日龄的无菌斑马鱼幼鱼。放大倍数：1x。C) 观察细菌的分布与定植弧菌 肠道组织中的 sp. 体内. 放大倍数：3x。 (D) 细菌菌落形成单位（CFU）计数气单胞菌属 sp. 和 弧菌 通过每日取样测定每尾鱼幼体中的 sp.) 含量。数据以均值 ± 标准误表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

引物序列 (5’-3’)产物长度
27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG1465 bp
1492RACGGYTACCTTGTTACGACTT
63FCAGGCCTAACACATGCAAGTC1324 bp
1387RGGGCGGWGTGTACAAGGC

表1：用于细菌检测的引物。

组分单位体积 (µL)
Taq DNA polymerase2.5 U/µL0.1
10× Buffer(Mg2+)---2.1
dNTP Mixture2.5 mM1.6
Primer 27F10 µM1
Primer 1492R10 µM1
DNA/RNA free H2O---13.2
模板 DNA---1
总体积---20

表2：每反应组分的终浓度与体积。

步骤温度时间循环次数
初始变性95 °C4 min--
变性94 °C1 min35
退火55 °C1 min
延伸72 °C1 min
最终延伸72 °C10 min--
保存4 °C∞--

表3：扩增16S rRNA基因的PCR程序。

补充图 1：GF 和 CR 斑马鱼模型的关键发育指标。 （A）CR 和 GF 斑马鱼在 72 hpf 时的孵化率，以及（B）CR 和 GF 斑马鱼在 7 dpf 和 14 dpf 时每 10 秒的心跳次数。CR 和 GF 斑马鱼的存活率（%）从 7 天和 14 天时的 86%、60%–80% 下降至 30 dpf 时的 10%–25%。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Critical steps within the protocols of GF fish and GF food preparation
During the generation of GF fish models, several critical steps were involved, including the preparation of sterile materials, sterilization of embryos, daily renewal of GZM, collection of various samples, and the sterile examination of each sample using multiple methods. Among these steps, the initial treatment of embryos is fundamental and decisive for the success of GF models. Controlling agents, their concentrations, and treatment times are crucial for achieving optimal sterilization rates and hatching success. Careful attention is necessary when handling GF fish embryos to larvae, involving daily medium changes and ensuring that materials and platforms are thoroughly sterilized using ultraviolet light or autoclaving when removing plates from the incubator. Monitoring temperature conditions and operating time during winter is essential to prevent larval death caused by lower temperatures in clean benches.

Sterile egg yolk and GF Artemia should undergo detection before being fed to fish after 7 dpf to ensure their sterile state for long-term GF models. During the feeding period, cleaning food residues is important as part of the samples collected for detection when renewing the waste medium. The container, volume of GZM, and food mass should be adjusted along with the growth and development stages to prevent GF fish loss due to limited surroundings and water quality issues. Regular monitoring and adjustments in these parameters contribute to the successful maintenance of GF fish models.

Modifications and significance of these protocols
The simplified three-step process for generating GF zebrafish embryos, involving optimized agents, concentrations, and exposure times of AB-GZM, PVP-I, and NaClO solutions, ensures a high sterile rate and healthy development of models. Additionally, the sterile detection methods for daily samples have been perfected to include plates and liquid medium cultures under aerobic and anaerobic conditions, along with molecular techniques using common bacterial primers. Further experiences in testing for bacterial and fungal contaminants aim to optimize isolator contaminants and sterile testing during GF animal techniques48.

The specific protocol for GF Artemia nauplii as live food for fish models has been investigated in our study, and a patent was granted to PPJ and DSP by the China National Intellectual Property Administration (No. ZL202210482684.8). Long-term GF fish models are consistently constrained by inadequate and unsuitable nutrition, exacerbating weaknesses in gut functions related to digestion and absorption. As a credible food source for medaka and zebrafish models at different life stages, GF Artemia sp. should be easy to prepare with a simple procedure, short incubation time, and real-time sterile detection for daily use. In this method, normal Artemia cysts are rinsed in a sufficient concentration of NaClO to be aseptic and then incubated in a film-coated bottle, as well as on a plate and in a liquid medium for detection. This supports freshly hatching nauplii for GF fish feeding. The sterile rate and hatching rate of Artemia, as well as the body length, weight, and activity of, are excellent, indicating available applications in practice.

The significance of these modifications in GF fish and GF food protocols benefits researchers in generating models at embryos, larvae, juvenile stages, and even early adult and adult stages in marine and freshwater modeµspecies. Long-term GF animals will provide permission as in vivo models in research on drug screening and microbial functions during host growth and development, especially in the maturity of immunity and related intestinal cell lines. For example, zebrafish larvae only possess innate immunity in the first week, then develop the adaptive immunity system during 7-21 dpf, along with thymus maturity31,49. Moreover, GF fish models can provide the possibility to analyze bacteria-bacteria and microbiota-host interactions with live observation of dynamic colonization and migration processes in organisms50,51.

Limitations of the method
Culturing GF fish from juveniles to early adults (28 dpf-2.5 mpf) and sexually mature adults (>2.5 mpf) remains challenging due to increased mortality and the risk of bacterial contamination during model maintenance. These limitations primarily arise from the absence of suitable autoculture systems for fish living in a GF environment. These systems should include clean air, water, and a food system to effectively maintain the animals and their environments, ensuring complete isolation from external microorganisms. Unlike other GF animal models such as mice and chickens52, obtaining GF zebrafish through anatomical operations from the CR parents is challenging due to their aquatic habits and natural fertilization style.

Treating adult animals as completely devoid of intestinal microbiota is also challenging. While antibiotic treatment may induce a state similar to specific pathogen-free (SPF) animals, characterized by a reduced microbiota detected in fecal samples, achieving true GF adult fish models remains difficult. The challenges involved in establishing and maintaining GF models, especially during the transition from juvenile to long-term states, are significant. The importance of GF offspring, such as GF F1 or F2 eggs from adult GF fish, in microbial research is acknowledged. However, overcoming challenges in establishing and maintaining long-term adult GF fish models requires substantial time.

It's worth noting that gnotobiotic zebrafish with specific bacterial colonization has been developed, showing chronic survival based on GF models. Nevertheless, it remains uncertain whether these models can serve as viable alternatives to GF models in bacterial infection and biomedical research.

Future applications of GF fish models
In this study, we have refined the protocol for generating GF zebrafish models, progressing from embryos to juveniles. This advancement holds significant applications in developmental biology, immunology, human disease research, and organogenesis. Through mass isolation and identification, the study explores the functions, mechanisms, and gut-derived metabolites of single bacterial strains. The investigation involves infecting GF zebrafish models after the vent opens stage47,53. Additionally, labeled bacteria with fluorescence facilitate the observation of colonization and distribution in live GF larvae, free from other microbial influences54. Similar GF fish models, such as marine or freshwater medaka, can be created using comparable methods with various agents or medium changes.

To probe human disease mechanisms, the study employs FMT methods, transferring samples from patients or donors to healthy animals or GF models55. Unlike conventionally reared (CR) animals, GF models offer robust evidence of microbial functions, impacts, or responses in the host, particularly when combined with bacteriophages to regulate target bacteria in the microbiota46.

In summary, GF zebrafish serve as powerful models for assessing bacterial safety, drug effectiveness, pollutant toxicity, or compound interference, owing to their sensitive and pure intestinal environment. Future exploration of GF fish applications should encompass various fields, with a need to create adult GF fish models for a deeper understanding of microbial functions across different life stages.

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GF Artemia 的方案已获得中国国家知识产权局的专利授权，在获得作者许可后，该方法的使用限制将被解除。作者声明不存在其他竞争性或经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们衷心感谢重庆医科大学人才项目（编号：R4014 资助 DSP，R4020 资助 PPJ）、国家自然科学基金委员会（NSFC，编号：32200386 资助 PPJ）、重庆市博士后创新导师工作室（编号：X7928 资助 DSP）以及中国科学院中斯水技术研究与示范联合中心/中国科学院中斯教育与研究联合中心项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AB-GZM两性霉素：Solarbio；  卡那霉素：Solarbio；氨苄青霉素：Solarbio。两性霉素：CAS：1397-89-3；
卡那霉素：CAS：25380-94-0；氨苄青霉素：CAS：69-52-313。		49.6 mL GZM，50 µL 两性霉素储备液（250 µg/mL），25 µL 卡那霉素储备液（10 mg/mL），以及 250 µL 氨苄青霉素储备液（20 mg/mL）。
1.5 mL、15 mL、50 mL EP 管biosharpBS-15-M用于样品收集和试剂储存
2.4 g/L 次氯酸钠西陇科学股份有限公司CAS：7681-52-9用8%次氯酸钠水溶液稀释配制。
6孔板、24孔板、48孔板LABSELECT 11112用于鱼类培养
AeronomasNCBI数据库编号 MK1784992019-JPP-ESN
厌氧TSA平板胰蛋白胨：Oxoid；
大豆蛋白胨：Solarbio；氯化钠：Biosharp；
琼脂粉：BioFroxx。		胰蛋白胨：LP0042B；
大豆蛋白胨：货号 S9500；
氯化钠：BS112；
琼脂粉：9002-18-0。		在厌氧系统中，使用含6 g胰蛋白胨、2 g大豆蛋白胨、2 g氯化钠和6 g琼脂粉的400 mL培养基制备TSA平板。
厌氧工作站基因科学E200G用于细菌分离和无菌检测
数据分析GraphPad Prism 5v6.07用于数据分析
API 20 E试剂盒 法国生物梅里埃公司（BioMerieux SA）编号 1005915090Ref 20100试剂盒，用于检测细菌代谢特性
Artemia（卤虫）尚佳水族有限公司水大师品牌卤虫卵囊及卤虫卵 
鱼类培养自动循环系统宁波海瑞科技有限公司无货号用于维持鱼类生长
高压灭菌器Zeal WayG154DWS用于材料准备
需氧BHI培养基Coolaber货号 PM0640制备BHI培养基，其中每100 mL培养基含3.7 g BHI粉末。
厌氧BHI培养基Coolaber货号 PM0640制备BHI培养基，并在厌氧系统中分装至厌氧管中。
生化培养箱龙跃有限公司SPX用于鱼类和培养板的培养
生物安全柜海尔HR40-IIA2用于无菌处理和检测
0.02 g/L次氯酸钠漂白剂西陇科学股份有限公司CAS：7681-52-9工作液中次氯酸钠（NaClO）浓度：用8%次氯酸钠水溶液稀释，或取166.6 µL 6%次氯酸钠加至500 mL蒸馏水中。
血琼脂平板羊血：Solarbio货号 TX0030将无菌脱纤维羊血加入TSA培养基中，制备成含5%血的血琼脂平板。
细胞培养瓶Corning430639用于鱼类培养
CM-Dil染料Molecular Probes货号 C7000  用于细菌标记
恒温振荡培养箱培英有限公司HZQ-X100用于细菌培养
数据库NCBI细菌与古菌数据库链接：古菌FTP：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
细菌FTP：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
一次性巴斯德吸管biosharpbs-xh-03l用于换水和转移卵
一次性培养皿biosharpBS-90-D用于鱼类培养
DNA提取试剂盒Solaribio货号 D1600细菌基因组DNA提取试剂盒 
电动移液器SCILOGEXLevo me用于换水
ExiguobacteriumNCBI数据库编号 MK1785042019-JPP-ESN
GZM海盐：蓝得宝有限公司无货号由1 L水和1.5 mL海盐溶液（40 g/L）组成，经高压灭菌。GZM溶液中海盐含量为60 mg/L。
实验室纯水系统海泰克有限公司Prima-S15用于试剂制备
显微镜尼康SMZ18配备荧光光源，用于观察鱼幼体
PCR试剂盒天根货号 ET101Taq DNA聚合酶试剂盒
移液器LABSELECT sp-013-10用于换水
聚维酮碘（PVP-I）阿拉丁批号 H1217005聚维酮碘水溶液，含纯碘0.4 g/L。
定时控制器品宜有限公司AL-06用于调节光照
TSA平板胰蛋白胨：Oxoid；
大豆蛋白胨：Solarbio；氯化钠：Biosharp；
琼脂粉：BioFroxx。		胰蛋白胨：LP0042B；
大豆蛋白胨：货号 S9500；
氯化钠：BS112；
琼脂粉：9002-18-0。		使用含6 g胰蛋白胨、2 g大豆蛋白胨、2 g氯化钠和6 g琼脂粉的400 mL培养基制备TSA平板。
需氧TSB培养基胰蛋白胨：Oxoid；
大豆蛋白胨：Solarbio；氯化钠：Biosharp；		胰蛋白胨：LP0042B；
大豆蛋白胨：货号 S9500；
氯化钠：BS112；		制备TSB培养基，其中每400 mL培养基含6 g胰蛋白胨、2 g大豆蛋白胨和2 g氯化钠。
厌氧TSB培养基胰蛋白胨：Oxoid；
大豆蛋白胨：Solarbio；氯化钠：Biosharp；		胰蛋白胨：LP0042B；
大豆蛋白胨：货号 S9500；
氯化钠：BS112；		制备TSB培养基，并在厌氧系统中分装至厌氧管中。
超净工作台AirtechSW-CJ-2FD用于无菌处理和检测
鱼类培养用超纯水循环系统海洋生物设备公司无货号用于生产养鱼用水
VibrioNCBI数据库编号 MK1785012019-JPP-ESN

参考文献

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  18. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).">Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
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