在体外溶栓模型中通过剪切流追踪钱德勒环路法形成的全血凝块的纤维蛋白溶解过程

摘要

体外 溶栓实验常常难以复制 体内 条件，无论是在血栓模型被消化的过程中，还是在溶栓发生的环境中。在此，我们探讨如何将钱德勒循环系统（Chandler loop）与实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF）相结合 用于高保真， 离体血凝块溶解监测

摘要

血栓栓塞及相关并发症是全球范围内导致发病和死亡的主要原因，目前已开发出多种检测方法，用于评估溶栓药物的有效性 体外 和 体内对更符合生理相关性的需求日益增长 体外 用于药物开发的血栓模型，由于动物模型的复杂性和高昂成本，以及其结果往往难以转化为人类生理情况。血流、压力和剪切速率是循环系统的重要特征，流动条件下形成的血栓在形态和降解特性上均不同于静态条件下形成的血栓。这些因素在传统模型中常常未被体现 体外 血凝块消化实验，可能具有影响药物转化成功率的药理学意义。

的 Real-T时间 流感口部测量法 F低 F纤维蛋白溶解（RT-FluFF）检测是一种高保真血栓溶解测试平台，采用在剪切流条件下形成的荧光标记血凝块，并在有或无纤维蛋白溶解药物存在的情况下，利用循环血浆对其进行消化。通过调节血凝块形成和消化阶段的流速，该系统可在高度多样化的实验设置中模拟动脉、肺动脉和静脉环境。可通过在线荧光计连续测量，或采集离散时间点进行检测，亦可采用传统的终点血凝块质量测定方法。RT-FluFF检测是一种灵活的系统，能够在更真实地模拟生理流动条件的情况下，实时追踪血凝块的消化过程。 体内 生理条件下同时保持实验的可控性与可重复性 体外 测试系统

引言

由血栓栓塞性病因根本引起的疾病是当今社会发病率和死亡率的主要来源。血栓栓塞性发病机制的表现包括但不限于心肌梗死、缺血性卒中、深静脉血栓形成和肺栓塞¹。大量正在进行的跨学科研究集中在开发安全有效的病理性血栓处理方法上。由于血栓在动脉和静脉中的表现不同，且解剖位置各异，因而发展出了不同的治疗策略。然而，在急性期治疗中，通常依赖于通过纤溶酶原激活剂进行药物溶栓，而在某些临床情况下，可能辅以机械取栓术²。

新型药物治疗策略的开发从根本上依赖于用于临床前测试的体内动物模型和体外消化模型^3,4。体内模型的优势在于能够自然地反映多种生理参数对治疗效果的复杂相互作用，包括药物清除过程以及细胞与药物之间的相互作用。然而，这种复杂性本身常常导致模型成本高昂，并且在试图解析与人类生理显著不同的动物体内的药效动力学/药代动力学机制时，会引入额外的问题。体外模型的开发通过提供一个简化的测试环境，有助于药物的开发与筛选，但往往缺乏充分的保真度，难以准确重现所研究的疾病状态。

目前常见的体外（in-vitro）测试新型溶栓药物的方案通常依赖于在静态条件....

方案

以下提到的所有方法均符合机构审查委员会（IRB）协议以及机构人类研究伦理委员会的要求。所有健康志愿者在献血前均签署了书面知情同意书。需要注意的是，本方案中提及的所有材料均可在材料表中找到。尽管本方案主要讨论人全血（WB）和血浆，但也可购买并使用实验动物血液及因子缺乏的血液制品作为替代。

1. 全血采集

1. 采用标准静脉穿刺技术，从知情同意的健康志愿者处采集静脉全血（WB）。
   注意：在整个操作过程中，必须遵循通用预防措施，以降低接触血液或其他潜在传染性物质的风险。操作时需佩戴手套、实验服和面罩。
2. 将约 50 mL 全血直接采集至含 3.2% 枸橼酸钠的采血管中，并立即转移至 50 mL 管中混合，以供后续使用。
   注：在使用枸橼酸钠管采集血液前，应先弃去一管血液，同时确保采血管填充至制造商推荐的体积。新鲜采集的全血最能真实反映宿主的凝血动态。全血可在室温下短期保存（使用前 ≤4 小时），但不可过夜保存，因为已有研究表明，通过血栓弹力图检测时，过夜保存会影响凝血动态¹⁵。

2. 血栓形成

1. 在3 mL抗凝全血中加入荧光素（异硫氰酸荧光素 [FITC]）标记的纤维蛋白原....

结果

钱德勒环路血栓形成
在形成血栓时，我们通常制备四份重复样本，以确保即使存在个别血栓异常（基于宏观形态和质量判断），仍可进行三份重复的溶栓实验。在理想加样条件下，所形成的血栓在长度（约3.3 cm）、重量（约100 mg）和外观上应高度均一，如图3所示。当使用FITC-Fg时，我们还旨在通过紫外光下观察血栓，以确认荧光分布相对均匀，而非在血栓内部出现荧光标记过强的不规则区域。在我们研究的浓度范围内，全血中FITC-Fg的浓度变化不应影响血栓的重量或外观；然而，在最高浓度的FITC-Fg（1:5 FITC-Fg与未修饰Fg）下，微血栓结构会受到影响。Zeng等人的前期工作展示了在不同剪切力条件下，钱德勒环路中可能形成的广泛血栓表型¹⁶。

有时可能发生异常凝血。最常见的凝块形成问题可分为两类：（i）过早凝血和（ii）凝血功能受损。在过早凝血的情况下，全部血样会在钱德勒循环管路内完全固化。当启动滚筒旋转时，这一现象会变得明显：血液不会“流动”.......

讨论

血凝块形成与标记
Chandler循环已被证明是一种简便有效的方法，可重复地生成模拟血栓 体内 血栓¹⁶通过微调管路尺寸、转速、滚筒直径和凝血时间等参数，可在不同剪切条件下快速生成具有多种血栓结构特征的凝块，从而模拟动脉和静脉来源的血栓。如我们在RT-FluFF系统中所展示的，引入FITC-Fg等标记物的额外灵活性进一步拓展了这些血栓的应用潜力。尽管Chandler环路的基本原理较为简单，但在血块形成过程中需持续处理全血及血液制品，因此在实现稳定一致的血块形成方面仍存在较高的初始学习曲线。这主要是因为全血在启动凝血前后极短时间内对操作方式极为敏感。尤其重要的是，在Chandler环路的血块形成步骤中所选用的管路，因血液与材料表面的相互作用可能影响血块形成的进程。管路应选用医用或外科级材料（无热原、无溶血性），并具有低生物反应性。如我们结果部分所述，在技术掌握的初期阶段，随着实验者根据实验规模和特定检测需求逐步优化操作流程，所形成的血块出现差异是可预期的。鉴于血块结构对其在纤溶过程中的行为具有重要影响，最终实现可重复性至关重要。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G 一次性皮下注射针头	Exel International	26439	其他耗材
6 mm 高速钢车床棒料，长 150 mm	uxcell	B07SXGSQ82	钱德勒循环仪，
96孔透明平底紫外透光微孔板	Corning	3635	其他耗材，未处理丙烯酸共聚物，非无菌
Air-Tite 带鲁尔锁非无菌 60 mL 注射器	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF 装置，减震器
Arium Mini Plus 超纯水系统	Sartorius	NA	去离子水水源
氯化钙	Millipore Sigma	C5670	其他耗材
一次性血压传感器	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF 装置
Drager Siemans HemoMed 模块	Drager	5588822	RT-FluFF 装置
Drager Siemans 患者监护仪	Drager	SC 7000	RT-FluFF 装置
滚筒（圆柱体，直径 120 mm，宽度 85 mm）			钱德勒循环仪
面罩	Moxe	SHIELDS10	钱德勒循环仪，
人血浆来源纤维蛋白原，Alexa Fluor 488 标记物	Thermo Scientific	F13191	其他耗材
接头，聚碳酸酯材质，四通旋塞，雄性鲁尔锁，非无菌	Masterflex	30600-04	RT-FluFF 装置
荧光素（FITC）	Thermo Scientific	119245000	其他耗材
通用型水浴锅	Thermo Scientific	2839	钱德勒循环仪，
4 × 4 加热板	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF 装置
人源新鲜冷冻血浆	Zen-Bio	SER-SPL	其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂
人全血	Zen-Bio	SER-WB-SDS	其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂
L/S Easy-Load II 泵头，适用于高性能精密管路，PPS 外壳，不锈钢转子	Masterflex	77200-62	RT-FluFF 装置，泵头
L/S 可调速数字驱动泵，带远程 I/O，6 至 600 rpm；90 至 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF 装置，泵
电机调速控制器	CoCocina	ZK-MG	钱德勒循环仪，
Nalgene 管路 T 型连接器	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF 装置
蠕动泵管路	Masterflex	06424-15	其他耗材
磷酸盐缓冲液	Millipore Sigma	P3813	其他耗材，粉末，pH 7.4，用于配制 1 L 溶液
开关电源	SoulBay	UC03U	钱德勒循环仪，
Thermo Scientific National Target 全塑料一次性 10 mL 注射器	Thermo Scientific	S751010	其他耗材
人组织型纤溶酶原激活物	Millipore Sigma	T0831	其他耗材
管路内径 1/4''，外径 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	其他耗材，切成 1.5 cm 小段，用于将管路连接至 T 型连接器
管路内径 5/32"，外径 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	其他耗材
V3 365 nm 迷你黑光紫外手电筒	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	钱德勒循环仪，用于检查已形成的血凝块
ZGA37RG ZYTD520 直流电机，12 V，100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	钱德勒循环仪，