体外 溶栓实验常常难以复制 体内 条件，无论是在血栓模型被消化的过程中，还是在溶栓发生的环境中。在此，我们探讨如何将钱德勒循环系统（Chandler loop）与实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF）相结合 用于高保真， 离体血凝块溶解监测
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摘要
摘要
血栓栓塞及相关并发症是全球范围内导致发病和死亡的主要原因，目前已开发出多种检测方法，用于评估溶栓药物的有效性 体外 和 体内对更符合生理相关性的需求日益增长 体外 用于药物开发的血栓模型，由于动物模型的复杂性和高昂成本，以及其结果往往难以转化为人类生理情况。血流、压力和剪切速率是循环系统的重要特征，流动条件下形成的血栓在形态和降解特性上均不同于静态条件下形成的血栓。这些因素在传统模型中常常未被体现 体外 血凝块消化实验，可能具有影响药物转化成功率的药理学意义。
的 Real-T时间 流感口部测量法 F低 F纤维蛋白溶解（RT-FluFF）检测是一种高保真血栓溶解测试平台，采用在剪切流条件下形成的荧光标记血凝块，并在有或无纤维蛋白溶解药物存在的情况下，利用循环血浆对其进行消化。通过调节血凝块形成和消化阶段的流速，该系统可在高度多样化的实验设置中模拟动脉、肺动脉和静脉环境。可通过在线荧光计连续测量，或采集离散时间点进行检测，亦可采用传统的终点血凝块质量测定方法。RT-FluFF检测是一种灵活的系统，能够在更真实地模拟生理流动条件的情况下，实时追踪血凝块的消化过程。 体内 生理条件下同时保持实验的可控性与可重复性 体外 测试系统
引言
由血栓栓塞性病因根本引起的疾病是当今社会发病率和死亡率的主要来源。血栓栓塞性发病机制的表现包括但不限于心肌梗死、缺血性卒中、深静脉血栓形成和肺栓塞1。大量正在进行的跨学科研究集中在开发安全有效的病理性血栓处理方法上。由于血栓在动脉和静脉中的表现不同，且解剖位置各异，因而发展出了不同的治疗策略。然而，在急性期治疗中，通常依赖于通过纤溶酶原激活剂进行药物溶栓，而在某些临床情况下，可能辅以机械取栓术2。
新型药物治疗策略的开发从根本上依赖于用于临床前测试的体内动物模型和体外消化模型3,4。体内模型的优势在于能够自然地反映多种生理参数对治疗效果的复杂相互作用，包括药物清除过程以及细胞与药物之间的相互作用。然而，这种复杂性本身常常导致模型成本高昂，并且在试图解析与人类生理显著不同的动物体内的药效动力学/药代动力学机制时，会引入额外的问题。体外模型的开发通过提供一个简化的测试环境，有助于药物的开发与筛选，但往往缺乏充分的保真度，难以准确重现所研究的疾病状态。
目前常见的体外（in-vitro）测试新型溶栓药物的方案通常依赖于在静态条件下形成并溶解血栓，以残留血栓质量作为主要终点指标5,6。然而，这类方法未能考虑血栓溶解过程中的力学因素，例如湍流和跨血栓压力降，这些因素可能显著改变受试药物的药效动力学。此外，在静态条件下形成的血栓其微观结构与生理状态下的血栓存在差异。已有可重复的研究表明，血栓形成过程中剪切力的存在会影响最终血栓的特性，如血小板活化和纤维蛋白交联。在剪切流动条件下形成的血栓从头到尾呈现出复杂的异质性，而静态形成的血栓则缺乏这种特征7,8。此类与生理血栓结构的偏离可能影响药物研发中的关键表征参数，包括药物在血栓内的渗透能力及其后续的溶解效率9。
为解决与静态凝血/血凝块溶解模型相关的部分局限性，近年来重新采用了钱德勒回路（Chandler loop）系统，用于在剪切力存在条件下同时研究血凝块的形成与溶解10。尽管此类系统相较于相对静态的检测方法能更真实地模拟血流动力学，并生成具有更接近生理结构特征的血凝块，但其简化的流动条件仍与真实生理环境存在偏差。最后，微流控技术也已被应用于相关研究，因其成像便捷且流动模式均匀；然而，该方法仍显著偏离大多数临床相关血栓栓塞性疾病中主要受累大血管内的实际生理条件11,12。
鉴于上述讨论，我们开发了一种高保真的 体外 用于临床前溶栓药物筛选的溶栓模型。该模型旨在解决上述新型溶栓疗法筛选领域中存在的一些当前缺陷，并已通过不同浓度组织型纤溶酶原激活物（tPA）条件下的可重复性和敏感性验证。本文所述系统利用蠕动泵、压力阻尼器、加热储液槽、两个压力传感器、在线荧光计以及荧光标记的钱德勒环剪切形成的血凝块类似物，提供生理性的剪切流，以实现对纤维蛋白溶解过程的实时追踪13综上所述，整个系统被称为 实时荧光流动纤维蛋白溶解检测法（RT-FluFF 检测法）14 本文将探讨在此高保真系统中成功建立和运行检测方法的复杂细节 体外 溶栓模型
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方案
以下提到的所有方法均符合机构审查委员会（IRB）协议以及机构人类研究伦理委员会的要求。所有健康志愿者在献血前均签署了书面知情同意书。需要注意的是，本方案中提及的所有材料均可在材料表中找到。尽管本方案主要讨论人全血（WB）和血浆，但也可购买并使用实验动物血液及因子缺乏的血液制品作为替代。
1. 全血采集
- 采用标准静脉穿刺技术，从知情同意的健康志愿者处采集静脉全血（WB）。
注意：在整个操作过程中，必须遵循通用预防措施，以降低接触血液或其他潜在传染性物质的风险。操作时需佩戴手套、实验服和面罩。 - 将约 50 mL 全血直接采集至含 3.2% 枸橼酸钠的采血管中，并立即转移至 50 mL 管中混合，以供后续使用。
注：在使用枸橼酸钠管采集血液前，应先弃去一管血液，同时确保采血管填充至制造商推荐的体积。新鲜采集的全血最能真实反映宿主的凝血动态。全血可在室温下短期保存（使用前 ≤4 小时），但不可过夜保存，因为已有研究表明，通过血栓弹力图检测时，过夜保存会影响凝血动态15。
2. 血栓形成
- 在3 mL抗凝全血中加入荧光素（异硫氰酸荧光素 [FITC]）标记的纤维蛋白原（FITC-Fg），使其终浓度为60 µg/mL（假设血浆内源性纤维蛋白原浓度为3 mg/mL，则标记纤维蛋白原与未修饰纤维蛋白原的比例为1:50）。
注意：该比例可提高至最高1:10，对凝块形态的影响极小。13, 14 荧光标记纤维蛋白原可直接购买，或通过将纤维蛋白原与异硫氰酸荧光素（FITC）反应自行制备。纤维蛋白原的混合应在实验开始前≤5分钟内完成。- 若纤维蛋白原先前已分装并冷冻保存，使用前应检查解冻后的FITC-Fg，确保其未提前发生聚合而失效（确保溶液中无颗粒物或纤维存在）。
- 将Chandler环装置置于37 °C水浴中，使用直径为120 mm的滚筒（图1）。确保Chandler环装置在整个凝块形成过程中能够以0–90 rpm的恒定转速旋转。
注意：更多关于Chandler环装置的设置与改进方法可参见Zeng等人的研究.16。 - 裁剪导管（内径5/32"，外径7/32"），使其形成可牢固但不过紧地环绕滚筒的环状结构。对于本文推荐的导管尺寸，可将标准200 µL PCR管裁剪后用作连接导管两端以形成闭合回路的接头。
注意：可使用不同尺寸的导管以生成不同大小的凝块16。 - 通过加入200 mM氯化钙溶液启动血液凝固，氯化钙溶液与全血的体积比为1:17。使用3 mL注射器将血液注入导管中（填充约导管体积的50%）。立即将导管环安装到Chandler环滚筒上，连接两端并开始旋转。
- 在装样前应轻轻倒置混合，确保充分混匀，避免因全血成分沉降而影响实验结果。
- 每次运行时应向每根导管中加入等量血液，否则不一致的血量可能影响凝块大小。
- 由于血液柱中的气泡也可能影响凝血过程，可在装样前通过轻柔地以"跷跷板"方式移动导管，促使气泡逸出。
- 将滚筒部分浸入水浴中，以40 RPM的转速旋转，以实现约450 s-1的计算剪切速率。
注意：有关基于导管尺寸和转速（20至60 RPM）的剪切速率计算方法，请参见Zeng等人的研究16。典型的静脉和动脉剪切速率分别为20–200 s-1和300–1,000 s-1，而约400–500 s-1可代表肺动脉的剪切条件。 - 在低光照条件下使凝块形成40–60分钟，以最大程度减少荧光标记纤维蛋白原的光漂白。
- 达到所需凝血时间后，从导管中取出凝块并立即使用。为确保轻柔取出凝块而不破坏其结构，可轻轻倒置导管，使凝块缓慢滑出至小型容器中。
注意：将形成的凝块在4 °C条件下过夜保存于抗凝血浆或PBS中，可能会影响后续在流动环路中对凝块降解的分析。
3. RT-FluFF 仪器设置
- 确保流环装置的连接方式如图2所示，并且所有连接处均牢固可靠。简而言之，流环装置按流动方向依次包括：泵 > 阻尼器 > 入口压力传感器 > 血栓 > 出口压力传感器 > 荧光计 > 加热储液槽 > 泵。根据每项研究特有的实验需求，调整泵容量、实验流速、管路直径与长度、温度、储液槽体积以及血栓大小/几何形状的选择。
注意：在本示例中，RT-FluFF 使用了与钱德勒环路相同直径的管路。同一天内管路可多次使用，但需监测是否出现降解或泄漏情况，并根据需要进行更换或冲洗。建议每次运行之间用温热的蒸馏水冲洗管路。根据实验设计的不同，可能需要在每次运行后更换管路。 - 所有管路固定完毕后，打开压力监测仪。检查压力监测仪显示的入口和出口传感器读数是否均为 0 mmHg。若非如此，请打开阀门，确保压力传感器与大气压相通，并将传感器归零。
- 开启所用加热块或水浴装置，并在实验过程中持续监测温度。保持温度接近 37 °C，以模拟人体生理温度。
- 将泵开启至所需流速，检查是否存在泄漏，并确认压力传感器正常工作。
注意：在此管径条件下，约 160 mL/min 的流速对应约 500 s-1 的剪切速率。 - 关闭泵，以便进行血栓加载。
4. 将血栓装入流动回路
- 如果使用的是之前制备并储存的血栓，请确保在将其装入流动回路系统前，先将血栓恢复至室温。
- 血栓质量损失是溶栓实验中一项重要的终点测量指标。最佳做法是在将血栓装入流动回路前立即测量其质量，而不是依赖之前的测量结果。
- 为了确保不同样本及不同实验日之间的数据一致性，每次测量血栓质量时都应采用相同的方法，因为血栓内部及表面的液体含量会显著影响其质量。推荐做法是用实验室擦拭纸轻轻吸去血栓表面液体，直至擦拭纸上不再有明显液体渗出，注意在整个测量过程中避免挤压血栓。
- 将血栓浸入血浆（自体或配型血浆）或其他用于流动回路的流动相溶液（如 PBS 或特定培养基）中，容器可选用称量皿等浅底容器。流动相溶液应直接取自 50 mL 系统储液罐，以控制整个系统的总体积。在血栓装载阶段，不应含有任何溶栓剂或药物测试剂。建议流动回路运行时流动相的总体积 ≥50 mL，并在所有样本间保持一致。
- 拆下流动回路管路的中央部分（位于入口和出口传感器之间），并将一个 10 mL 注射器连接到管路的一端。
- 使用管路的自由端插入血浆（或流动相）中，吸取少量溶液以润洗并填充管路。然后将管路入口靠近血栓，仔细观察血栓以识别其头部（通常为稍厚的一端）和尾部（与头部相对的一端）。血栓头部应朝向入口压力传感器，并远离出口。将管路置于血栓的"尾部"端，用注射器抽吸使血栓进入管路。
注意：当无法通过视觉判断血栓头尾方向时，可根据 Chandler 回路滚筒的旋转方向确定——血栓头部朝向与滚筒旋转方向相反。 - 将管路重新连接至主装置，使血栓最靠近出口压力传感器（血栓头部应背向出口传感器）。使用两根 30 G 针头以"X"形方式刺穿管路和血栓头部，将血栓固定在位。实验全程保留这些针头。
注意：根据阻尼器和泵的设置，可能需要额外针头以防止血栓过早破裂。如有必要，可在血栓下游的管路中加装滤网，防止血栓碎片在系统中循环。一旦确定固定血栓所需的针头数量，应在所有实验条件下保持一致。 - 将剩余的流动相溶液转移至一个 50 mL 离心管中作为储液罐。
- 将储液罐放入水浴中，并将入口和出口管路置入其中（出口连接荧光检测仪，入口插入泵头）。
- 检查所用荧光检测仪是否已连接并正常监测。确认实验开始时，其初始读数相对于仅含流动相系统的基线值是否合适。
注意：若无在线荧光检测仪，可在流动回路分析期间按预定时间间隔对储液罐进行连续定期取样。实验结束后，可使用 96 孔板在任何商用分光光度计上立即读取所收集的样品。 - 向储液罐中直接加入 500 µL 浓度为 100,000 ng/mL 的 tPA，使 50 mL 体系中的终浓度达到 1,000 ng/mL。所加体积、浓度及具体药物应根据目标循环浓度和系统储液罐体积进行调整。
- 启动泵前请检查以下事项：
- 所有连接处均已牢固。
- 压力传感器上方的两个阀门处于适当的关闭位置。
- 储液罐中残留的血浆（或液体）已补充完整。
- 溶栓剂已加入储液罐并充分混匀。
- 入口管路接近储液罐底部（以确保气泡最少）。
- 出口管路已固定，并处于目标压力所需的高度（取决于所模拟的血管位置）。
- 泵的旋转方向正确（流动顺序：泵 > 阻尼器 > 血栓 > 荧光检测仪 > 储液罐 > 泵）。
- 若泵转速设置过高（>150 rpm），应先以较低速度启动，再逐步提高转速，以避免压力骤变导致血栓破裂或管路泄漏。
- 确保系统正从荧光检测仪正确记录数据，或已准备好试剂用于实验期间对流动相进行定期取样，以便在各时间点进行后续检测。
- 开启泵并调节至目标体积流速 160 mL/min，或调节流速直至达到目标压力。系统将充满液体并产生气泡。气泡会人为升高荧光读数，因此需观察气泡排出情况。待气泡排尽后，关闭光源并开始数据采集。
- 保持泵持续运行，直至血栓显著降解或达到预定实验时间（≥60 分钟）。实验过程中可根据需要通过储液罐向系统添加试剂，以创建不同的实验条件，测试多种溶栓方案的变化。
注意：实验时间将取决于泵的流速（剪切力水平）和溶栓剂浓度。 - 实验完成后，降低体积流速，在泵仍在运行时移除入口管路，使系统中的大部分液体排入储液罐（部分流动相将残留在管路中）。断开位于出口压力传感器侧的含血栓管路段，并将其放入称量皿中。
- 移除固定血栓的针头，收集系统内残留液体以及血栓/血栓碎片中的残余液体。必要时可使用注射器辅助清除系统内液体。
- 称重并处理剩余血栓，用于进一步分析，如计算质量损失百分比或进行组织学分析。
5. 系统清洗
- 在不同样品之间，使用温水以高转速（>150 rpm）冲洗整个系统。将水加入储液罐中，运行系统至少2分钟，排空后重复冲洗两次。完成上述冲洗步骤后，若荧光计读数仍未恢复至基线水平，则额外重复一次冲洗流程。若读数仍无法回到基线，应在检测下一个样品前彻底更换管路。
注意：实验过程中，管路可在样品间重复使用；但由于用于固定凝块的针头穿刺会造成管路破损，因此位于入口和出口压力传感器之间的管路段应在每次运行后更换。在某些实验条件下，为避免样品间的交叉污染，可能需要在每次运行后或成组检测后更换整套管路。 - 当日所有样品检测完成后，取下全部管路并丢弃。用热水和毛刷彻底刷洗T型接头直至洁净，晾干，并用热水冲洗注射器减震装置。可使用70%乙醇以提高无菌性。
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结果
钱德勒环路血栓形成
在形成血栓时，我们通常制备四份重复样本，以确保即使存在个别血栓异常（基于宏观形态和质量判断），仍可进行三份重复的溶栓实验。在理想加样条件下，所形成的血栓在长度（约3.3 cm）、重量（约100 mg）和外观上应高度均一，如图3所示。当使用FITC-Fg时，我们还旨在通过紫外光下观察血栓，以确认荧光分布相对均匀，而非在血栓内部出现荧光标记过强的不规则区域。在我们研究的浓度范围内，全血中FITC-Fg的浓度变化不应影响血栓的重量或外观；然而，在最高浓度的FITC-Fg（1:5 FITC-Fg与未修饰Fg）下，微血栓结构会受到影响。Zeng等人的前期工作展示了在不同剪切力条件下，钱德勒环路中可能形成的广泛血栓表型16。
有时可能发生异常凝血。最常见的凝块形成问题可分为两类：（i）过早凝血和（ii）凝血功能受损。在过早凝血的情况下，全部血样会在钱德勒循环管路内完全固化。当启动滚筒旋转时，这一现象会变得明显：血液不会“流动”...
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讨论
血凝块形成与标记
Chandler循环已被证明是一种简便有效的方法，可重复地生成模拟血栓 体内 血栓16通过微调管路尺寸、转速、滚筒直径和凝血时间等参数，可在不同剪切条件下快速生成具有多种血栓结构特征的凝块，从而模拟动脉和静脉来源的血栓。如我们在RT-FluFF系统中所展示的，引入FITC-Fg等标记物的额外灵活性进一步拓展了这些血栓的应用潜力。尽管Chandler环路的基本原理较为简单，但在血块形成过程中需持续处理全血及血液制品，因此在实现稳定一致的血块形成方面仍存在较高的初始学习曲线。这主要是因为全血在启动凝血前后极短时间内对操作方式极为敏感。尤其重要的是，在Chandler环路的血块形成步骤中所选用的管路，因血液与材料表面的相互作用可能影响血块形成的进程。管路应选用医用或外科级材料（无热原、无溶血性），并具有低生物反应性。如我们结果部分所述，在技术掌握的初期阶段，随着实验者根据实验规模和特定检测需求逐步优化操作流程，所形成的血块出现差异是可预期的。鉴于血块结构对其在纤溶过程中的行为具有重要影响，最终实现可重复性至关重要。...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助，项目编号为 R01HL167877。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 G 一次性皮下注射针头 | Exel International | 26439 | 其他耗材 |
| 6 mm 高速钢车床棒料，长 150 mm | uxcell | B07SXGSQ82 | 钱德勒循环仪， |
| 96孔透明平底紫外透光微孔板 | Corning | 3635 | 其他耗材，未处理丙烯酸共聚物，非无菌 |
| Air-Tite 带鲁尔锁非无菌 60 mL 注射器 | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF 装置，减震器 |
| Arium Mini Plus 超纯水系统 | Sartorius | NA | 去离子水水源 |
| 氯化钙 | Millipore Sigma | C5670 | 其他耗材 |
| 一次性血压传感器 | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF 装置 |
| Drager Siemans HemoMed 模块 | Drager | 5588822 | RT-FluFF 装置 |
| Drager Siemans 患者监护仪 | Drager | SC 7000 | RT-FluFF 装置 |
| 滚筒（圆柱体，直径 120 mm，宽度 85 mm） | 钱德勒循环仪 | ||
| 面罩 | Moxe | SHIELDS10 | 钱德勒循环仪， |
| 人血浆来源纤维蛋白原，Alexa Fluor 488 标记物 | Thermo Scientific | F13191 | 其他耗材 |
| 接头，聚碳酸酯材质，四通旋塞，雄性鲁尔锁，非无菌 | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF 装置 |
| 荧光素（FITC） | Thermo Scientific | 119245000 | 其他耗材 |
| 通用型水浴锅 | Thermo Scientific | 2839 | 钱德勒循环仪， |
| 4 × 4 加热板 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF 装置 |
| 人源新鲜冷冻血浆 | Zen-Bio | SER-SPL | 其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂 |
| 人全血 | Zen-Bio | SER-WB-SDS | 其他耗材，含 CPDA-1 抗凝剂 |
| L/S Easy-Load II 泵头，适用于高性能精密管路，PPS 外壳，不锈钢转子 | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF 装置，泵头 |
| L/S 可调速数字驱动泵，带远程 I/O，6 至 600 rpm；90 至 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF 装置，泵 |
| 电机调速控制器 | CoCocina | ZK-MG | 钱德勒循环仪， |
| Nalgene 管路 T 型连接器 | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF 装置 |
| 蠕动泵管路 | Masterflex | 06424-15 | 其他耗材 |
| 磷酸盐缓冲液 | Millipore Sigma | P3813 | 其他耗材，粉末，pH 7.4，用于配制 1 L 溶液 |
| 开关电源 | SoulBay | UC03U | 钱德勒循环仪， |
| Thermo Scientific National Target 全塑料一次性 10 mL 注射器 | Thermo Scientific | S751010 | 其他耗材 |
| 人组织型纤溶酶原激活物 | Millipore Sigma | T0831 | 其他耗材 |
| 管路内径 1/4''，外径 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | 其他耗材，切成 1.5 cm 小段，用于将管路连接至 T 型连接器 |
| 管路内径 5/32"，外径 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | 其他耗材 |
| V3 365 nm 迷你黑光紫外手电筒 | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | 钱德勒循环仪，用于检查已形成的血凝块 |
| ZGA37RG ZYTD520 直流电机，12 V，100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | 钱德勒循环仪， |
参考文献
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