本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质与DNA的相互作用是多种基本细胞过程的基础。理解这些相互作用对于阐明各种生物学通路的分子机制至关重要。DNA分子的结构、序列和长度等关键因素可显著影响蛋白质的结合能力。生物膜干涉技术（BLI）是一种无标记技术，可测量分子间的结合动力学，为定量研究蛋白质-DNA相互作用提供了一种简便而精确的方法。与传统的基于凝胶的方法相比，BLI的主要优势在于能够实时获取结合动力学数据，从而准确测定动态蛋白质-DNA相互作用的平衡解离常数（KD）。本文介绍了一种基本实验方案，用于测定DNA复制蛋白——复制蛋白A（RPA）与单链DNA（ssDNA）底物之间相互作用的KD值。RPA对ssDNA具有高亲和力，但为了在生物通路中促进后续蛋白质的相互作用，它又必须能够被轻易置换。在所述的BLI实验中，将生物素标记的ssDNA固定在链霉亲和素包被的生物传感器上，随后检测RPA与传感器上结合的DNA之间的结合动力学（包括结合与解离过程）。利用系统软件对所得数据进行分析，以获得结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）以及平衡结合常数（KD）的精确数值。
引言
细胞蛋白质在调控生物体内复杂的生物学过程中发挥着关键作用。这些通路的正常功能依赖于细胞内蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，包括与伴侣蛋白质和核酸的相互作用1。因此，要理解细胞过程的复杂性，必须深入掌握蛋白质-核酸相互作用的动态特性。
传统上，蛋白质与核酸相互作用的研究通常采用电泳迁移率凝胶偏移分析法（EMSA）2。在该实验中，将蛋白质与合成的寡核苷酸（DNA或RNA，具有特定长度或序列）短暂孵育，随后在非变性聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶中进行电泳3,4,5。为了可视化蛋白质与寡核苷酸的相互作用，寡核苷酸通常被放射性同位素32P标记，或连接荧光分子。如果蛋白质与寡核苷酸发生相互作用并结合，则蛋白质的结合会减缓核酸在凝胶中的迁移速度6,7。因此，该方法也被称为凝胶偏移或凝胶阻滞实验。尽管该方法被广泛使用，但在利用其测定KD值时仍存在一些局限性，包括因结合较弱或动态结合导致的分辨率较低、需要较高浓度的蛋白质，以及操作较为繁琐。此外，EMSA并....
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 诱饵、分析物、缓冲液的制备及液滴支架的清洗
- 仪器设置：在开始实验前至少1小时打开仪器，以便光源预热。
- 洗脱缓冲液和清洗缓冲液的制备
- 洗脱缓冲液：配制50 mL 0.15 M磷酸溶液（pH 2.0）。
- 清洗缓冲液：配制10 mL 0.5 N HCl。
- BLI缓冲液的制备
- 配制50 mL 1× BLI缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.1 mg/mL BSA，1 mM DTT，0.05% Tween 20）。将该缓冲液储存于4 °C。在开始实验前，将其恢复至室温。
注意：强烈建议为实验新鲜配制缓冲液，因为存放过久的缓冲液可能发生pH变化或形成聚集体，并可能存在微生物污染，从而影响结果的可重复性和准确性。不建议使用储存超过两周的缓冲液。
- 配制50 mL 1× BLI缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，100 mM NaCl，0.1 mg/mL BSA，1 mM DTT，0.05% Tween 20）。将该缓冲液储存于4 °C。在开始实验前，将其恢复至室温。
- 诱饵/底物的制备
- 使用BLI缓冲液配制12.5 nM的3'Bio-ss-poly (dT)32底物（5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'Bio）。
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结果
在BLI中，白光从生物层/缓冲液界面和内部参考界面向光谱仪反射。记录由此产生的干涉图样，并在一段时间内测量光谱位移，以纳米（nm）为单位表示为结合曲线响应。下图展示了生物传感器探针在有无分析物结合情况下的示意图及其相应的光谱波长位移（nm）。 图1结合曲线对应于基线、诱饵分子固定、分析物结合以及随后的分析物解离过程，如图所示。 图2.
在本实验中，按照方案所述配制BLI动力学缓冲液，并用于制备3'Bio-ss-poly (dT)32 储液和RPA蛋白储液。建议在整个实验过程中所有稀释步骤均使用相同的缓冲液。链霉亲和素生物传感器在室温下用BLI动力学缓冲液水化后，包被3'Bio-ss-poly (dT)32 底物以进行基础动力学检测。为优化底物浓度，共评估了四个不同浓度，并设置阴性对照（0 nM）（图4）。0 nM底物的传感图将作为参考曲线。进行动力学实验时，建议.......
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讨论
利用生物层干涉技术（BLI）分析任何蛋白质与其底物结合动力学的能力，为分离和表征调控细胞内蛋白质-DNA相互作用的特定因素（如DNA的序列、结构或长度）提供了手段19。基于生物层干涉原理的Octet N1系统，可对蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用进行定量测定。此外，该方法还可用于测定脂质、抗体与小分子之间的相互作用42,43,44。尽管该系统使用起来相对简单直接，但在利用其测量结合动力学时仍需考虑一些细微之处。
本方案测定了蛋白质复合物RPA与单链DNA（ssDNA）结合动力学——这一相互作用在过去数十年中已被广泛研究。由于RPA具有多个DNA结合结构域，研究还聚焦于其在不同长度的单链DNA底物存在下，各个结构域的结合行为。模块化结合研究表明，RPA对8个核苷酸（nt）长度的单链DNA结合亲和力较低，而当与约28–30个核苷酸长度的单链DNA相互.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（1929346）和美国癌症协会（RSG-21-028-01）的资助项目支持。我们还要感谢 Balakrishnan 实验室成员提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 微型离心管 | Globe Scientific | 111554A | |
| 96 孔标准黑色微孔板 | Dot Scientific | 4ti-0223 | |
| 生物素标记的 poly dT 寡核苷酸 | IDT | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Dot Scientific | DSD11000-10 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Dot Scientific | DSE57020-500 | |
| 盐酸 | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Kimtec Science Kimwipes | Kimtech | 34120 | |
| Octet N1 软件 | Sartorius | 1.4.0.13 | |
| Octet SA 生物传感器 | Sartorius | 18-5019 | |
| PBS pH 7.2 (10x) | Gibco | 1666711 | |
| Personal Assay Octet N1 系统 | Sartorius | ||
| 磷酸 | Ward's Science | 470302-024 | |
| 氯化钠（NaCl） | Dot Scientific | DSS23020-5000 | |
| Tris 碱 | Dot Scientific | DST60040-5000 | |
| Tween20 | Bio-Rad | 170-6531 |
参考文献
- Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-op....
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