本文介绍了一种纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）方案，用于快速分离并显示无疣星虫（Sipunculus nudus）中的纤维蛋白原溶解因子。
方法文章
通过纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速分离与显示Sipunculus nudus中的活性纤维蛋白溶解因子
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
能够直接溶解纤维蛋白原的纤维蛋白原降解剂已广泛应用于抗凝治疗。通常，鉴定新的纤维蛋白原降解剂需要先分离各组分，再检测其纤维蛋白原降解活性。目前，分离阶段主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和色谱法；而纤维蛋白原平板检测法及基于反应产物的PAGE则常用于显示其纤维蛋白原降解活性。然而，由于这两个阶段在时空上是分离的，无法在同一块凝胶中同时实现活性纤维蛋白原降解剂的分离与可视化。为了简化纤维蛋白原降解剂鉴定过程中的分离与检测步骤，本研究建立了一种新的纤维蛋白原-PAGE方法，用于快速分离并显示花生虫（Sipunculus nudus） 中的纤维蛋白原降解剂。该方法包括纤维蛋白原-PAGE制备、电泳、复性、孵育、染色和脱色等步骤，可同时检测蛋白质的纤维蛋白原降解活性及其分子量。根据该方法，我们成功在6小时内检测到花生虫匀浆中多种具有活性的纤维蛋白原降解剂。此外，该纤维蛋白原-PAGE方法具有节省时间和成本的优势。进一步地，该方法也可用于研究其他生物体中的纤维蛋白原降解剂。
引言
近年来，由于血栓性疾病发病率持续上升，血栓性疾病已成为全球新的重大健康问题1。目前，抗血栓药物分为三类：抗血小板聚集药物、抗凝药物和溶栓药物。其中，溶栓药物如尿激酶（UK）、组织型纤溶酶原激活剂（tPA）等，是临床上唯一可用于水解血栓的药物2。与此同时，通过发现新型溶栓物质，更安全、更有效的溶栓药物正在被研发中3。
然而，新型溶栓剂的鉴定过程耗时且劳动密集，主要涉及分离/纯化和表征/检测两个阶段。前者用于分离各个组分，后者用于展示其纤维蛋白（原）溶解活性4,5。在以往的研究中，尽管我们已通过亲和层析和纤维蛋白（原）平板法成功地从花生虫（Sipunculus nudus）中分离出一种新型纤维蛋白（原）溶解酶（sFE）6,7,8，但这些过程极为耗时费力。首先，需通过纤维蛋白（原）平板法及基于PAGE的反应产物分析，确定花生虫匀浆是否具有纤维蛋白（原）溶解活性9。随后，必须进行一系列层析步骤，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等，以实现组分的分离与纯化10,11。接着，需再次进行纤维蛋白平板实验，检测各分离组分的纤维蛋白原溶解活性。最后，通过非变性PAGE和十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE分析，确定具有活性的纤维蛋白原溶解剂的分子量12。因此，快速分离并展示具有活性的纤维蛋白原溶解剂至关重要。
为了快速分离并显示花生虫匀浆中具有活性的纤维蛋白原溶解剂，本研究结合PAGE和纤维蛋白原平板法，建立了一种新的纤维蛋白原-PAGE方法，即将纤维蛋白原溶解剂的底物纤维蛋白原添加至非变性PAGE凝胶中。经过非变性PAGE电泳后，各组分按其分子量实现分离，同时可通过染色直接显示每种具有活性的纤维蛋白原溶解组分。利用该方法，我们在6小时内成功检测到花生虫 匀浆中存在一种以上的活性纤维蛋白原溶解剂。此外，该纤维蛋白原-PAGE方法具有节省时间和成本的优点。进一步地，该方法还可用于研究其他生物体中的纤维蛋白原溶解剂。
方案
1. 藤壶虫组织匀浆制备
- 将50 g花生虫和150 mL生理盐水加入匀浆器中。
- 在24000 rpm条件下匀浆60 s。
注意：重复3次。 - 在4 °C条件下，以9710 × g 离心30 min。
- 收集上清液作为花生虫匀浆液用于后续研究。
2. 纤维蛋白原-PAGE 胶的制备
- 称取 0.01 g 纤维蛋白原，放入 50 mL 玻璃烧杯中。
- 向烧杯中加入 1.9 mL 去离子水（DDH2O）、1.3 mL Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）和 0.05 mL SDS（10%，w/v），用移液器充分混匀。
- 将烧杯置于 37 °C 水浴中 30 分钟。
注：此步骤用于溶解纤维蛋白原。 - 向烧杯中加入 1.7 mL 丙烯酰胺（30%，w/v）、0.05 mL 过硫酸铵（APS；10%，w/v）和 0.002 mL 四甲基乙二胺（TEMED），用移液器充分混匀。
注：此为分离胶。 - 将分离胶倒入 10 孔凝胶模具中。
- 向凝胶模具中加入 2 mL 去离子水（DDH2O），静置 30 分钟。
- 将模具倒置，彻底去除上层水分。
- 向烧杯中加入 1.4 mL 去离子水（DDH2O）、0.25 mL Tris-HCl（1.0 M，pH 6.8）、0.02 mL SDS（10%，w/v）、0.33 mL 丙烯酰胺（30%，w/v）、0.02 mL APS（10%，w/v）和 0.002 mL 四甲基乙二胺（TEMED），用移液器充分混匀。
注：此为上样胶。 - 将上样胶倒入与步骤 2.5 相同的凝胶模具中，立即插入梳子。
注：此处使用的纤维蛋白原-PAGE 凝胶由含纤维蛋白原（0.2%）的分离胶和上样胶组成。纤维蛋白原浓度可根据需要进行调整。
3. 电泳
- 将制备好的纤维蛋白原-PAGE凝胶连同胶模一起放入电泳槽中；加入1300 mL电泳缓冲液（含1.963 g Tris、12.22 g甘氨酸、0.65 g SDS和1300 mL去离子水）2将O型放入槽中；取出梳子。
- 向20 µL sFE和20 µL样品中加入5 µL 5x非变性上样缓冲液 花生虫匀浆；用移液器充分混匀；加入至预先制备的纤维蛋白原-PAGE凝胶中。
注意：切勿煮沸该混合物。sFE 是一种先前已鉴定的纤维蛋白（原）溶解酶。6,7,8 并在此研究中用作阳性对照。花生虫匀浆为待检测样品。非变性上样缓冲液不含溴酚蓝、β-巯基乙醇和SDS，与SDS-PAGE上样缓冲液相对比。每个样品泳道均使用1× SDS-PAGE上样缓冲液进行分离，以清晰检测蛋白质的迁移情况。 - 以80 V电压电泳30分钟，或以120 V电压电泳20分钟。
- 从胶模中取出纤维蛋白原-PAGE凝胶。
4. 复性
- 将纤维蛋白原-PAGE 胶转移至塑料盒中。
- 向盒中加入 100 mL Tris-HCl（0.05 M，pH 7.4）和 2 mL Triton X-100，置于摇床上以 60–70 rpm 振荡 10 分钟。
- 用移液器吸除洗涤缓冲液。
注意：重复三次。
5. 孵育
- 向塑料盒中加入 50 mL Tris-HCl（0.05 M，pH 7.4）。
- 在 37 °C 下孵育 4 小时。
注意：孵育时间可根据纤溶酶原活性的强弱进行调整。
6. 染色
- 用移液器吸出孵育缓冲液。
- 向容器中加入 50 mL 考马斯亮蓝染色液，将容器置于摇床中，以 60–70 rpm 振荡 30 分钟。
7. 脱色
- 用移液管吸除染色液。
- 向容器中加入 50 mL 的 DDH2O。
- 将容器置于摇床中，60–70 rpm 振荡 30 分钟。
注意：此处使用 DD H2O 作为脱色液。振荡时间可根据纤溶活性的强弱进行调整。
结果
电泳后，所有蛋白 Marker 的条带均清晰可见。1x SDS-PAGE 上样孔中仅显示出 10 kDa 的条带（溴酚蓝）。sFE 和沙蚕样品未观察到任何明显条带（图 1）。尽管样品条带不可见，但 Marker 和溴酚蓝的迁移情况表明电泳成功，样品已根据其分子量完成分离。
尽管整个凝胶因染色而呈现蓝色，但脱色后纤维蛋白原被纤维蛋白原降解酶降解的区域变为透明。与标准蛋白标记物相比，sFE在约25 kDa处显示出一条具有纤维蛋白原降解活性的条带。花生虫组织匀浆则显示出25 kDa、33 kDa、43 kDa以及一系列大于70 kDa的条带（图2）。结果表明，sFE仅含有一个25 kDa的纤维蛋白原降解组分，而花生虫组织匀浆除含有sFE组分外，还含有其他纤维蛋白原降解酶。 补充图1 为凝胶图像示例，显示标准蛋白标记物呈深蓝色，目标样品则表现为明亮条带。
图 1：电泳后的凝胶。 M：标记物；泳道 1：1x SDS-PAGE 上样缓冲液；泳道 2：sFE；泳道 3：1x SDS-PAGE 上样缓冲液；泳道 4：海肠匀浆液；泳道 5：1x SDS-PAGE 上样缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：脱色后的凝胶。 M：蛋白分子量标记物；泳道1：1x SDS-PAGE上样缓冲液；泳道2：sFE；泳道3：1x SDS-PAGE上样缓冲液；泳道4：海鳃匀浆液；泳道5：1x SDS-PAGE上样缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：凝胶图像显示深蓝色的蛋白标记物以及作为明亮条带的目标样品。 M：标记物；泳道1：1x SDS-PAGE上样缓冲液；泳道2：sFE；泳道3：1x SDS-PAGE上样缓冲液；泳道4：星虫匀浆液；泳道5：1x SDS-PAGE上样缓冲液。 请点击此处下载该文件。
讨论
sFE 是我们团队先前从柱头虫中分离得到的一种新型纤溶（纤维蛋白原溶）酶3,6,8,13。然而，sFE 的鉴定过程耗时且费力，包括纤维蛋白原溶解活性检测、蛋白质组分分离以及活性验证等步骤。作为一种简便方法，纤维蛋白原平板法通常用于初步筛选阶段，以检测样品的纤维蛋白原溶解活性。但该方法无法分辨出具体哪种组分具有活性，因此在活性检测后，还需借助层析技术以及天然/SDS-PAGE 对其组分进行分离。随后，需再次通过 SDS-PAGE 分析反应产物，以确认底物纤维蛋白原的降解情况。在本研究中，将底物纤维蛋白原直接添加至 PAGE 凝胶中，用于检测纤维蛋白原溶解物质。经过电泳、复性、孵育、染色和脱色后，活性纤维蛋白原溶解物质的分子量及其活性可在同一块凝胶中清晰显示。利用该方法，我们成功在 6 小时内从 柱头虫匀浆液中检测出多种具有活性的纤维蛋白原溶解物质。
为了获得最佳结果，应更加关注纤维蛋白原-PAGE凝胶的制备、复性及孵育过程。一般来说，纤维蛋白原浓度越低，纤维蛋白原溶解区越无色，表明试剂的纤维蛋白原溶解活性越强。然而，纤维蛋白原浓度越低，背景也越无色，纤维蛋白原溶解区与背景之间的区分就越困难。复性时间会显著影响组分的纤维蛋白原溶解活性。如果复性时间过短，无法充分洗脱PAGE凝胶中的SDS，则残留的SDS会抑制组分的纤维蛋白原溶解活性。同样，如果孵育时间过短，纤维蛋白原溶解反应将不彻底；而孵育时间过长，则用于指示分子量的标记物会被洗脱。本研究中，尽管这些条件已经过优化，但这些条件的设定旨在从花生虫中分离并显示纤维蛋白原溶解试剂。因此，应根据具体的纤维蛋白原溶解试剂设定这些关键步骤的个性化条件。
需要指出的是，该纤维蛋白原-PAGE方法仅适用于筛选具有纤维蛋白原水解活性的纤维蛋白原溶解剂，而不适用于具有纤维蛋白水解活性或纤溶酶原激活活性的试剂。如果需要检测这些活性，可通过将纤维蛋白原替换为纤维蛋白或纤溶酶原来优化该方法。另一个值得注意的问题是，本研究中测试的具有活性的纤维蛋白原溶解剂为单体，在SDS电泳条件下不受影响。因此，如果待测试剂为多聚体，则应将该方法调整为非变性PAGE条件，但此条件下无法显示分子量。因此，本文介绍的纤维蛋白原-PAGE方法仅为一种通用的基础版本，可进一步优化以快速筛选其他纤维蛋白原溶解剂。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由厦门市科学技术局（编号：3502Z20227197）、福建省科学技术厅（编号：2019J01070；编号：2022J01311）以及泉州市科技计划高层次人才创新创业项目（编号：2022C015R）资助。感谢王福才（华侨大学）和佟磊（华侨大学）提供的技术协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 | Biosharp | BL513B | |
| 过硫酸铵 | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| 烧杯 | PYREX | 2-9425-02 | |
| 离心管 (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| 恒温培养箱 | JINGHONG | JHS-400 | |
| 考马斯亮蓝染色液 | Beyotime | P0017F | |
| 电子分析天平 | DENVER | TP-213 | |
| 纤维蛋白原 | Solarbio | F8051 | |
| 凝胶加样枪头，盒装 | Biosharp | BS-200-GTB | |
| 匀浆器 | AHS | ATS-1500 | |
| 水平旋转振荡器 | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 | Sigma | T9281 | |
| 移液器吸头 (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| 移液器吸头 (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| 移液器吸头 (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| 移液器 (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| 移液器 (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| 移液器 (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| 移液器 (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| 冷冻离心机 | cence | H1650R | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
参考文献
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
重印与许可
