微小菌落对念珠菌属耐药性的影响尚未得到充分研究。抗菌光动力疗法（aPDT）为应对耐药性真菌感染提供了一种有前景的策略。本研究表明，玫瑰红介导的aPDT可有效灭活Candida glabrata并诱导产生微小菌落，展现出一种独特的实验方法。
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方法文章
通过玫瑰红介导的光动力疗法诱导光滑假丝酵母菌 petite 菌落的形成
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
面对念珠菌血症患者高达40%的死亡率，耐药性念珠菌及其微小突变株仍是临床治疗的重大挑战。与抗生素或抗真菌药物不同，抗菌光动力疗法（aPDT）可同时靶向多种真菌结构，有望克服耐药问题。传统诱导微小菌落的方法依赖溴化乙锭或氟康唑，这些试剂可能影响菌株的药物敏感性及应激反应。本研究探讨了采用绿光（峰值520 nm）联合玫瑰红（RB）光敏剂应对耐药念珠菌的可行性 Candida glabrata 分离。研究结果表明，aPDT处理显著抑制了细胞生长（减少率≥99.9%），并有效诱导了微小菌落的形成，表现为菌落尺寸减小及线粒体氧化还原指示剂染色缺失。本研究首次证实，aPDT可诱导多重耐药菌株产生微小菌落 C. glabrata 菌株 体外为应对耐药性真菌感染提供了一种可能具有变革意义的策略。
引言
真菌感染，尤其是由Candida albicans引起以及对药物日益耐药的Candida glabrata感染，正构成严重的全球性威胁1。这些感染可能致命，尤其对住院患者和免疫系统功能低下者风险更高。抗真菌药物耐药性的上升威胁着侵袭性念珠菌病的防控，这种严重真菌感染的死亡率很高，尤其由Candida albicans引起者尤为突出2。耐药菌株阻碍了有效治疗，可能导致病情复杂性和死亡率上升。在美国加利福尼亚州阿拉米达县，C. glabrata已成为最常见的侵袭性致病菌种3。念珠菌菌种在流行率和分布上的这一变化，可能受到当地医疗实践、患者人口学特征、抗真菌药物使用情况以及念珠菌感染风险因素流行程度的影响。
白色念珠菌（Candida）中缺乏功能性线粒体的微核突变体（petite mutants），揭示了该细胞器如何影响药物反应、毒力及应激抗性4,5。C. glabrata 易于形成此类菌落，对多烯类药物敏感性增加，而对唑类药物敏感性降低6。唑类药物敏感性与呼吸功能密切相关，线粒体DNA的丢失导致呼吸功能下降，进而引发耐药性7。在经氟康唑治疗的骨髓移植受者粪便样本8以及血流感染患者血培养瓶中9，均已分离出具有唑类耐药性的 C. glabrata 微核菌落。这些突变体在药物耐药性、毒力及应激反应中的潜在作用凸显其重要的临床意义。此外，其独特的生物学特性使其成为研究线粒体生物学基础问题的有力工具5。随着对微核突变体研究的深入，其在临床与基础研究中的应用前景有望进一步拓展。
本研究发现，光动力疗法（PDT）可诱导C. glabrata产生微小菌落，拓展了除传统使用溴化乙锭或氟康唑处理C. glabrata之外的方法范围。
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方案
1. 酿酒酵母样念珠菌（C. glabrata）的培养
注意：实验使用一株对多种抗真菌药物（包括氟康唑）耐药的多重耐药C. glabrata（C2-1000907）。由于不同菌株之间可能存在差异，实验条件可能需要根据具体菌株进行调整。所有实验均采用在25 °C下培养的对数生长期念珠菌，以保持一致性（模拟自然感染状态）。与在37 °C下形成菌丝的C. albicans相比，C. glabrata不形成菌丝，这使得定量分析更为简便10。
- 为制备C. glabrata的对数生长期培养物，从琼脂平板上挑取单个菌落，转移至含有3 mL无菌酵母胨葡萄糖（YPD）培养基的玻璃试管中（参见材料表）。在25 °C条件下振荡培养14–16小时（155 rpm，45°倾斜以增加培养基的通气量）。
- 培养后，使用无菌操作技术，用新鲜YPD培养基将菌液稀释至OD600为0.1。在25 °C、155 rpm振荡条件下继续培养6小时。通过测定OD600验证C. glabrata是否处于对数生长期，目标值为0.65–1.00，对应菌液浓度为1 × 107–1.5 × 107个细胞/mL。
2. 利用溴化乙锭、氟康唑及光动力疗法诱导微小菌落
- 溴化乙锭小菌落诱导
- 用YPD培养基将酵母悬液调整至OD600为0.1（5 × 106 个细胞/mL），终体积为3 mL，然后加入30 µL溴化乙锭储备液（10 mg/mL）（见材料表），使终浓度为100 µg/mL。
- 将酵母悬液在25 °C、155 rpm、45°倾斜角条件下过夜培养（16–18 h）。调整至OD600为0.65（1 × 107 个细胞/mL）。在96孔板中进行10倍系列稀释：每孔加入20 µL调整后的酵母悬液和180 µL PBS，共制备6个稀释度，范围从10-1至10-5。
- 选择4个稀释倍数（例如100、101、102和103），每个稀释度取3滴（每滴20 µL）分别接种于YPD琼脂平板的4个象限中（设3个重复）。
- 将平板在37 °C过夜培养。从先前选定的稀释度中挑选含有5–80个菌落的象限进行氯化三苯基四氮唑（TTC）染色11（见步骤3）。使用48位全彩光学扫描仪以1200 dpi分辨率扫描平板。
- 氟康唑诱导小菌落形成
注意：为加快实验进程，可使用T3细胞（经过3次RB-PDT处理后获得的正常细胞与小菌落细胞混合物；见步骤2.3）进行氟康唑诱导的小菌落形成，因为常规处理通常形成较慢。- 按照步骤2.1.1所述方法制备并调整酵母细胞悬液。
- 在25 °C下过夜培养（16–18 h），再次将OD600调整至0.1。
- 将1 mL调整后的悬液转移至无菌5 mL离心管中。
- 将一支无菌棉签（长15 cm，头部尺寸为0.9 cm × 2.6 cm，见材料表）浸入酵母悬液中，确保接触管底，并轻轻旋转以去除管壁上多余的液体。
- 在生物安全柜中使用Mueller-Hinton琼脂平板进行准备（见材料表）。
- 用棉签在琼脂表面来回涂抹，旋转平板60°两次，再涂抹边缘区域，以确保均匀覆盖。
- 将镊子在火焰上灭菌1–2秒，稍作冷却后，用其夹取空白纸片。
- 用记号笔将平板均分为三个扇形区域，每个扇形区域中心放置一个空白纸片。
- 向每个纸片上加入12.5 µL氟康唑储备液（2 mg/mL，见材料表），使每片含药量为25 µg，充分混匀避免产生气泡，然后在37 °C培养20–24 h。
- 进行TTC染色（见步骤3）。使用48位全彩光学扫描仪以1200 dpi分辨率扫描平板。
- 光动力疗法（PDT）诱导小菌落形成
注意：不同真菌在PDT处理后产生小菌落的数量可能不同，某些菌株可能完全不产生小菌落。- 准备aPDT系统。
注意：aPDT系统设备的设置程序参照Hung等12报道的方法。简而言之，该aPDT系统由峰值为520 nm的绿色LED阵列组成（见材料表），光线从底部照射，与96孔板各孔良好对齐。 - 将YPD培养基中的酵母细胞悬液调整至OD600为0.65（约1 × 107 个细胞/mL）。
- 在圆盖离心管中将1 mL酵母悬液与111 µL 2%玫瑰红B（RB，图1）（见材料表）混合，使RB终浓度为0.2%。在25 °C下以155 rpm、45°倾斜角旋转孵育15分钟。
- 将混合液转移至1.5 mL微量离心管中，在室温下以16,100 × g离心2.5分钟。
- 弃去上清液，在生物安全柜台面上轻轻刮动管壁5次，以重悬沉淀。
- 用1× PBS洗涤悬液4次以彻底去除RB。每次洗涤后均需通过短暂涡旋或吹打充分重悬沉淀。
- 最后一次洗涤后，加入1000 µL PBS，溶液呈淡粉色。将200 µL洗涤后的负载RB的酵母悬液分别转移至96孔板中的3个孔中（设3个重复）。
- 将96孔板置于光动力治疗系统上，LED灯从下方照射绿色光。关闭室内灯光以确保光照均匀并防止干扰。启动LED光照系统，持续2分钟，提供4.38 J/cm2的PDT剂量；确保系统与各孔对齐良好。
- 照射后，在96孔板中对酵母悬液进行稀释：向含有180 µL PBS的孔中加入20 µL酵母悬液，制成10倍稀释液。重复操作完成后续稀释，获得10-1至10-5的稀释系列。
- 根据酵母细胞浓度调整情况，选择4个稀释倍数（例如10-2至10-5）。
- 对每个稀释倍数，每象限接种3滴（每滴20 µL）于YPD琼脂平板上。
- 待酵母悬液被琼脂完全吸收（约10分钟）后，倒置平板并在37 °C过夜培养。
- 将未接受PDT处理的亲本株C. glabrata定义为T0对照组。按上述方法制备处于对数生长期的T0真菌，在0.2% RB存在下暴露于4.38 J/cm2绿色光。此PDT条件可稳定抑制3至3.5个数量级的真菌生长。
- 将存活的真菌记为T1，在体外扩增至对数生长期后再次接受相同剂量的PDT处理。第二次PDT处理后存活的真菌记为T2，依此类推。
- 次日，选择菌落数在5至80之间的象限，计数每个象限的菌落数，并按以下公式计算滴度：菌落形成单位（CFU）/mL = 菌落数（3个重复的平均值）× 稀释倍数 × 50。
- 进行TTC染色（见步骤3）。按前述方法（步骤2.2）扫描平板。
- 准备aPDT系统。
3. 线粒体功能分析（TCC染色试验）
注意：TTC 是一种氧化还原指示剂和电子受体。当无色化合物接受电子后会被分解，从而呈现红色11。需注意，并非所有细胞在琼脂平板上培养 24 小时后均能形成可见的菌落。具有功能线粒体的菌落会变为红色，而线粒体功能异常的菌落则保持白色。因此可区分具有不同线粒体功能的菌落。
- 处理后，根据所需的细胞密度将白色念珠菌悬液稀释并涂布于YPD琼脂平板上，以获得清晰可辨的单菌落，便于观察和染色。
- 在37 °C培养24小时后，单个细胞形成可见菌落。用移液器将20 µL的20% TTC直接滴加到每个菌落的中心。
- 菌落完全吸收TTC约需10分钟，吸收完成后，在37 °C下继续孵育30–40分钟。
4. 正常和 petite 型C. glabrata的生长动力学
注意：比较了三种酵母菌株：C. glabrata C2-1000907 T0（未经光动力治疗的临床分离株）、T3n（连续接受3次RB-PDT后形成的C. glabrata C2-1000907菌落，其平均直径为1.5 ± 0.8 mm，与亲本细胞相似）和T3p（连续接受3次RB-PDT后形成的C. glabrata C2-1000907小菌落）。
- 在3 mL离心管中，将YPD培养基中的酵母细胞悬液调整至OD600为0.1（5 × 106 个细胞/mL）。
- 使用多功能酶标仪（见材料表），每20分钟自动测定一次静置培养物的OD600，持续24小时。
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结果
数据以均值 ± 标准误表示，来自三次独立实验，每组至少设三个重复。实验数据包括菌落计数、OD600 测量结果及 TTC 染色结果采用绘图与统计分析软件进行绘图和统计分析（参见 材料表）。单因素方差分析或 t检验 用于分析数据，并且一个 p-值 <0.05 被视为具有显著性。使用 48 位全彩光学扫描仪以 1200 dpi 的分辨率进行扫描，随后利用 ImageJ 软件测量菌落直径。
如图2中的生长曲线所示，C. glabrata C2-1000907（T3p）的小型突变体相较于未经处理的正常大小亲本真菌（T0）表现出生长减缓。当C. glabrata与0.2% RB混合处理15分钟，并接受4.38 J/cm2的绿光照射（PDT处理）后，真菌滴度从107.5 CFU/mL下降至104.5 CFU/mL（至少降低3个数量级，
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讨论
本研究揭示了光动力疗法（PDT）是首个被报道可诱导念珠菌形成微小菌落的方法，其效果超过已知的溴化乙锭和氟康唑的作用。这一新发现需要进一步探索，以阐明其在降低真菌毒力从而实现真菌清除以及耐药机制出现方面的潜在意义。
玫瑰红介导的光动力疗法能有效抑制光滑念珠菌（C. glabrata）的生长，提示其可能成为治疗念珠菌感染的一种替代方案。作为一种光激活型光敏剂，玫瑰红在特定波长光照下可产生单线态氧和活性氧（ROS）。这种氧化应激会损伤脂质、蛋白质和核酸等关键细胞组分13，导致线粒体功能障碍，本研究已证实了这一点。因此，念珠菌难以通过常规抗真菌药物所见的机制对其产生耐药性。
本研究中使用的三种酵母菌株 T0、T3n 和 T3p 表现出不同的生长模式。T0 未经处理，而 T3n 和 T3p 经历了三次 RB-PDT 处理。T3n 形成正常大小的菌落，而 T3p 则表现出微小菌落表型。微小菌落生长较慢的现象可能提示细胞能量和代谢发生了改变。这种微小菌落表型通常与线粒体功能障...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了中国台湾科技部 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3]、中国台湾国立成功大学 [K111-B094]、[K111-B095]、中国台湾国立成功大学医院 [NCKUH-11204031]、[NCKUMCS2022057] 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤膜 | Merck, 中国台湾台北 | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Neptune, 美国圣地亚哥 | #3745 | |
| 20% 氯化三苯基四氮唑（TTC） | Sigma-Aldrich, 美国密苏里州 | T8877 | |
| 5 mL 聚丙烯圆底管 | Corning, 美国亚利桑那州 | 352059 | |
| 带细胞筛帽的 5 mL 圆底管 | Corning, 美国亚利桑那州 | Falcon, #352235 | |
| 96 孔板 | Alpha plus, 中国台湾桃园县 | #16196 | |
| 琼脂 | BRS, 中国台湾台南 | AG012 | |
| 空白纸片 | Advantec, 日本东京 | 49005040 | |
| 离心机 | Eppendorf, 英国 | 5415R | |
| 溴化乙锭溶液 | Sigma-Aldrich, 美国密苏里州 | E1510 | |
| 氟康唑，2 mg/mL | Pfizer, 美国纽约州 | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本 7.0 | |
| 绿色发光二极管（LED）灯带 | Nanyi electronics Co., Ltd, 中国台湾台南 | 5050 | 激发波长：500~550 nm |
| 低温摇床培养箱 | Yihder, 中国台湾台北 | LM-570D (R) | |
| 口腔护理棉签 | Good Verita Enterprise, 中国台湾台北 | 161357 | |
| 穆勒-欣顿 II 琼脂 | BD biosciences, 美国加利福尼亚州 | 211438 | |
| 多功能微孔板读板仪 | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 分光光度计 | Biochrom, 英国伦敦 | Ultrospec 10 | |
| 玫瑰红 | Sigma-Aldrich, 美国 | 330000 | 储存浓度 40 mg/mL = 4%，用 PBS 配制，4 °C 保存 |
| 灭菌玻璃试管 | Sunmei, 中国台湾台南 | AK45048-16100 | |
| 酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基 | HIMEDIA, 印度 | M1363 |
参考文献
- Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
- Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026(2018).
- Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843(2022).
- Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
- Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
- Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
- Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
- Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
- Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918(2023).
- Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038(2022).
- Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
- Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558(2022).
- Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
- Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
- Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
- Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
- Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411(2019).
- Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090(2021).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011(2021).
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