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通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

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DOI：

10.3791/66550

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2024年4月5日

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1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research, University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility, University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC, University of Coimbra

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。

摘要

腺相关病毒（AAV）已成为一种日益重要的基因递送载体 体内 基因递送，并正在开展人体临床试验。然而，目前常用的腺相关病毒（AAV）纯化方法依赖于氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心。尽管这些方法具有一定的优势，但耗时较长、可扩展性有限，且常常获得纯度较低的病毒载体。为克服这些局限，研究人员正将注意力转向层析技术。本文介绍一种优化的基于肝素的亲和层析方案，可作为AAV纯化的通用捕获步骤。

该方法基于腺相关病毒2型（AAV2）对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的内在亲和力。具体而言，该方案包括将编码目标AAV衣壳蛋白的质粒与AAV2的质粒共转染，从而产生嵌合型AAV载体，兼具两种亲本血清型的特性。简言之，在裂解生产细胞后，含有AAV颗粒的混合物通过优化的单步肝素亲和层析法直接进行纯化，该过程使用标准的快速蛋白液相色谱（FPLC）系统。纯化后的AAV颗粒随后被浓缩，并在纯度和生物活性方面进行全面表征。该方案提供了一种简化且可放大的方法，无需超速离心和梯度分离步骤，即可获得高纯度和高病毒滴度的产物。

引言

腺相关病毒（AAV）载体正成为当前基因治疗研究中最具有前景的递送系统之一。AAV最初于1965年被发现1，是一种小型无包膜病毒，具有直径约25 nm的二十面体蛋白衣壳，携带单链DNA基因组。由于AAV在完成其裂解周期时独特地依赖于辅助病毒（如单纯疱疹病毒，更常见的是腺病毒）的共感染，因此被归类于细小病毒科（Parvoviridae）的依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）2,3。

腺相关病毒（AAV）的基因组大小为4.7 kb，包含两个开放阅读框（ORF），两侧为两个反向末端重复序列（ITR），这些ITR可形成特征性的T形发夹结构末端4。ITR是AAV包装、复制和整合过程中唯一关键的cis作用元件，因此也是重组腺相关病毒（rAAV）载体中唯一保留的AAV序列。在此系统中，病毒载体生产所需的基因由trans方式单独提供，从而使目的基因能够被包装至病毒衣壳内5,6。

每个病毒基因通过选择性剪接和不同的起始密码子编码多种蛋白质。在Rep开放阅读框（ORF）内，编码四种非结构蛋白（Rep40、Rep52、Rep68和Rep78），这些蛋白在病毒DNA的复制、位点特异性整合以及衣壳化过程中发挥关键作用7,8。在Cap开放阅读框中，作为模板表达三种N末端不同的结构蛋白（VP1、VP2和VP3），它们以1:1:10的比例组装形成由60个亚基组成的病毒衣壳4,9。此外，在Cap基因内部存在一个使用非常规CUG起始密码子的重叠开放阅读框，编码一种组装激活蛋白（AAP）。研究表明，这种核蛋白可与新合成的衣壳蛋白VP1-3相互作用，并促进衣壳的组装10,11。

衣壳蛋白氨基酸序列的差异导致了11种天然存在的AAV血清型以及从人类和非人灵长类动物组织中分离出的100多种变体7,12,13。结构可变区域构象的差异决定了不同毒株衣壳的独特抗原特性和受体结合特异性，从而导致在不同哺乳动物器官中表现出不同的组织嗜性和转导效率14。

早期的rAAV生产方法依赖腺病毒感染提供辅助功能15,16,17,18,19。尽管该方法效率较高且通常易于大规模生产，但由此引发多个问题。即使经过纯化及加热变性灭活步骤后，腺病毒颗粒仍可能残留在AAV制剂中，构成不必要的安全隐患20。此外，变性的腺病毒蛋白残留对于临床应用而言是不可接受的。其他生产策略则利用经基因工程改造的重组单纯疱疹病毒株，将Rep/Cap和目的基因导入靶细胞21，或采用杆状病毒-昆虫细胞系统22。尽管这些系统在可扩展性和符合GMP要求方面具有优势，但仍面临类似的问题。

为生产重组腺相关病毒（rAAV），三质粒共转染方法已被广泛采用，以简便地克服上述问题。简而言之，rAAV的组装依赖于将三种质粒瞬时转染至细胞中，这三种质粒分别编码：1）位于野生型AAV2基因组ITR之间的目的基因表达盒（pITR）；2）病毒复制和衣壳组装所必需的Rep/Cap序列（pAAV-RC）；以及3）发挥辅助作用所需的最低限度的腺病毒蛋白（E1A、E1B、E4和E2A）以及腺病毒相关RNA（pHelper）6,20,23。尽管质粒转染方法在临床前研究中为rAAV的生产提供了简便性和灵活性，但当应用于大规模生产时，这些方法在可扩展性和可重复性方面存在局限性。作为替代方案，可通过使用AAV生产细胞系（包括贴壁和悬浮生长细胞系）来实现rAAV的生产，这些细胞系稳定表达AAV的Rep/Cap基因，或同时稳定表达Rep/Cap与载体构建体。在这些系统中，腺病毒辅助基因仍通过质粒转染方式导入。尽管该策略提高了细胞培养过程的可扩展性，但其技术操作复杂且耗时较长21,24,25。

在任一情况下，随后裂解生产细胞，并进行一步或多步纯化。目前，纯化重组腺相关病毒（rAAV）的主要方法包括使用氯化铯（CsCl）或碘克沙醇进行超高速密度梯度离心，随后可选择性地结合或不结合层析技术。26最初的病毒沉淀纯化方案采用硫酸铵沉淀，随后通过氯化铯密度梯度进行两到三轮超速离心。该方法的主要优势在于能够纯化所有血清型，并可根据完整病毒颗粒与空壳衣壳的密度差异实现其物理分离。然而，该方法操作繁琐、耗时较长，且可扩展性有限，常导致产率较低和样品质量不佳。27,28,29,30此外，通常需要在生理缓冲液中进行透析 体内 由于氯化铯对哺乳动物可能产生的毒性作用，相关研究受到限制。

碘克沙醇也被用作纯化重组腺相关病毒（rAAV）载体的等渗梯度介质，相较于氯化铯，在安全性和载体活性方面均具有优势。然而，与氯化铯法类似，碘克沙醇法在细胞裂解物上样容量方面仍存在一些局限性（从而影响rAAV纯化的可扩展性），且该方法仍耗时较长、成本较高30,31。

为了克服这些限制，研究人员将注意力转向了色谱技术。在这方面，已开发出多种纯化方法，这些方法结合了亲和层析、疏水相互作用层析或离子交换层析技术。这些方法依赖于特定血清型的生化特性，包括其天然受体或病毒颗粒的电荷特征32。例如，研究发现AAV2、AAV3、AAV6和AAV13优先结合肝素硫酸蛋白聚糖（HSPG），这使得使用结构相近的肝素进行亲和层析纯化成为可能。然而，不同血清型与HSPG的结合位点可能存在差异，从而以不同方式介导AAV与靶细胞的附着和感染2,33,34,35,36。另一方面，AAV1、AAV5和AAV6结合N-连接的唾液酸（SA），而AAV4则利用O-连接的SA2,14,34。基于相同的原理，已开发出一种基于黏蛋白的单步亲和层析方案用于纯化rAAV5，黏蛋白是一种富含SA的哺乳动物蛋白37。与基于肝素的技术类似，该纯化方法也依赖于所生成的特定血清型。除了肝素和黏蛋白外，其他配体也被探索用于亲和层析，例如A20单克隆抗体和骆驼科单域抗体（AVB Sepharose和POROS CaptureSelect）22,23,38,39,40,41。其他改进现有纯化方法的创新策略包括对rAAV衣壳进行小幅度修饰，以展示特定的结合表位。例如，带有六组氨酸标签或生物素化的rAAV可通过靶向这些表位的配体（分别为镍-亚氨二乙酸树脂和亲和素树脂）进行纯化42,43,44。

为了拓展重组腺相关病毒（rAAV）所需的特性，研究人员通过混合不同血清型的衣壳对病毒颗粒进行了“交叉包被”。该方法在病毒制备过程中以等摩尔或不同比例提供两种不同AAV血清型的衣壳基因，从而产生由不同血清型衣壳亚基混合组成的衣壳结构34,45,46,47,48,49,50。先前的研究提供了物理证据，表明以1:1比例共表达AAV2与AAV1，或AAV2与AAV9的衣壳蛋白，可分别生成嵌合型rAAV1/2和rAAV2/9载体45,46,48。生成嵌合型rAAV的主要优势在于能够整合不同AAV血清型的有利特性，从而在转导效率和嗜性方面实现协同提升，同时保留rAAV生产过程中其他有益的特性。有趣的是，某些嵌合变体甚至表现出与任一亲本病毒不同的新特性46,47,49。利用AAV2结合肝素的能力，可通过将AAV2与通过定向进化和/或理性设计获得的其他天然或新型AAV衣壳混合，从而生成并纯化嵌合型rAAV载体。然而，先前的研究强调了在组装嵌合载体时衣壳亚基相容性的重要性。例如，Rabinowitz及其同事证明，尽管AAV1、AAV2和AAV3的转衣壳化可有效共组装形成嵌合衣壳，但这些血清型与AAV4交叉包被时却阻碍了稳定病毒颗粒的生成34,45,47。此外，AAV1、AAV2和AAV3与AAV5的相容性较低，因为在不同比例混合这些衣壳时获得的病毒滴度显著降低。有趣的是，嵌合型rAAV2/5表现出减弱的肝素结合能力，但仍保留了与亲本AAV5相似的黏蛋白结合能力；而以3:1比例构建的rAAV3/5则保留了对肝素和黏蛋白的双重结合能力。总体而言，通过深入理解衣壳组装机制及受体相互作用，有望设计出具有增强转导能力、特异性嗜性或低免疫原性的新型嵌合rAAV，但特定组合仍需系统研究与优化。

在本研究中，我们描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法生产与纯化重组腺相关病毒（rAAV）的逐步实验方案。rAAVs通过瞬时转染法产生，并采用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统进行纯化。在浓缩选定的纯化组分后，对所得病毒原液进行滴度、纯度、内在物理特性及生物学活性的表征。 体外 和 体内作为概念验证，我们展示了该方案在生成嵌合型rAAV1/2和rAAV2/9载体中的改进之处与适用性。每种血清型的选择基于其截然不同的嗜性，这些特性可能同样赋予嵌合型载体独特的性质。腺相关病毒血清型1（AAV1）对中枢神经系统（CNS）具有总体中等程度的嗜性，能够转导神经元以及一定程度上的胶质细胞，并可在轴突中进行顺向和逆向运输。 体内2,7,8此外，选择腺相关病毒血清型9（AAV serotype 9）是因其具有天然穿越血脑屏障并靶向新生及成年小鼠中枢神经系统的能力51,52最后，选择了AAV2血清型，因其能够与肝素结合，从而实现亲和层析。33纯化的rAAV1/2和rAAV2/9颗粒结合了两种亲本AAV血清型的特性，因此是中枢神经系统转导的合适载体45,46,48,49.

方案

注意：有关本实验方案的示意图，请参见图1。所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。所有涉及细胞和病毒的操作均应在专用的生物安全柜和培养箱中进行，且应与常规细胞系维护所用设备分开。所有接触培养细胞和病毒的设备和试剂必须保持无菌。危险试剂以及被病毒污染的材料的处置，必须严格按照材料安全数据表的要求，并遵守各机构环境健康与安全部门提供的国家法律法规和指导方针。截至2019年4月，美国国立卫生研究院（NIH）关于涉及重组或合成核酸分子的研究指南中，将所有腺相关病毒（AAV）血清型以及重组或合成的AAV载体归为风险等级1类病原体（即在健康成年人中不引起疾病的病原体）。此分类适用于转基因不编码潜在致瘤性基因产物或毒素，且构建体在无辅助病毒条件下生产的状况。

所有涉及动物的实验均按照欧盟关于实验动物护理和使用的指令（2010/63/EU）进行，并于2013年转化为葡萄牙国内法律（法令113/2013）。此外，动物实验程序已获得科英布拉大学医学院及神经科学与细胞生物学中心授权动物实验机构的动物福利负责人组织批准。研究人员接受了充分培训（FELASA认证课程），并获得了葡萄牙主管部门（葡萄牙里斯本食品与兽医总局）的实验操作许可认证。

1. 质粒构建

  1. 遵循制造商的说明 使用内毒素去除型大提试剂盒分离和纯化以下质粒的大量DNA：i) pITR：目的转移载体；ii) pAAV-RC质粒：pRV1，包含AAV2 复制 和 帽 序列36；iii）pAAV-RC 质粒：pH21，含有 AAV1 复制 和 帽 序列36；iv）pAAV-RC 质粒：pAAV2/9n，包含 AAV2 复制 和 AAV9 帽 序列；v) pHelper：pFdelta6，腺病毒辅助质粒36.
  2. 通过进行推荐的酶切限制性反应来检测所构建质粒的完整性36通过使用限制性内切酶 SmaI 消化来监测 pITR 质粒的完整性，SmaI 在 ITR 不稳定区域内部切割两次53,54.
    注意：由于ITRs具有高度不稳定性且易发生缺失，建议使用SURE 2超感受态细胞以最大限度减少这些位点的重组。

2. 细胞培养

  1. 在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中，于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养稳定表达SV40大T抗原的人胚胎肾293（HEK293T）细胞系。2作为后续步骤的起点。
  2. 使用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）对细胞进行传代培养 洗涤 在加入0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）之前，细胞
    注意：避免使用传代次数过多的细胞（最多20代）。定期检测细胞培养物中的支原体污染。

3. 通过瞬时转染生产rAAV

  1. 第1天：细胞铺板
    1. 每次病毒制备前，于转染前一天将HEK293T细胞接种至10个经处理的培养皿（直径15 cm）中，每皿接种密度为10.5 × 106 个细胞，加入22 mL含补充物的培养基，于37°C孵育24 h，直至细胞融合度达到70%–80%，准备进行转染。
  2. 第2天：使用聚乙烯亚胺（PEI）进行细胞转染
    1. 每轮病毒制备（相当于10.5个培养皿），在微量离心管中配制以下转染混合物：54.6 µg pITR；45.675 µg pRV1；45.675 µg pH21 或 pAAV2/9n；109.2 µg pFdelta6。轻弹管壁混匀。
    2. 将上述混合物加入50 mL离心管中的4.557 mL无补充物DMEM中。轻弹管壁混匀。
    3. 逐滴加入1.365 mL浓度为1 mg/mL（pH 7.4）的无菌PEI溶液。每加一滴后轻弹混匀。室温孵育10 min，使DNA-PEI复合物形成。
    4. 将此混合物加入231 mL预热的含补充物DMEM中。将每个培养皿中的培养基完全更换为22 mL该转染混合液。继续孵育细胞48 h。
      注意：此步骤操作需谨慎，避免细胞脱落。
  3. 第4天：细胞收获
    1. 当pITR编码荧光报告基因时，使用荧光显微镜观察转染后的细胞。
    2. 将每个培养皿中的培养基收集至50 mL离心管中，在800 × g 条件下离心10 min。弃去上清液。
      注意：此步骤为可选步骤，旨在回收因密度过高而可能脱落的转染细胞。
    3. 向每个培养皿中加入10 mL预热的PBS，用细胞刮轻轻刮下细胞，并将悬液收集至步骤3.3.2中的50 mL离心管中。 
    4. 每次清洗5个培养皿，额外加入10 mL PBS进行冲洗，并将悬液转移至步骤3.3.3中的50 mL离心管中。在800 × g 条件下离心10 min收集细胞沉淀，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀在-80 °C冷冻保存。
      注意：细胞沉淀可在-80 °C保存数月（暂停点）。

4. rAAV 提取与 FPLC 纯化

  1. 第5天：细胞裂解液制备
    1. 在室温下解冻细胞沉淀。将从10个培养皿中收集的细胞重悬于100 mL无菌缓冲液中，该缓冲液含有150 mM氯化钠（NaCl）和20 mM Tris，pH 8.0，溶剂为超纯（I型）水。通过上下吹打混匀悬浮液，确保形成均一的细胞悬液。
    2. 加入12.5 mL新配制的无菌10%脱氧胆酸钠水溶液以诱导细胞裂解。通过上下吹打充分混匀。
      注意：脱氧胆酸钠及其接触过的材料应根据材料安全数据表以及机构环境健康与安全办公室提供的指南进行处理。操作该粉末时建议佩戴口罩。混合后溶液将变得高度黏稠。
    3. 向上述混合物中加入27 µL苯甲酸酶核酸酶。通过上下吹打彻底混匀，直至样品不再黏稠。在37 °C下孵育1小时，每10分钟涡旋震荡一次。
      注意：该内切核酸酶能够高效降解所有形式的DNA和RNA，且不具有蛋白水解活性。
    4. 将混合物在25 °C下以3,000 × g离心60分钟，以去除细胞碎片。使用0.45 µm无菌聚偏二氟乙烯（PVDF）针筒滤器过滤上清液，并转移至新的无菌容器中。
      注意：此关键步骤可确保大部分细胞碎片被去除，从而防止层析柱堵塞。可保留少量该混合物用于后续分析（可选步骤）。
  2. 第5天（续）：rAAV的肝素柱纯化
    注意：样品上样可通过样品泵或50 mL或150 mL超大进样环在系统中完成。由于较低温度下溶解的空气更多，因此在使用FPLC系统前，应确保缓冲液和溶液（通常储存于4 °C）有足够时间恢复至室温。
    1. 可选步骤：若系统长期未使用，请根据手动操作说明或预设的系统原位清洗（system CIP）方法，用新配制的保存液（20%乙醇）充满系统及所有进液口。
    2. 使用手动操作说明或预设的系统CIP方法，用无菌超纯水彻底冲洗液体流路。
    3. 连接1 mL预装肝素柱，设置压力报警，并以1 mL/min流速用五倍柱体积（CVs）的超纯水冲洗柱子。
    4. 将缓冲液盘中的溶液从超纯水切换为缓冲液A（100 mM NaCl和20 mM Tris的无菌水溶液，pH 8.0）用于进液口A（系统泵A），并切换为缓冲液B（500 mM NaCl和20 mM Tris的无菌水溶液，pH 8.0）用于进液口B（系统泵B）。若系统配有样品泵，将样品进样阀的缓冲液入口置于缓冲液A中。
    5. 用缓冲液B冲洗系统泵B，并用缓冲液A填充其余液体流路。
      注意：如有必要，可将柱子从流路中断开，操作后再重新连接。
    6. 将样品进样阀（例如S1）的进样管插入步骤4.1.4中获得的病毒制备液容器中（来自细胞裂解液制备）。用样品溶液对从样品进样口S1至进样阀的流路进行预冲洗。或者，使用50 mL注射器将含rAAV的样品填充至50 mL或150 mL超大进样环中。
    7. 以1 mL/min流速，使用含12.5%缓冲液B的溶液平衡柱子，总体积为五倍柱体积（CVs）。
    8. 使用样品泵（选择使用空气传感器注入全部样品）或超大进样环，以0.5 mL/min流速将全部样品上样至柱子，并通过出口端口将穿流液收集至新的无菌容器中。
      注意：当启用防过压流量控制功能时，若柱子发生堵塞，流速将自动降低。若流速显著低于0.5 mL/min，应暂停上样，用2–5 CVs的缓冲液A冲洗柱子，然后继续上样。
    9. 以1 mL/min流速，用20 CVs的缓冲液A冲洗柱子，并通过出口端口收集穿流液。
    10. 以1 mL/min流速按以下程序洗脱样品：i）线性梯度，目标为五倍柱体积内达到50%缓冲液B；ii）阶跃洗脱，目标为五倍柱体积内达到90%缓冲液B；iii）阶跃洗脱，目标为五倍柱体积内达到100%缓冲液B。
    11. 使用馏分收集器和低吸附微量离心管（2 mL）以1 mL每管收集洗脱液，并于-20 °C保存。
      注意：rAAV组分可在-20 °C保存数周（暂停点）。
    12. 以1 mL/min流速，用含12.5%缓冲液B的溶液重新平衡柱子，总体积为五倍柱体积（CVs）。
    13. 将进液口从缓冲液切换为超纯水，并以1 mL/min流速冲洗柱子五倍柱体积（CVs）。
    14. 将进液口从超纯水切换为20%乙醇，并以1 mL/min流速冲洗柱子五倍柱体积（CVs）。断开柱子并储存于4 °C。
      注意：若使用相同的rAAV血清型和转基因，柱子可在无需其他主要清洗和消毒程序的情况下重复使用多次。
    15. 使用手动操作说明或预设的系统CIP方法，用20%乙醇彻底冲洗液体流路。

5. 纯化重组腺相关病毒的浓缩

  1. 第6天：浓缩步骤1
    1. 使用截留分子量为100 kDa的15 mL离心过滤装置浓缩rAAV。将含有rAAV的目标组分（FPLC第7至16组分）加入15 mL离心过滤装置中，在室温下以2,000 × g离心2分钟。确保过滤装置中的浓缩体积约为500 µL。若浓缩体积明显超过500 µL，则以1分钟为间隔重复离心，直至达到目标体积。
  2. 第6天（续）：缓冲液置换
    1. 向含有rAAV的离心过滤装置中加入1 mL无菌PBS。小心地用移液器吹打数次以清洗滤膜。以2,000 × g离心，每次1分钟，重复操作直至最终体积达到500 µL。
  3. 第6天（续）：浓缩步骤2
    1. 将上一步获得的500 µL浓缩rAAV转移至截留分子量为100 kDa的0.5 mL离心过滤装置中，以6,000 × g离心1分钟。如有必要，重复离心步骤，直至最终体积小于100 µL。
  4. 第6天（续）：回收
    1. 为回收浓缩的rAAV，将过滤装置倒置放入一个新的微量离心收集管中。将该管放入微量离心机，管盖朝向中心，在生物安全柜内进行较长时间的离心，以将浓缩的rAAV从装置转移至微量离心管中。或者，可在1,000 × g下离心2分钟。
    2. 可选择性地加入终浓度为0.001%的无菌Pluronic F-68。
      注：Pluronic F-68是一种非离子型表面活性剂，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人体，可通过防止rAAV在稀释制备、注射器装载及递送设备过程中与材料（塑料）表面相互作用，从而减少rAAV的损失55,56。
    3. 将rAAV分装至低吸附微量离心管中，于-80 °C保存（暂停点）。

6. 纯化重组腺相关病毒（rAAV）的定量

  1. 第6天（继续）：使用商业试剂盒并按照制造商说明书，通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）测定rAAV制剂的滴度，以病毒基因组/µL（vg/µL）表示。
    1. 将rAAV颗粒溶液在37 °C下与DNase I孵育20分钟。
      注：该步骤可消化宿主细胞来源的游离基因组DNA和质粒DNA，从而确保仅保留完整rAAV颗粒内部的核酸序列。
    2. 在95 °C下加热使DNase I失活10分钟。
    3. 加入裂解缓冲液，并在70 °C下孵育10分钟，以促进rAAV颗粒蛋白的热变性。
    4. 将获得的rAAV基因组溶液用稀释缓冲液稀释，然后进行RT-qPCR。同时，使用试剂盒提供的阳性对照，配制一系列梯度稀释的标准品（从2 × 107 vg/µL至2 × 102 vg/µL）。
    5. 配制反应体系：包含12.5 µL Taq II混合液、0.5 µL稀释后的引物混合液、7 µL水以及5 µL稀释后的rAAV DNA（待测未知AAV样品及步骤6.1.4中制备的标准品）。
    6. 在实时PCR检测系统中进行RT-qPCR，采用以下程序：95 °C预变性2分钟（1个循环），随后进行40个循环：95 °C变性5秒，60 °C退火、延伸及板读30秒，最后进行熔解曲线分析。
    7. 根据标准曲线（线性回归曲线）计算样品的绝对浓度，并考虑rAAV样品制备过程中的稀释倍数。
      注：病毒基因组数量的定量通过扩增AAV2的ITR序列（试剂盒所提供引物的靶序列）实现。

7. SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹

  1. 变性处理每份样品各40 µL（包括各FPLC组分、穿流组分、预柱样品，以及总计2.3 × 1010 通过加入6倍上样缓冲液（0.5 M Tris-HCl/0.4% 十二烷基硫酸钠（SDS）pH 6.8，30% 甘油，10% SDS，0.6 M 二硫苏糖醇（DTT），0.012% 溴酚蓝），并在95 °C孵育5分钟，使最终浓缩产物达到所需体积。
  2. 将变性样品（48 µL）加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶（4%浓缩胶和10%分离胶）中，与蛋白ladder相邻，于100 V电压下电泳70分钟进行分离。
  3. 蛋白质分析
    注意：可选择考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹检测。
    1. 考马斯亮蓝染色
      1. 为观察蛋白质条带，将凝胶浸入含0.25%考马斯亮蓝G250、50%甲醇和10%冰乙酸的溶液中染色10分钟。
      2. 用含有25%甲醇和5%冰乙酸的溶液多次洗涤凝胶，直至清晰的条带在低背景中显现。
      3. 使用合适的成像系统采集图像。
    2. 蛋白质印迹
      1. 根据标准方案将蛋白质转移至PVDF膜上。
      2. 在室温下，将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T（含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐溶液）中孵育1小时以封闭膜。
      3. 使用以下一抗（用封闭液稀释），在 4 °C 下孵育过夜：小鼠单克隆抗 AAV VP1、VP2、VP3 抗体（B1，1:1,000），或小鼠单克隆抗 AAV VP1、VP2 抗体（A69，1:1,000）。
      4. 用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 15 分钟，然后在室温下与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗（1:10,000）孵育 2 小时。
      5. 用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。加入增强型化学荧光底物（ECF），通过化学荧光成像检测蛋白条带。

8. 透射电子显微镜（TEM）

  1. 将一块覆有 Formvar-碳膜的 200 目铜网倒置于一滴 rAAV 样品液滴上，静置 1 分钟使其沉降。
  2. 将铜网在一滴水中清洗，并用滤纸吸去多余液体。
  3. 用 1% 醋酸铀酰溶液（pH 7）对铜网进行负染色 1 分钟，以固定并增强病毒颗粒的对比度。
  4. 将铜网在一滴水中清洗，并用滤纸吸去多余液体。
  5. 在透射电子显微镜下观察样品。
    注意：高盐浓度可能直接影响 rAAV 与铜网的结合，导致出现类似晶体的结构。

9. 连续紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析

  1. 在96孔定量板上，加入2 µL的rAAV样品和2 µL磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照（每个样本设置两个复孔）。
  2. 在客户端分析软件中使用AAV定量应用程序，将样品名称正确填入板图位置，选择AAV血清型，然后点击下一步。
  3. 将96孔定量板放入专用仪器中，开始读板以获取数据。

10. 体外 转导实验

  1. 可使用不同的细胞系快速分析rAAV的转导效率。
    1. 将HEK293T细胞以137,500个细胞/孔的密度均匀接种于24孔板中，将小鼠神经母细胞瘤-2A（Neuro2a）细胞系接种于24孔板（50,000个细胞/孔）或8孔细胞培养腔载玻片（27,000个细胞/孔）中，所用培养基为DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，具体操作如上所述。将细胞置于含5% CO₂的湿润环境中，于37 °C培养过夜，使其贴壁。2.
    2. 从每个孔中收集条件培养基（24孔板每孔250 µL，8孔腔室载玻片每孔50 µL），并于4 °C保存以备后续使用。
    3. 将以下 rAAV 制剂加入每个孔中，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 24 小时2 大气
      1. 向接种于24孔板中的HEK293T细胞加入50 µL FPLC收集的F2-F16组分及穿流液。
      2. 总共加入 5.5 × 109 将浓缩的rAAVs用50 µL PBS稀释后加入接种于24孔板的Neuro2a细胞中（设阴性对照孔，向细胞中加入50 µL PBS）。
      3. 总共加入 2.75 × 109 将浓缩的rAAVs用PBS稀释至适当体积后，加入25 µL至接种于8孔腔室载玻片中的Neuro2a细胞中（设阴性对照组，向细胞中加入50 µL PBS）。
    4. 将先前储存的条件培养基（步骤 10.1.2）加入每个孔中，并孵育 24 小时。
    5. 弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
    6. 向每个孔中加入预热至 37 °C 的含 4% 蔗糖的 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液，室温孵育 20 分钟。
    7. 用 PBS 洗涤 2 次，4 °C 保存直至进行成像（暂停点）。
    8. 在配备10x/0.30物镜的倒置荧光显微镜，或配备40x/1.4油镜DIC物镜的倒置共聚焦显微镜上采集图像。
  2. 为了获得更相关且更具代表性的模型 体内 环境，使用原代神经元培养物，步骤如下：
    1. 按照 Santos 等人先前所述的方法制备皮层神经元的原代培养.57简而言之，将细胞以每毫升200,000个的密度接种于12孔板中，并在培养至第几天 体外 16.
    2. 从每个孔中收集条件培养基（100 µL），并于4 °C保存以备后续使用。
    3. 将待检测的rAAVs加入各孔中：每孔总量为2.75 × 109 25 µL PBS 中稀释的浓缩 rAAVs 的 vg（包括阴性对照：25 µL PBS）。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时2 大气
    4. 加入先前保存的条件培养基，孵育24小时。
    5. 弃去每孔中的培养基，用 PBS 洗涤 2 次。
    6. 用步骤10.1.6中所述的含4% PFA和4%蔗糖的PBS固定细胞，随后用PBS洗涤2次。
    7. 每孔加入5 µg/mL Alexa Fluor 633标记的小麦胚芽凝集素（WGA），室温孵育10分钟（可选步骤：改行免疫细胞化学染色）。用PBS洗涤2次。
    8. 在含0.25% Triton X-100的PBS中室温孵育5分钟。用PBS洗涤。
    9. 室温下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育5分钟。用PBS洗涤2次。
    10. 在配备40x/0.95物镜的倒置荧光显微镜，或配备40x/1.4 Oil DIC物镜的倒置共聚焦显微镜上采集图像。

11. 体内 实验

注意：动物饲养于温度受控的房间内，保持12小时光照/12小时黑暗循环。食物和水自由供应。ad libitum。尽一切努力减少动物痛苦。

  1. 小脑立体定位注射
    1. 通过连接至挥发器的麻醉舱，使9周龄C57BL/6动物吸入2%异氟烷（氧气流速0.8 L/min）进行麻醉。
    2. 将麻醉后的动物置于立体定位仪中（放置在35 °C加热垫上），并将异氟烷面罩罩住动物鼻部。将异氟烷浓度调低至1.3–1.7%。
      注意：在继续操作前，务必确认动物已正确麻醉（双侧后肢屈曲反射消失）。
    3. 涂抹润滑性眼膏以防止角膜干燥，并为动物注射经批准的镇痛剂。
      注意：所有后续步骤均须在无菌条件下进行。
    4. 剃除动物头部的毛发并消毒手术区域后，暴露颅骨，将连接至10 µL Hamilton注射器的30 G钝头注射针针尖直接置于前囟位置（以前囟作为立体定位坐标的零点进行计算）。
    5. 将针头移至目标坐标，并在针头进入位置的颅骨上钻孔。
      注意：在本研究框架中，于小脑中央区域进行了一次注射。
    6. 注射含有总量为 8 × 10⁹ 的 rAAV 的溶液 4 µL9 vg，用PBS稀释后，通过自动注射器以0.5 µL/min的输注速率进行注射。根据前囟坐标，对成年C57BL/6小鼠小脑中央区域进行单点注射，注射坐标如下：前后向：-6.5 mm；左右向：0 mm；腹背向：-2.9 mm。
      注意：这些坐标可能因所使用小鼠品系、性别和动物年龄的不同而有所差异。
    7. 为尽量减少反流并促进病毒载体扩散，输注完成后，将注射针在原位保留3分钟，然后缓慢回撤0.3 mm，并再停留2分钟，最后从小鼠脑组织中完全取出。
    8. 缝合切口并用消毒剂（如., 10% 聚维酮碘
    9. 在将动物放回其饲养笼之前，让其从麻醉状态中恢复。
  2. 组织采集与制备
    注意：本实验中，转导水平在注射后12周进行观察，但相同程序最早可在注射后4周进行评估。
    1. 通过腹腔注射过量的赛拉嗪/氯胺酮（8/160 mg/kg 体重）对动物实施终末麻醉。
    2. 用冰冻的PBS以2.5 mL/min的速度对动物进行经心脏灌注6分钟，随后以相同速度灌注新配制的冰冻4% PFA溶液10分钟。
    3. 将切除的脑组织在4%多聚甲醛中室温固定过夜，随后转移至25%蔗糖/PBS溶液中进行冷冻保护。待脑组织沉底（约48小时后），于-80 °C保存。
    4. 使用冷冻切片机在 -21 °C 下切割厚度为 30 µm 的连续矢状面切片。每只动物取一侧脑半球的 96 张矢状面切片，按解剖顺序收集为游离切片，置于添加 0.05% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C 保存备用。
  3. 标准荧光免疫组织化学
    1. 每只动物选取八张矢状切片，切片间距为 240 µm。
    2. 在室温下，将游离切片置于封闭/通透溶液（含10%正常山羊血清（NGS）和0.1% Triton X-100的PBS溶液）中孵育1小时。
    3. 4 °C 条件下用鸡多克隆抗 GFP 一抗（1:1,000）孵育切片过夜。
    4. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟，然后在室温下用 Alexa Fluor 488 荧光标记的山羊多克隆抗鸡二抗（1:200）孵育切片 2 小时。
    5. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟。室温下用 DAPI 孵育 5 分钟。
    6. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟。将切片置于明胶包被的载玻片上，加入荧光封片剂后加盖盖玻片。
    7. 使用配备20x/0.8物镜的载片扫描荧光显微镜采集图像。

结果

本研究中，我们提供了一种用于制备、纯化和表征嵌合型重组腺相关病毒（mosaic rAAV）的详细方案（总结于图1），该病毒能够靶向并转导中枢神经系统（例如 AAV1 和 AAV9），同时适用于肝素亲和层析纯化（AAV2）。为实现这一目标，利用天然AAV血清型1、2和9的衣壳，构建了嵌合型rAAV1/2和rAAV2/9载体。

实验开始前，需对质粒制备物进行结构完整性的检测。除了进行必要的酶切以验证克隆片段的正确插入外，还必须持续筛查pITR质粒，以检测可能存在的ITR缺失或插入。例如，在使用限制性内切酶SmaI消化质粒后，监测了不同克隆中pITR质粒ITR区域的完整性（补充图S1）。

根据标准转染方法6，通过以1:1比例共转染相应的AAV衣壳质粒，生成了两种类型的嵌合载体。简而言之，将HEK293T细胞转染以下三种质粒：i) 含有目的转基因序列（位于ITR（pITR）序列之间）的质粒；ii) 含有AAV2与AAV1或AAV9的野生型AAV基因组Rep和Cap开放阅读框（pAAV-RC质粒）的质粒；以及iii) 编码腺病毒蛋白（E1A、E1B、E4和E2A）以及对辅助功能至关重要的腺病毒相关RNA的质粒（pHelper）。转染48小时后，收集细胞6,36，并通过FPLC系统利用亲和层析法从细胞裂解液中纯化重组AAV（rAAV）。如图2A所示，在层析柱平衡（平衡步骤）后，将含有rAAV的细胞裂解液上样至层析柱（上样步骤）。由于rAAV2对肝素具有天然亲和力33，rAAV会结合在层析柱的树脂上，而其他组分则随流动相缓冲液流出，并由紫外监测器检测（穿流组分），导致吸光度升高。随后对层析柱进行洗涤（洗涤步骤），最后通过提高NaCl浓度洗脱rAAV（洗脱步骤）。洗脱出的病毒由紫外监测器检测，并以1 mL为一份进行收集。

代表性洗脱峰图谱显示，rAAV1/2 和 rAAV2/9 分别如 图 2B 和 补充图 S2A 所示，不同病毒批次均呈现单一洗脱峰，起始于第 F7 组分，持续至 F16 组分。不同 rAAV 制备样品的峰高有所差异，通常峰越高，rAAV 产量也越高。对所制备的 rAAV1/2 和 rAAV2/9 的每个组分均进一步采用 RT-qPCR 进行表征，以测定病毒滴度（图 2C 和 补充图 S2B）。

为表征洗脱组分的纯度，分别取各组分及相应穿流液40 µL进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（rAAV1/2见图2D，rAAV2/9见补充图S2C）。考马斯亮蓝染色在F7–F16组分中显示出三条主要条带，其分子量分别对应AAV衣壳蛋白VP1（87 kDa）、VP2（72 kDa）和VP3（62 kDa），且三者比例符合先前Van Vliet及其同事所述的1:1:10适当比例14。在两种情况下，根据紫外吸光度、RT-qPCR结果以及凝胶条带强度分析，大部分嵌合型rAAV存在于F7和F8组分中，并从F9至F16组分开始逐渐减少。除上述三种病毒衣壳蛋白外，在F8–F16组分中还检测到一种（或多种）大小约为17 kDa的额外蛋白。

为去除共纯化的蛋白，将F7-16组分通过100 KDa离心过滤装置进行过滤和浓缩，并采用RT-qPCR测定最终的重组腺相关病毒（rAAV）滴度（rAAV1/2的结果如图3A、B所示）。rAAV生产的最终产量取决于pITR的长度和复杂性、ITR序列的完整性、细胞培养条件（例如细胞传代次数）以及转染效率24,58,59,60,61。尽管如此，可通过使用0.5 mL离心过滤装置对rAAV样品进行多次离心（浓缩步骤2）来调节最终滴度。按照本方案操作，在最终体积为50至100 µL的范围内，浓度通常介于2 × 109至5 × 1010 vg/µL之间（使用所引用的滴定试剂盒进行定量）。

最终rAAV制备物的纯度通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行评估。如图3C所示，rAAV1/2制备物中仅观察到三条代表rAAV衣壳蛋白的条带，未检测到明显的共纯化蛋白。这些结果与rAAV2/9的结果一致（补充图S2C）。为确认病毒载体的身份并进一步表征rAAV1/2和rAAV2/9的纯度，对病毒组分和浓缩储备液使用特异性抗体B1（补充图S3A和补充图S4A）以及A69（补充图S3B和补充图S4B）进行了蛋白质印迹分析。抗体B1可识别大多数AAV血清型所有VP蛋白的C端共同表位62，而克隆A69仅识别VP1和VP2的表位63。然而，在使用B1和A69标记时，也可检测到一些分子量低于VP3（<62 kDa）的微弱条带。

为表征rAAV的结构形态并进一步评估其纯度，通过透射电子显微镜（TEM）直接观察病毒颗粒。该技术是评估病毒样品完整性和纯度的标准方法，因为它能够定量分析空心和完整rAAV颗粒，并评估样品中的污染情况29,64,65,66,67。如图3D所示，在洁净的背景上可观察到大量直径约为25 nm的rAAV颗粒。在整个样品视野中，还可观察到具有电子致密中心的空心颗粒（黑色箭头）以及完整载体颗粒（白色箭头）。

我们还使用 Stunner 平台对纯化的 rAAV 进行了质量控制，该平台结合了紫外-可见光（UV-Vis）光谱、静态光散射（SLS）和动态光散射（DLS）68。对于每个样品，通过 UV-Vis 光谱法测量了总蛋白含量、ssDNA 以及吸光杂质和背景浊度（图 3E 和 补充图 S5A）。随后应用 SLS 和 DLS 评估 rAAV 衣壳的光散射行为。由于 AAV 的平均直径为 25 nm，直径在 15–45 nm 范围内的颗粒被视为完整颗粒。较大的颗粒通常代表病毒聚集体，而较小的颗粒则主要为小颗粒，包括未组装的衣壳蛋白68。对于 rAAV1/2，观察到一个对应于完整衣壳颗粒的单峰，位于 30 nm（图 3F），聚集体强度为 0%，小颗粒强度也为 0%。对于 rAAV2/9 制剂，也在 30 nm 处检测到一个峰，代表 78% 的衣壳强度（补充图 S5B）。尽管该样品的小颗粒强度为 0%，但测得聚集体强度为 22%（以灰色表示），其中主要成分为平均直径为 620 nm 的大聚集体，占比 19.9%（补充图 S5B）。通过将 UV-Vis 光谱与 SLS 和 DLS 数据相结合，Stunner 揭示了两种病毒制剂的总体总衣壳滴度、完整衣壳滴度、游离及聚集体蛋白，以及游离和聚集体 ssDNA，结果如 图 3G 和 补充图 S5C 所示（具体数值见各图注）。

同时，为了评估所构建的嵌合型 AAV 载体的生物学活性，将 HEK293T 细胞分别感染经 FPLC 分离获得的 rAAV1/2 或 rAAV2/9 制剂的各组分（F2–F16）50 µL。由于 rAAV1/2 载体在 CMV 启动子（pAAV-CMV-ssGFP）控制下编码单链绿色荧光蛋白（GFP），而 rAAV2/9 载体在 CMV 启动子（pAAV-CMV-scGFP53）控制下编码自互补型 GFP，因此在感染后 48 小时直接观察这些细胞中的 GFP 荧光信号（补充图 S6 和 补充图 S7）。与之前 RT-qPCR、考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹的结果一致，病毒组分 F7 和 F8 的感染活性最高，而在 F9 至 F16 组分中感染活性逐渐降低。

为了确认重组腺相关病毒（rAAVs）在超滤和浓缩步骤后是否仍保持其生物学活性，将 Neuro2A 细胞接种于 24 孔板和 8 孔腔室载玻片中，并用携带在 CMV 启动子控制下编码 scGFP 的重组 AAV1/2 载体（pAAV-CMV-scGFP53）进行感染。感染后 48 小时采集明场和荧光图像（图 4A、B 为高分辨率图像）。

为了在更相关且更具代表性的细胞模型中探究所制备的重组腺相关病毒（rAAV）的感染能力，将来自皮层的半密集原代神经元培养物接种于12孔板中，并用先前使用的rAAV1/2-CMV-scGFP进行感染。感染48小时后，细胞经固定，并用DAPI以及与Alexa Fluor 633偶联的麦芽凝集素（WGA）进行标记，后者是一种常用于标记固定细胞的凝集素。如图4C、D所示，图像使用蔡司Axio Observer Z1显微镜和蔡司共聚焦显微镜LSM 710获取。这些图中通过直接观察GFP荧光信号可见，浓缩的嵌合病毒仍保持其向神经元细胞进行基因转移的特性。

在表征了嵌合型 rAAV 的纯度、物理性质和功能特性后 体外接下来，我们评估了使用纯化的rAAV1/2嵌合载体转导C57BL/6小鼠小脑的可能性。为此，对9周龄小鼠进行了立体定位注射，并在12周后评估GFP表达情况。正如预期，注射PBS的小鼠在GFP免疫标记后未显示任何荧光信号。注射了在突触素1启动子（synapsin 1 promoter）控制下编码GFP的rAAV1/2载体（rAAV1/2 - Syn-ssGFP）的小鼠，其荧光显微图像显示，rAAV1/2载体成功转导了小脑的多个区域，包括小脑深部核团（DCN）区域以及小脑的不同小叶图5这些结果表明，外源基因在哺乳动物脑组织中可实现长期表达（12 周）。

rAAV 生产流程图；包括细胞转染、收获、纯化、浓缩。
图 1：rAAV 制备与纯化方案的示意图。通过聚乙烯亚胺（PEI）瞬时转染 HEK293T 细胞以产生 rAAV。随后收获细胞并进行裂解，再通过亲和层析从细胞匀浆液中纯化 rAAV。收集含有 rAAV 的洗脱组分后进行浓缩，最终对病毒原液进行滴度、纯度、形态特征及生物学活性的表征。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；PEI = 聚乙烯亚胺；RT-qPCR = 实时定量聚合酶链式反应；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱过程；图示、色谱图和电泳结果；蛋白质纯化。
图 2：rAAV1/2 的 FPLC 纯化方案及代表性洗脱曲线。（A）完整的色谱图示意图，展示了 rAAV 纯化过程的不同阶段。在柱子平衡后上样，随后进行洗涤，并用逐渐增加浓度的 NaCl 进行洗脱。未结合物质（穿流组分）以及洗脱病毒的 1 mL 组分被分别收集用于分析。280 nm 处的吸光度以 mAU 表示，横轴表示体积（mL）。（B）放大后的部分色谱图，显示 rAAV1/2 的洗脱峰（黑色），对应组分编号（F2–F16）及废液（红色标注）。缓冲液 B 的输出浓度和电导率（单位：mS/cm）分别以绿色和紫色表示。（C）亲和纯化过程中收集的各组分（F2–F16）及穿流组分的 RT-qPCR 检测结果。病毒滴度（vg/µL）以对数刻度表示。（D）收集的病毒组分的 SDS-PAGE 分析。将洗脱步骤中各组分（F2–F16）及相应的穿流组分等体积（40 µL）上样，在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。图中标注了对应 AAV 衣壳蛋白 VP1、VP2 和 VP3 的条带。标准蛋白分子量标记物记为（L），并标出相应的分子量。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；RT-qPCR = 实时定量聚合酶链式反应；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。请点击此处查看该图的高清版本。

PCR扩增曲线和标准曲线图；AAV蛋白的凝胶电泳；AAV颗粒的透射电镜图像；吸光度光谱；强度分布及衣壳滴度柱状图。
图3：浓缩的rAAV1/2载体的表征。 （A）在RT-qPCR过程中获得的浓缩rAAV1/2样品（蓝色）、从2 × 107 vg/µL到2 × 102 vg/µL的系列稀释标准品（黑色）以及无模板对照（绿色）的扩增曲线。（B）用于测定rAAV样品滴度（单位为vg/µL）的标准曲线（线性回归）。（C）浓缩病毒颗粒的SDS-PAGE分析。将总共2.3 × 1010 vg的浓缩样品上样至凝胶。（D）直径约为25–30 nm的rAAV1/2颗粒的透射电子显微镜图像。可通过黑色箭头识别具有电子致密中心的空颗粒，而完整衣壳则由白色箭头指示。比例尺 = 100 nm。（E）通过Stunner测得的rAAV1/2制剂的吸光度光谱（黑色）。同时显示了蛋白质（蓝色）、单链DNA（ssDNA，绿色）、其他紫外吸收化合物或杂质（紫色）以及背景浊度（灰色）的贡献。（F）通过Stunner测得的rAAV1/2的DLS强度分布，在30 nm处出现单一峰。通过测量15至45 nm范围内曲线下的面积（绿色阴影区域），确定衣壳散射强度为100%。（G）对rAAV1/2载体制剂进行Stunner分析，结果显示总衣壳滴度为1.19 × 1014 cp/mL（深蓝色），完整衣壳滴度为1.73 × 1013 vg/mL（深绿色）。还测得相当于7.16 × 1012 cp/mL的游离及聚集蛋白（浅蓝色），以及相当于1.04 × 1012 vg/mL的游离及聚集单链DNA（浅绿色）。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；RT-qPCR = 实时定量聚合酶链式反应；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；ssDNA = 单链DNA；DLS = 动态光散射。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像；基因表达分析；明场、GFP 和 DAPI 染色；细胞可视化。
图 4：体外 感染性评估浓缩的 rAAV1/2 样品。（A）Neuro2A 细胞感染 rAAV1/2 - CMV-scGFP，或与等体积 PBS 孵育作为阴性对照。感染后 48 小时拍摄细胞的明场和荧光图像。图像使用蔡司 Axio Observer Z1 显微镜（10 倍物镜）获取。比例尺 = 100 µm。（B）Neuro2A 细胞感染 rAAV1/2 - CMV-scGFP 后 48 小时的详细图像。图像使用蔡司 LSM 710 显微镜（40 倍物镜）获取。比例尺 = 20 µm。（C）半密集原代神经元培养物感染 rAAV1/2 - CMV-scGFP，或与等体积 PBS 孵育作为阴性对照。细胞用核染料（蓝色 DAPI）和膜染料（白色 WGA）标记。图像使用蔡司 Axio Observer Z1 显微镜（40 倍物镜）获取。比例尺 = 20 µm。（D）半密集原代神经元培养物感染 rAAV1/2 - CMV-scGFP 后 48 小时的详细图像。图像使用蔡司 LSM 710 显微镜（40 倍物镜）获取。比例尺 = 20 µm。缩略语：rAAV = 重组腺相关病毒；CMV = 巨细胞病毒；scGFP = 自互补绿色荧光蛋白；PBS = 磷酸盐缓冲液；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；WGA = 小麦胚芽凝集素。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜；DAPI/GFP染色；脑切片分析；表达比较；示意图
图5: 在体 rAAV1/2 经脑实质注射后的转导效率 代表性免疫荧光图像显示，小脑内注射rAAV1/2-Syn-ssGFP后，小脑全脑范围内广泛表达GFP（绿色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 500 µm缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；Syn = 突触素1；ssGFP = 单链绿色荧光蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PBS = 磷酸盐缓冲液 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图 S1：经 SmaI 消化后的 rAAV 载体质粒的琼脂糖凝胶分析。 对 pITR 的六个克隆（C1–C6）使用 SmaI 限制性内切酶进行消化（泳道 2、4、6、8、10 和 12），该酶在每个反向末端重复序列（ITR）内切割两次。在此情况下，对该 pITR 完全消化预期将产生两条条带（3,796 bp 和 3,013 bp）。在成功的制备样本中（C1、C3、C4 和 C5），仍可见一条由部分消化产生的 6,809 bp 条带（约占总量的 5%）。在发生 ITR 重组的样本中，条带比例发生逆转（C2），或未发生消化（C6）。相应的未消化克隆也一并展示（泳道 3、5、7、9、11、13）。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；ITR = 反向末端重复序列。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：基于肝素的亲和层析纯化 rAAV2/9。（A）随着 NaCl 浓度升高，rAAV2/9 洗脱曲线显示单一洗脱峰（黑色曲线）。图底部红色数字（2–16）表示收集的各洗脱组分，280 nm 处的吸光度以 mAU 表示，电导率以 mS/cm 表示，横轴表示洗脱体积（mL）。（B）通过 RT-qPCR 定量测定各合并组分（F2–F16）及穿透组分中的 rAAV 滴度。数值以对数刻度表示。（C）通过 SDS-PAGE 及考马斯亮蓝染色进行纯度分析。取各组分（F2–F16）及相应穿透组分等体积（40 µL）上样，在 10% SDS-PAGE 凝胶中电泳分离。浓缩的病毒原液经 RT-qPCR 定量后，将含 2.3 × 1010 vg 的样品稀释于 40 µL PBS 中并上样至凝胶。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。图中标注了 AAV 衣壳蛋白（VP1、VP2 和 VP3）。标准蛋白分子量标记物以（L）表示，并标注相应分子量。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；RT-qPCR = 实时定量聚合酶链式反应；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：通过快速蛋白液相色谱纯化的 rAAV1/2 载体的蛋白质印迹分析。 （A）收集的洗脱组分及浓缩后的 rAAV1/2 载体经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，随后使用小鼠单克隆抗 AAV 抗体（B1）进行杂交检测，该抗体可识别 VP1、VP2 和 VP3 衣壳蛋白。（B）收集的洗脱组分及浓缩后的 rAAV1/2 载体经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，随后使用小鼠单克隆抗 AAV 抗体（A69）进行杂交检测，该抗体可识别 VP1 和 VP2 衣壳蛋白。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；FPLC = 快速蛋白液相色谱；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；L = 标准蛋白质分子量标记。 请点击此处下载该文件。

补充图 S4：通过快速蛋白液相色谱纯化的 rAAV2/9 载体的蛋白质印迹分析。（A）收集的洗脱组分及浓缩后的 rAAV2/9 载体经 SDS-PAGE 凝胶分离后，使用识别 VP1、VP2 和 VP3 衣壳蛋白的小鼠单克隆抗 AAV 抗体（B1）进行杂交检测。（B）收集的洗脱组分及浓缩后的 rAAV2/9 载体经 SDS-PAGE 凝胶分离后，使用识别 VP1 和 VP2 衣壳蛋白的小鼠单克隆抗 AAV 抗体（A69）进行杂交检测。缩略语：rAAV = 重组腺相关病毒；FPLC = 快速蛋白液相色谱；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；L = 标准蛋白质分子量标记。 请点击此处下载该文件。

补充图 S5：通过 Stunner 对 rAAV2/9 载体进行定量与表征。 （A）利用 Stunner 测定的 rAAV2/9 载体的吸光度光谱（黑色）。图中同时展示了蛋白质（蓝色）、单链 DNA（绿色）、其他紫外吸收化合物或杂质（紫色）以及背景浊度（灰色）的贡献。（B）rAAV2/9 的 DLS 强度分布，主峰位于 30 nm，对应衣壳散射强度为 78%，该值通过测量 15 至 45 nm 范围内曲线下的面积（绿色阴影区域）确定。还测得总聚集体强度为 22%（灰色阴影区域），其中主要成分为大聚集体（19.9%），平均直径为 620 nm。（C）rAAV2/9 载体样品的 Stunner 分析结果显示，总衣壳滴度为 2.18 × 1014 cp/mL（深蓝色），完整衣壳滴度为 2.35 × 1013 vg/mL（深绿色）。该样品中还检测到相当于 2.92 × 1013 cp/mL 的游离和聚集蛋白（浅蓝色），以及相当于 3.14 × 1012 vg/mL 的游离和聚集单链 DNA（浅绿色）。缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；ssDNA = 单链 DNA；DLS = 动态光散射。请点击此处下载该文件。

补充图 S6：体外转导效率及纯化后 rAAV1/2 组分的细胞活力。 使用编码 ssGFP 的 rAAV1/2 载体（rAAV1/2 - CMV-ssGFP）的 FPLC 组分 50 µL 转导 HEK293T 细胞后 48 小时表达 GFP（直接荧光）的情况。比例尺 = 100 µm。缩略语：rAAV = 重组腺相关病毒；FPLC = 快速蛋白液相色谱；ssGFP = 单链绿色荧光蛋白。请点击此处下载该文件。

补充图 S7： 体外 rAAV2/9 纯化组分的转导效率和细胞活力 HEK293T 细胞被感染 50 µL 每份FPLC组分（F2-F16）或流穿液中，在CMV启动子调控下编码scGFP的rAAV2/9载体的感染情况。感染后48小时观察GFP表达细胞。比例尺 = 100 µm缩写：rAAV = 重组腺相关病毒；FPLC = 快速蛋白液相色谱；scGFP = 自互补绿色荧光蛋白；CMV = 巨细胞病毒 请点击此处下载该文件。

讨论

腺相关病毒（AAV）载体工具箱的迅速扩展，已成为通过不同给药途径向多种细胞类型递送基因的最有前景的基因传递系统之一。在本研究中，我们旨在开发一种改进的嵌合rAAV载体的制备、纯化与表征方案，以验证其在临床前研究中的应用价值。本文以rAAV1/2和rAAV2/9嵌合载体的制备为例进行描述，但该方法同样适用于标准rAAV2载体的纯化（数据未展示）。

采用PEI作为转染试剂，通过优化的转染方法制备嵌合型rAAV。选择瞬时转染方法是因为其具有更高的灵活性和更快的速度，这在临床前研究的早期阶段具有显著优势。一旦特定的转基因和血清型得到验证，可通过建立稳定转染的细胞系来优化生产系统，从而提高可扩展性和成本效益；该细胞系可表达特定Rep/Cap基因的一部分，其余基因则通过感染过程提供24。与磷酸钙转染法相比，PEI具有多项优势：它是一种稳定且成本较低的转染试剂，可在更宽的pH范围内有效发挥作用；此外，转染后无需更换细胞培养基，从而显著降低了成本和工作量69。

为了克服CsCl或碘克沙醇梯度离心法带来的一些局限性，本研究采用亲和层析法收获并纯化所产生的重组腺相关病毒（rAAV）。该策略提供了一种简化且可放大的纯化方法，无需超速离心和梯度制备，即可获得高纯度和高滴度的病毒。事实上，使用FPLC系统的层析技术可通过在更高柱床的层析柱中装填更多树脂体积来实现自动化和放大。本文所述方案可轻松适配5 mL HiTrap Heparin HP层析柱（数据未显示）。此外，肝素层析柱可多次重复使用，从而提高了该方法的成本效益。

随后，对纯化的重组腺相关病毒（rAAV）在滴度、纯度、形态特征及生物学活性方面进行了表征。有趣的是，在考马斯亮蓝染色中，除三种典型的病毒衣壳蛋白外，在F8至F16组分中还检测到一条约17 kDa的条带。然而，该条带在rAAV浓缩步骤后不再存在。此外，在B1和A69标记后，还可检测到一些分子量低于VP3（<62 kDa）的微弱条带，提示这些可能是VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的片段70。另一种可能是，这些实际上是其他共纯化的蛋白质，例如铁蛋白或某些细胞蛋白，其多肽具有与AAV衣壳蛋白相似的蛋白指纹图谱，并可能参与AAV的生物学过程，正如先前研究所提示的那样26,71,72。

透射电子显微镜（TEM）和强度分析也揭示了不同生产批次中存在不同程度的空颗粒。类似地，先前其他研究报道，通过转染或感染方法制备的重组腺相关病毒（rAAV）会产生可变且较高水平（>65%）的空衣壳24,73。rAAV生成的机制始于新合成的VP蛋白快速形成空衣壳，随后由Rep蛋白介导，将基因组缓慢地包装进预先形成的衣壳中，这一过程为速率限制步骤74,75。因此，在rAAV的生产过程中会生成空衣壳，尽管空衣壳与完整衣壳的比例可能因目的转基因的大小和序列以及细胞培养条件的不同而有所变化58,73。空衣壳引发了一些关注，因为它们缺乏目标基因组，无法产生治疗效果，还可能潜在地增强先天性或适应性免疫反应。然而，也有研究报道，通过调节其比例，空的AAV衣壳可作为针对AAV特异性中和抗体的高效诱饵，从而提高转导效率60,76,77。如果空衣壳的存在具有严重不利影响，并且考虑到空颗粒相较于完整载体略低的阴离子特性，一种可能的解决方案是采用阴离子交换色谱技术进行第二步精细纯化64。

本研究还提供了有力证据，表明所生成的嵌合型rAAV能够高效转导不仅 体外 神经元培养物，以及通过颅内注射rAAV1/2后中枢神经系统（CNS）的转导。总体而言，这些结果表明，所描述的生产与纯化方案可在6天内获得高纯度且具有生物活性的rAAV，是一种适用于临床前研究中rAAV制备的通用且经济高效的方法。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢科英布拉临床与生物医学研究所（iCBR）及科英布拉创新生物医学与生物技术中心（CIBB）的Mónica Zuzarte博士在rAAV的透射电子显微镜（TEM）分析方面提供的合作、见解和技术支持。我们感谢科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心（CNC-UC）及科英布拉大学跨学科研究中心（IIIUC）的Dominique Fernandes博士在原代神经元培养实验中提供的宝贵技术支持和专业指导。本研究所必需的pRV1、pH21和pFdelta6质粒由阿伯丁大学生命科学与医学学院医学科学系的Christina McClure博士慷慨提供，特此致谢。本研究由欧洲区域发展基金（ERDF）通过Centro 2020区域运营计划、通过COMPETE 2020——竞争力与国际化运营计划，以及葡萄牙国家基金通过FCT（科学技术基金会）资助，项目编号为：UIDB/04539/2020、UIDP/04539/2020、LA/P/0058/2020、ViraVector（CENTRO-01-0145-FEDER-022095）、Imagene（PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807）、ReSet - IDT-COP（CENTRO-01-0247-FEDER-070162）、Fighting Sars-CoV-2（CENTRO-01-01D2-FEDER-000002）、BDforMJD（CENTRO-01-0145-FEDER-181240）、ModelPolyQ2.0（CENTRO-01-0145-FEDER-181258）、MJDEDIT（CENTRO-01-0145-FEDER-181266）；同时获得美国-葡萄牙生物医学研究基金（APBRF）和Richard Chin与Lily Lock Machado-Joseph病研究基金、ARDAT在欧盟与EFPIA支持下的IMI2联合承诺第945473号资助协议，以及由欧洲联盟“地平线欧洲”计划支持的GeneT-Teaming项目101059981的资助。M.M.L. 受资助于2021.05776.BD；C.H. 受资助于2021.06939.BD；A.C.S. 受资助于2020.07721.BD；D.D.L. 受资助于2020.09668.BD。图1使用BioRender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 聚维酮碘MedlineMDS093943
12孔板赛默飞世尔科技11889684
24孔板VWR734-2325
4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）InvitrogenD1306
96孔Stunner板Unchained Labs701-2025用于rAAV样品连续紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的96孔定量板
AAVpro 滴定试剂盒（用于实时 PCR）Ver.2Takara6233用于通过RT-qPCR测定AAV滴度。该试剂盒包含DNase I、裂解缓冲液、稀释缓冲液、阳性对照、Taq II mix、上游引物、下游引物和水
冰醋酸Fisher ChemicalA/0360/PB17
ÄKTA pure 25Cytiva29018224由 UNICORN 软件（版本 6.3）控制的 FPLC 系统 
碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠Invitrogen31328
Amicon ultra-0.5 离心滤过装置默克密理博UFC5100
Amicon ultra-15 离心滤过装置默克密理博UFC9100
苯并核酸酶默克密理博E1014
溴酚蓝Sigma-AldrichB0126
CFX96 实时荧光定量 PCR 检测系统伯乐（Bio-Rad）184-5096
ChemiDoc Touch 成像系统伯乐生命科学公司1708370
鸡多克隆抗GFP一抗Abcamab13970
考马斯亮蓝 G250Fisher ChemicalC/P541/46
二硫苏糖醇（DTT）Fisher BioreagentsBP17225
DMEMSigma-AldrichD5796
用于蛋白质印迹的 ECF 底物CytivaRPN5785
FastDigest SmaI赛默飞世尔科技FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit BiotwinFEIBiotwin透射电子显微镜
胎牛血清BiowestS1810
荧光封片剂DakoS3023
200目Formvar-碳膜载网 TAAB 实验室设备F077/025
气体抽排装置真实世界数据R546W
甘油Fisher BioReagents10021083
山羊抗鸡多克隆抗体，Alexa Fluor 488InvitrogenA-11039
Hamilton 针头 30G，小柄 RN 针，25 mm，PST3Hamilton7803-07
哈密尔顿注射器（10 µLHamilton7653-01
HEK293T美国典型培养物保藏中心CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mLCytiva17040701预装肝素柱
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mLCytiva17040601预装肝素柱
Immobilon-P PVDF 膜默克密理博IPVH00010
异氟烷布劳恩469860
氯胺酮 德克拉制药公司N/ANimatek
低吸附微量离心管（2 mL）Fisher Scientific11906965
疯子 & Stunner 客户端软件Unchained LabsN/A客户端分析软件版本 8.0.1.235。用于对重组腺相关病毒（rAAV）样本进行连续的紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的软件
甲醇Fisher ChemicalM/4000/FP21
小鼠单克隆抗AAV VP1、VP2抗体（A69）American Research Products03-61057
小鼠单克隆抗AAV VP1、VP2、VP3抗体（B1）American Research Products03-61058
Neuro2a美国典型培养物保藏中心CCL-131
正常山羊血清Gibco16210064
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-Nagel12738422
NZYColour蛋白分子量标准IINZYtechMB09002
pAAV-CMV-scGFPAddgene32396Addgene 质粒 # 32396；http://n2t.net/addgene:32396；RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFPAddgene105530Addgene 质粒 # 105530；http://n2t.net/addgene:105530；RRID:Addgene_105530
pAAV2/9nAddgene112865Addgene 质粒 # 112865；http://n2t.net/addgene:112865；RRID:Addgene_112865
多聚甲醛Acros Organics10342243
PBSFisher BioReagentsBP2438
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Pluronic F-68 非离子型表面活性剂（100 倍浓缩液）Gibco24040032
聚乙烯亚胺 MAX，分子量 40,000Polysciences 欧洲24765
R500 系列紧凑型小动物麻醉机 - 异氟烷真实世界数据N/A
样品进口阀 V9-ISCytiva29027746
样品泵 P9-SCytiva29027745
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002
氯化钠Fisher Scientific10428420
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750
十二烷基硫酸钠（SDS）Fisher BioreagentsBP166
无菌PVDF注射器滤器Fisher Scientific15191499
Stunner 平台Unchained Labs700-2002用于rAAV样品连续紫外-可见光吸收、静态光散射和动态光散射分析的设备
Superloop 150 mLCytiva18-1023-85
Superloop 50 mLCytiva18-1113-82
SURE 2 超级感受态细胞Stratagene，Agilent TechnologiesHPA200152
经处理的培养皿康宁734-1711
Tris 碱Fisher BioReagentsBP152
Tris 盐酸盐Fisher BioReagentsBP153
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072
与Alexa Fluor 633偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）InvitrogenW21404
赛拉嗪德克拉制药公司N/ASedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1卡尔·蔡司显微镜有限公司N/A配备 EC Plan-Neofluar 10x/0.30 物镜和 Plan-Apochromat 40x/0.95 物镜的倒置荧光显微镜
蔡司 Axio Scan.Z1卡尔·蔡司显微镜有限公司N/A配备 Plan-Apochromat 20x/0.8 物镜的载玻片扫描荧光显微镜
Zeiss LSM 710卡尔蔡司显微技术有限公司N/A配备 Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC 物镜的倒置共聚焦显微镜
µ-滑动8孔IbidiIbidi808268孔板腔室载玻片

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