本研究分析了33名阿尔茨海默病（AD）患者的单细胞核转录组，揭示了胶质细胞中与性别相关的差异表达基因（DEGs）。功能富集分析强调了突触、神经及激素相关通路的作用。研究鉴定了关键基因NLGN4Y及其调控因子，并提出了针对性别特异性AD的潜在治疗靶点。
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方法文章
基于胶质细胞转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近年来，阿尔茨海默病（AD）中已发现多种性别特异性生物标志物；然而，关于脑内胶质细胞的研究却鲜有报道。本研究分析了来自GEO数据库中33名AD个体额叶皮层的220,095个单细胞核转录组数据。在胶质细胞中鉴定了性别特异性的差异表达基因（DEGs），包括星形胶质细胞中的243个、小胶质细胞中的1,154个以及少突胶质细胞中的572个。基因本体（GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些基因功能主要集中于突触、神经及激素相关通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）分析鉴定出星形胶质细胞中的关键基因为MT3、CALM2、DLG2、KCND2、PAKACB、CAMK2D和NLGN4Y；小胶质细胞中的关键基因为TREM2、FOS、APOE、APP和NLGN4Y；少突胶质细胞中的关键基因为GRIN2A、ITPR2、GNAS和NLGN4Y。其中，NLGN4Y是唯一在三类胶质细胞中均存在的共享基因，被确定为AD性别特异性的生物标志物。基因-转录因子（TF）-miRNA共调控网络分析揭示了NLGN4Y及其靶向中药（TCMs）的关键调控因子。研究鉴定出昆布（Ecklonia kurome Okam）和麻黄（Herba Ephedrae）两种中药，并展示了其活性成分对AD的作用。最后，对昆布和麻黄的富集分析表明，它们可能作为针对AD性别特异性的潜在治疗候选药物。
引言
阿尔茨海默病（AD）是一种发病率较高的全球性疾病，占痴呆病例的60%–80%1。尽管其发病率高，但AD的发病机制尚未明确，迄今为止尚无有效的治疗方法2。AD的主要病理特征为神经元萎缩以及病理性物质的积聚，主要包括微管相关蛋白Tau和β-淀粉样蛋白（Aβ）3,4。AD的发病机制与自噬异常、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应及能量代谢紊乱相关5。流行病学调查显示，三分之二的AD患者为女性6。AD在病因学、临床表现、预防和治疗方面均存在性别差异。因此，揭示导致AD性别差异的生物学机制，并结合中医药（TCM）进行干预，有望为深入理解AD的发病机制提供更全面的理论框架，并进一步指导精准治疗策略的制定。
神经胶质细胞，尤其是小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可能参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制。在 AD 中，小胶质细胞被激活并发生遗传学改变，从而参与炎症反应、吞噬作用以及 Aβ 的清除7,8；星形胶质细胞发生遗传学改变，影响突触活动、离子稳态以及能量和脂质代谢....
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方案
分析的第2至第9步使用R软件实现（参见补充图1和补充文件1），其余步骤则在在线平台上执行。本方案中所用数据库的详细信息（含网址）见材料表。
1. 数据采集
- 访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的公开 Gene Expression Omnibus (GEO) 数据库。
- 在搜索框中查找名为 阿尔茨海默病 的 GEO 数据。
- 在右侧选择 主要生物体 为 Homo sapiens。
注：搜索结果为关于 Homo sapiens 阿尔茨海默病的数据。 - 筛选检索结果后，下载 GSE167490 和 GSE183068 数据文件，每个单细胞核样本均包含 features.tsv、barcode.tsv 和 matrix.mtx 文件。该数据集包含来自额叶皮层的 34 个阿尔茨海默病样本，其中男性样本和女性样本各 17 个（补充表 1）。
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结果
前额叶胶质细胞转录组图谱的snRNA-seq分析及细胞类型注释
共获得17名男性阿尔茨海默病（AD）患者和17名女性AD患者前额叶皮层的220,095个细胞核及32,077个基因（图1A）。通过降维分析后，UMAP图展示了全部单细胞核前额叶转录组，呈现出不同类型的细胞核聚类（图1B）。按性别分组显示了所捕获的已注释细胞核总数，合计包括58,902个星形胶质细胞、14,265个小胶质细胞、77,466个少突胶质细胞、3,520个内皮细胞、25,252个兴奋性神经元、31,268个抑制性神经元以及9,422个少突胶质前体细胞（图1C）。各胶质细胞类型已知标志基因的平均表达水平被投射至UMAP图中，用于识别不同细胞群体（图1D）。
星形胶质细胞中性别特异性的差异表达基因（DEGs）
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讨论
阿尔茨海默病（AD）的流行病学、病理学及临床表现中已发现性别特异性19。本研究通过分析AD患者中具有性别特异性的胶质基因及相关通路，进一步证实了“激素-突触-神经元轴”潜在的病理机制。NLGN4Y 是三种胶质细胞中唯一共有的基因，被选为AD性别特异性的生物标志物。调控NLGN4Y的转录因子（TF）和miRNA与性别差异及神经系统发育密切相关。此外，靶向中药昆布和麻黄被认为可能影响“激素-突触-神经元轴”，并通过调节性别特异性，成为AD治疗的潜在候选药物。
与其他整合算法相比，Harmony算法在整合稀有细胞数据、优化大样本的内存使用和计算速度，以及适应具有多样化细胞来源和技术平台的复杂实验设计方面具有显著优势18。质控和数据整合步骤是提高分析准确性和可靠性的关键环节，使研究人员能够更深入地理解阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的生物学机制。严谨执行这些步骤对于获得单细胞核RNA测序实验结果的整体质量和有效性至关重要。
本方案中的一项改.......
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披露
本手稿不存在利益冲突，所有作者均已批准该投稿发表。
致谢
作者感谢 Jessica S Sadick、Michael R O'Dea、Philip Hasel 等人提供了 GSE167490 数据集。作者感谢 Faten A Sayed、Lay Kodama、Li Fan 等人提供了 GSE183068 数据集。作者感谢刘书晴在数据分析方面的帮助，以及杨雯提供数据分析平台。本研究受到国家自然科学基金（82174511）、成都中医药大学杏林学者计划、学科人才科研提升项目（QJJJ2022001）、辽宁省兴辽人才计划（XLYC 1807083）、四川省中医药管理局基金（2023MS578）、国家级大学生创新创业训练计划项目（202310633003X）以及成都中医药大学大学生科研实践创新课题（ky-2023100）的资助。刘汉杰和杨慧参与了研究设计、数据收集与解释，以及论文的撰写和修改。刘书晴和李思雨参与了研究设计、数据收集及论文撰写。杨雯和 Anwar Ayesha 负责数据收集与解释。谭鑫负责图表的制作。蒋岑、刘毅和谢露霜提出了研究构想，并对稿件进行了审阅和修改。所有作者均对文章作出了贡献，并认可所提交的版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数据库 | |||
| Coremine Medical 数据库 | 由挪威、中国科学院、中国医学科学院、美国国家医学图书馆及其他机构联合开发 | 当您在 CoreMine Medical 中探索概念时，您将访问一个结构化的数据库，该数据库会根据统计相关性将重要概念与您的主题相关联并进行排序。例如，如果您输入 "阿尔茨海默病，" 除了检索讨论该疾病的文献和资源外，您还将能够查看网络和列表，以展示您的查询概念与其他生物医学概念之间的关联。这不仅为您提供了与检索主题相关概念的概览，还作为浏览这些概念相关信息的界面。 链接：https://coremine.com/medical/ | |
| 基因表达综合数据库（GEO） | 美国国家生物技术信息中心（NCBI） | GEO 是一个公共功能基因组学数据存储库，支持符合 MIAME 标准的数据提交。该数据库接收基于芯片和测序的数据。同时提供多种工具，帮助用户查询和下载实验数据以及经过审编的基因表达谱。 网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| 基于整合药理学的中药研究平台（TCMIP，版本：2.0） | 无 | 基于整合药理学的中医药网络计算研究平台（TCMIP v2.0）简介，http://www.tcmip.cn/）该平台是以《中药百科全书》（ETCM）在线数据库为基础的智能数据挖掘平台，集成了中医药大数据管理与药理学计算服务。其目标在于揭示中医药理论的科学内涵与中医药原创思维的科学价值，总结并传承名医经验，控制中药质量，阐释中药作用原理，开展中药新药研发，特别是现代药物组合的发现与优化，提供坚实的数据基础与分析工具。在TCMIP v1.0基础上进行了全面升级，包含五大数据库与七大功能模块。通过系统集成与模块整合，实现对多层级关联的综合分析 "病证方剂" 交互网络可快速构建。作为智能化数据挖掘平台，TCMIP v2.0 将为揭示中医理论的科学内涵和中医原创思维的科学价值、名老中医经验的总结与传承、中药质量控制、中药药理作用机制阐释、中药新药研发，特别是现代中药复方发现与优化，提供坚实的数据基础与分析平台。 网址：http://www.tcmip.cn/TCMIP | |
| NetworkAnalyst | 无 | Networkanalyze 是一个用于基因表达分析和荟萃分析的在线可视化分析平台。该平台可进行基因表达的比较、定量、差异和富集分析，蛋白质-蛋白质相互作用分析，多数据集整合分析，并能够绘制高价值图像，如 PCA 图、蛋白质-蛋白质相互作用网络图、热图、火山图、韦恩图等。 网址：https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ | |
| PubMed 数据库 | 美国国家生物技术信息中心（NCBI） | PubMed 数据库是由美国国家医学图书馆（NLM）维护的生物医学文献数据库，旨在向全球的科学家、医生、研究人员和学生提供最新的医学研究成果。该数据库收录了来自世界各地的生物医学文献，包括期刊文章、论文、书籍等。截至目前，PubMed 数据库已收录超过 3000 万篇文章，并每周持续更新。 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| R 软件 | Ross Ihaka 和 Robert Gentleman | R 是一种用于统计计算和图形的语言及环境。它是一个 GNU 项目，类似于由贝尔实验室（原 AT&T）开发的 S 语言和环境。&T（现为 Lucent Technologies）的 John Chambers 及其同事开发。R 可以被视为 S 的一种不同实现。存在 一些重要的差异，但为 S 编写的许多代码在 R 中无需修改即可运行。 网址：https://www.r-project.org/ | |
| 传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP） | 浙江九维健康有限公司 | TCMSP 不仅是一个数据仓库，还是一个分析平台，供用户全面研究中药（TCM）：包括活性成分的鉴定、药物靶点的筛选、化合物-靶点-疾病网络的构建，以及涉及类药性（DL）、口服生物利用度（OB）、血脑屏障（BBB）、肠道上皮渗透性（Caco-2）、ALogP、负性表面积分数（FASA-）和分子中负电荷原子数量的详细药物药代动力学信息 氢键 供体/受体 (黄酮/黄酮醇含量)。迄今为止，TCMSP 已引起广泛关注，多个研究团队在约一年内利用我们的 TCMSP 数据库发表了十余篇论文。 网址：https://tcmsp-e.com |
参考文献
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 19 (4), 1598-1695 (2023).
- Xie, L., et al. Electroacupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease.....
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