本研究分析了33名阿尔茨海默病（AD）患者的单细胞核转录组，揭示了胶质细胞中与性别相关的差异表达基因（DEGs）。功能富集分析强调了突触、神经及激素相关通路的作用。研究鉴定了关键基因NLGN4Y及其调控因子，并提出了针对性别特异性AD的潜在治疗靶点。
方法文章
基于胶质细胞转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近年来，阿尔茨海默病（AD）中已发现多种性别特异性生物标志物；然而，关于脑内胶质细胞的研究却鲜有报道。本研究分析了来自GEO数据库中33名AD个体额叶皮层的220,095个单细胞核转录组数据。在胶质细胞中鉴定了性别特异性的差异表达基因（DEGs），包括星形胶质细胞中的243个、小胶质细胞中的1,154个以及少突胶质细胞中的572个。基因本体（GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些基因功能主要集中于突触、神经及激素相关通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）分析鉴定出星形胶质细胞中的关键基因为MT3、CALM2、DLG2、KCND2、PAKACB、CAMK2D和NLGN4Y；小胶质细胞中的关键基因为TREM2、FOS、APOE、APP和NLGN4Y；少突胶质细胞中的关键基因为GRIN2A、ITPR2、GNAS和NLGN4Y。其中，NLGN4Y是唯一在三类胶质细胞中均存在的共享基因，被确定为AD性别特异性的生物标志物。基因-转录因子（TF）-miRNA共调控网络分析揭示了NLGN4Y及其靶向中药（TCMs）的关键调控因子。研究鉴定出昆布（Ecklonia kurome Okam）和麻黄（Herba Ephedrae）两种中药，并展示了其活性成分对AD的作用。最后，对昆布和麻黄的富集分析表明，它们可能作为针对AD性别特异性的潜在治疗候选药物。
引言
阿尔茨海默病（AD）是一种发病率较高的全球性疾病，占痴呆病例的60%–80%1。尽管其发病率高，但AD的发病机制尚未明确，迄今为止尚无有效的治疗方法2。AD的主要病理特征为神经元萎缩以及病理性物质的积聚，主要包括微管相关蛋白Tau和β-淀粉样蛋白（Aβ）3,4。AD的发病机制与自噬异常、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应及能量代谢紊乱相关5。流行病学调查显示，三分之二的AD患者为女性6。AD在病因学、临床表现、预防和治疗方面均存在性别差异。因此，揭示导致AD性别差异的生物学机制，并结合中医药（TCM）进行干预，有望为深入理解AD的发病机制提供更全面的理论框架，并进一步指导精准治疗策略的制定。
神经胶质细胞，尤其是小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可能参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制。在 AD 中，小胶质细胞被激活并发生遗传学改变，从而参与炎症反应、吞噬作用以及 Aβ 的清除7,8；星形胶质细胞发生遗传学改变，影响突触活动、离子稳态以及能量和脂质代谢9；少突胶质细胞则表现出性别特异性的遗传学改变，参与神经元丢失、神经原纤维缠结以及白质病变10,11。
本研究采用单核RNA测序（snRNA-seq）作为一项更优越的技术。与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比，snRNA-seq在样本丰富度、细胞类型完整性和数据可靠性方面具有优势12,13。snRNA-seq已被广泛应用于聚焦阿尔茨海默病（AD）并探索胶质细胞作用的研究中14,15,16。在这些研究领域的广泛应用凸显了snRNA-seq在揭示AD中胶质细胞转录特征方面的有效性。通过利用snRNA-seq的优势，研究人员已能够揭示胶质细胞在AD病理过程中的关键作用，并识别潜在的治疗靶点。为探索AD中性别特异性的神经胶质转录特征及针对AD性别差异的潜在中药（TCMs），本研究分析了来自NCBI GEO公共数据库中AD患者额叶皮层的snRNA-seq数据。进一步分析了性别特异性的差异表达基因（DEGs）、基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以及基因-TF-miRNA网络，以揭示关键生物标志物和潜在发病机制。最后，通过检索Coremine Medical、TCMIP和TCMSP数据库，提出了潜在的中药，并以表格形式展示了其活性成分。
方案
分析的第2至第9步使用R软件实现（参见补充图1和补充文件1），其余步骤则在在线平台上执行。本方案中所用数据库的详细信息（含网址）见材料表。
1. 数据采集
- 访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的公开 Gene Expression Omnibus (GEO) 数据库。
- 在搜索框中查找名为 阿尔茨海默病 的 GEO 数据。
- 在右侧选择 主要生物体 为 Homo sapiens。
注：搜索结果为关于 Homo sapiens 阿尔茨海默病的数据。 - 筛选检索结果后，下载 GSE167490 和 GSE183068 数据文件，每个单细胞核样本均包含 features.tsv、barcode.tsv 和 matrix.mtx 文件。该数据集包含来自额叶皮层的 34 个阿尔茨海默病样本，其中男性样本和女性样本各 17 个（补充表 1）。
2. 样本合并
- 在计算机上相应地配置数据路径和样本名称。导入34个已下载的样本，并使用函数 names 为样本分配性别特异性的名称。
- 使用函数 list 和 Read10X 以批量处理方式为所有样本生成 Seurat 对象，参数设置为 min.cells = 3 和 min.features = 200。
- 使用 RenameCells 函数将样本 ID 作为前缀添加到细胞条形码中，以便在合并过程中保留细胞条形码。这确保了每个细胞在合并后仍保持其唯一身份，并可追溯至其原始样本来源。
3. 质量控制（QC）
- 使用 PercentageFeatureSet 函数计算每个细胞的线粒体基因比例、红细胞基因比例和核糖体基因比例。
- 使用 [[ ]] 操作符将这些计算得到的比例存储到元数据中，以便将该信息直接附加到每个细胞的元数据中。
- 利用 subset 函数进行细胞过滤，设定参数为 nFeature_RNA > 200，nFeature_RNA < 10000，nCount_RNA < 60000，percent.mt < 10，percent.rb < 5，以及 percent.HB < 75。
- 从分析中排除 GSM5106107。
4. 批次效应检测
- 进行数据处理。
- 使用 NormalizeData 函数对数据进行归一化。
- 使用 FindVariableFeatures 函数识别数据集中前 2000 个高变特征。
- 使用 RunPCA 对数据进行主成分分析（PCA）17，保留 50 个主成分。
- 使用 ElbowPlot 函数生成肘部图，以确定后续分析的最佳维度数。考虑前 50 个维度。
- 使用 ScaleData 对数据进行缩放，以确保所有特征处于可比较的尺度上。
- 基于 30 个维度，使用 FindNeighbors 识别最近邻。
- 使用 RunUMAP 应用 UMAP 算法，将数据的维度降低至 30 维。
- 使用 DimPlot 函数对处理后的数据进行可视化，其中 reduction 参数设置为 umap，group.by 参数设置为 orig.ident。
注意：此步骤可生成在降维后的 UMAP 空间中按原始细胞身份分组的数据可视化图。通过检查 UMAP 图发现存在批次效应。细胞根据其批次或实验来源呈现出明显的聚类或分离，表明实验批次影响了基因表达谱。
5. 数据整合
- 使用 SCTransform 函数对数据进行归一化和标准化。
- 应用 harmony 算法18 整合其余的 33 个单细胞核数据。使用 SCT 检测进行整合，并将 harmony 算法的最大迭代次数设置为 20。
- 使用 FindClusters 函数，并将分辨率参数设为 0.07，以识别数据中的不同聚类。
- 使用 RunUMAP 函数，并指定降维维度数（dims = 30），进一步降低数据维度，并在低维空间中可视化聚类结果。
6. 细胞类型注释
- 通过广泛查阅现有文献，收集细胞的标志基因（补充表 2）。
- 在确定细胞簇异质性后，根据特异性表达的标志基因对每个细胞簇的类型进行分类。
- 使用 ggplot2 软件包进行 UMAP 可视化，展示多种细胞类型，其中少突胶质细胞用颜色代码 #DB7093 标注，兴奋性神经元用 #FF69B4，星形胶质细胞用 #1874CD，小胶质细胞用 #63B8FF，少突胶质前体细胞用 #DB7093，抑制性神经元用 #FFC0CB，内皮细胞用 #FF69B4。
- 按性别分层计算各类细胞类型的占比。
7. 胶质细胞数据提取
- 使用 subset 函数从整合的批量数据中提取星形胶质细胞数据。
- 使用 subset 函数从整合的批量数据中提取小胶质细胞数据。
- 使用 subset 函数从整合的批量数据中提取少突胶质细胞数据。
8. 胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）的获取
- 使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别星形胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 < 0.05 且 |avg_log2FC| > 30。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
- 使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 PaleVioletRed 颜色突出显示，下调基因以 Pink 颜色突出显示，稳定表达基因以 DodgerBlue3 颜色突出显示。
- 使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别小胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 < 0.05 且 |avg_log2FC| > 1。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
- 使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 OrangeRed 颜色突出显示，下调基因以 LightSalmon 颜色突出显示，稳定表达基因以 SteelBlue1 颜色突出显示。
- 使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别少突胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 < 0.05 且 |avg_log2FC| > 10。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
- 使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 DeepPink 颜色突出显示，下调基因以 HotPink 颜色突出显示，稳定表达基因以 DeepSkyBlue3 颜色突出显示。
9. 性别特异性差异表达基因的功能富集分析
- 使用 enrichGO 函数对每种胶质细胞类型的性别特异性差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）富集分析。设置以下参数：OrgDb = org.Hs.eg.db，keyType = SYMBOL，ont = ALL，pAdjustMethod = BH，pvalueCutoff = 0.01，以及 qvalueCutoff = 0.05。
- 使用 bitr 函数将基因符号转换为对应的基因 ID。利用 enrichKEGG 函数对每种胶质细胞类型的性别特异性差异表达基因（DEGs）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。调整设置如下：organism = hsa，keyType = kegg，pAdjustMethod = BH，pvalueCutoff = 0.01，以及 qvalueCutoff = 0.05。
10. 小胶质细胞差异表达基因在 GO 和 KEGG 通路中的频率统计、各类小胶质细胞性别特异性差异表达基因的维恩图，以及蛋白质相互作用网络构建
- 使用频率直方图计算胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）在GO和KEGG通路中的出现频率。
- 访问STRING数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
- 选择 Multiple proteins。在搜索框中输入 List Of Names。将 "Organisms" 设置为 Homo sapiens。
- 查看搜索得到的蛋白质列表，点击 Continue 继续操作。
- 通过选择 download 选项导出PPI网络，建议以高分辨率的PNG格式保存。
- 利用维恩图（Venn diagrams）可视化展示前几位性别特异性基因的共表达分布情况。
- 根据维恩图分析结果，确定共有的基因作为本研究中的关键基因。
11. 多因子调控网络构建
- 访问 NetworkAnalyst。
- 点击 Gene List Input，并将生物体指定为 H. sapiens (human)。将 ID 类型设置为 Official Gene Symbol。在搜索框中输入基因名称，然后点击 Upload 和 Proceed。
- 选择 Gene-miRNA Interactions ，并选择 miRTarBase v8.0。点击 OK 确认选择。
- 进入 TF-gene Interactions ，选择 ENCODE 数据库。点击 OK 确认选择。
- 接下来，进入 TF-miRNA Coregulatory Network，点击 OK 继续。
- 最后，选择 Proceed 以生成整合了基因-miRNA 相互作用和转录因子-基因相互作用的多因素调控网络。
12. 基因与靶点中药分析
- 访问 Coremine Medical 在线数据库。
- 输入特定基因名称，并在 Explore 部分的搜索框中选择后缀为 gene/protein, human 的对应基因。
- 浏览 Drugs 部分，识别与所搜索药物相关的中药。
注意：具有统计学意义的药物以蓝色标记。 - 根据其"significance"值确定排名前五的中药作为治疗用中药。
13. 中药成分靶向关键基因的研究概述
- 访问基于整合药理学的中医药研究平台（TCMIP）及中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）。在搜索栏中输入药材名称，以获取其对应的有效成分。
- 在 PubMed 数据库中检索截至 4 月 10 日的文献资料th，2023年。所使用的检索词包括 分子名称 在TCMSP和 化学成分 在TCMIP中以搜索词进行检索，并限定为英文发表的文章。
- 总结并分析作用于阿尔茨海默病（AD）的草药及其相应成分。
14. 验证中药治疗功能在阿尔茨海默病性别特异性中的靶向作用
- 将草药导入TCMIP，并导航至相应的描述页面。
- 使用导出数据功能，选择CSV格式，下载GO - 生物过程、GO - 细胞组分、GO - 分子功能以及Reactome通路的富集术语。
- 使用柱状图可视化每种草药的已下载富集术语。
结果
前额叶胶质细胞转录组图谱的snRNA-seq分析及细胞类型注释
共获得17名男性阿尔茨海默病（AD）患者和17名女性AD患者前额叶皮层的220,095个细胞核及32,077个基因（图1A）。通过降维分析后，UMAP图展示了全部单细胞核前额叶转录组，呈现出不同类型的细胞核聚类（图1B）。按性别分组显示了所捕获的已注释细胞核总数，合计包括58,902个星形胶质细胞、14,265个小胶质细胞、77,466个少突胶质细胞、3,520个内皮细胞、25,252个兴奋性神经元、31,268个抑制性神经元以及9,422个少突胶质前体细胞（图1C）。各胶质细胞类型已知标志基因的平均表达水平被投射至UMAP图中，用于识别不同细胞群体（图1D）。
星形胶质细胞中性别特异性的差异表达基因（DEGs）
共分析了 58,902 个星形胶质细胞核（图 2A），其中来自男性阿尔茨海默病（AD）样本的有 27,504 个（46.69%），来自女性 AD 样本的有 31,398 个（53.31%）。性别特异性差异表达基因（DEGs）分析显示，138 个基因表达上调，包括 DST、CACNA2D3 和 AC016831.7；105 个基因表达下调，包括 CNTN5、RORA、RASSF8 和 CADM2；另有 4,995 个基因表达无显著变化（图 2B）。进一步的 GO 和 KEGG 分析表明，这些差异表达基因主要富集于神经元、突触和激素相关通路，其中神经元通路包括神经元投射发育调控、神经元树突棘等，突触通路包括突触组织及谷氨酸能/胆碱能突触，激素通路包括甲状腺激素合成和胰岛素分泌（图 2C、D）。筛选出频率最高的 30 个基因（图 2E），其中 PLCB1 排名第一。构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以探索这些基因之间的关系（图 2F），鉴定出 DLG2、CAMK2D、CALM2 和 PRKACB 为核心基因。UMAP 图显示了所选差异表达基因的差异表达情况：KCND2、CAMK2D、MT3、LINC00278 和 XIST 在女性 AD 中表达较高而在男性 AD 中较低，而 NLGN4Y、DLG2、PRKACB、CALM2、UTY 和 TTTY14 则呈现相反趋势（图 2G）。最终确定 MT3、CALM2、DLG2、KCND2、PRKACB、CAMK2D 和 NLGN4Y 为星形胶质细胞的性别特异性差异表达基因，如 表 1 所示。
小胶质细胞中性别特异性的差异表达基因（DEGs）
共分析了14,265个小胶质细胞核（图3A），其中5,327个（37.34%）来自男性阿尔茨海默病（AD）患者，8,938个（62.66%）来自女性AD患者。性别特异性差异表达基因显示，224个基因表达上调，包括KCNIP4和LRRTM4；930个基因表达下调，包括APOE、MT-CO3和FTL；另有13,111个基因表达无显著变化（图3B）。进一步的GO和KEGG分析表明，这些差异表达基因主要富集于神经元、吞噬体、激素及其他相关通路，其中神经元通路包括神经元-神经元突触，吞噬相关通路包括吞噬体和吞噬作用调控，激素相关通路包括雌激素信号通路、催产素信号通路等，其他通路包括炎症反应调控、学习或记忆、β-淀粉样蛋白清除等（图3C、D）。筛选出频率最高的30个基因，其中TLR2与TREM2并列第二（图3E）。构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以探索这些基因之间的关系（图3F），并鉴定出ACTB、APP和FYN为核心基因。UMAP图展示了选定差异表达基因的表达差异：APP、FOS、XIST和CTSD在女性AD中表达较高而在男性AD中较低，而NLGN4Y、TREM2、LINC0028、APOE、UTY和TTTY14则呈现相反趋势（图3G）。最终确定TREM2、FOS、APOE、APP和NLGN4Y为小胶质细胞的性别特异性差异表达基因，如表2所示。
少突胶质细胞中性别特异性的差异表达基因（DEGs）
共分析了 77,466 个少突胶质细胞核（图 4A），其中来自男性阿尔茨海默病（AD）样本的为 42,469 个（54.82%），来自女性 AD 样本的为 34,997 个（45.18%）。性别特异性差异表达基因分析显示，384 个基因表达上调，包括 PCDH9、MT-CO1、NEAT1 和 NPAS3；188 个基因表达下调，包括 FRMD4A、PLP1 和 LSAMP；其余 76,894 个基因表达无显著变化（图 4B）。进一步的 GO 和 KEGG 分析表明，这些差异表达基因主要富集于神经元、突触和激素相关通路，其中神经元通路包括神经元树突棘，突触通路包括神经元-神经元突触以及谷氨酸能/多巴胺能突触，激素相关通路包括神经营养因子信号通路、醛固酮合成与分泌、钙信号通路等（图 4C、D）。筛选出频率最高的 30 个基因（图 4E），其中 GRIN2A 与 PSEN1 并列第二。构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以探索这些基因之间的关系（图 4F），鉴定出 GRIN2A 和 GRIA2 为核心基因。UMAP 图显示所选差异表达基因的表达差异：GRIN2A、ITPR2、GNAS 和 XIST 在女性 AD 样本中表达较高而在男性 AD 样本中表达较低，而 NLGN4Y、UTY 和 TTTY14 则呈现相反趋势（图 4G）。最终确定 GRIN2A、ITPR2、GNAS 和 NLGN4Y 为少突胶质细胞的性别特异性差异表达基因，如 表 3 所示。
关键基因与胶质细胞前30个基因之间的相互作用，以及NLGN4Y作为共有共享基因
维恩图和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络展示了关键基因（图5A、B）与每种胶质细胞前30个基因（图5C、D）之间密切相互作用的总体情况。结果表明，ACYB、APP、JUN、PRKACB和DLG2位于PPI网络的核心位置，而NLGN4Y是所有胶质细胞中性别特异性差异表达基因（DEGs）的共有共享基因。
基因-TF-miRNA 网络构建
NLGN4Y-TF-miRNA 网络包含 13 个节点和 12 条边（图 6A）。NLGN4Y 受 1 个转录因子（CTCF）以及 11 个 miRNA 的调控，包括 hsa-miR-185、hsa-miR-137 和 hsa-miR-9。
通过网络展示 NLGN4Y 的靶向药物及中药
在 Coremine Medical 中共检索到 1 种针对 NLGN4Y 的靶向药物和 64 种间接作用的中药。结果中具有统计学意义的中药以蓝色标记。药物抗凝血酶 III 以及五种具有网络关系的中药——黑坤布、五灵脂、夏至草、水蛭和麻黄——被可视化呈现，这些药物被认为具有统计学意义（图 6B）。
靶向中药及其相应活性成分对阿尔茨海默病的影响
对于昆布，从TCMIP数据库中检索出10种成分，从TCMSP数据库中检索出48种成分。通过检索PubMed数据库，发现其中5种成分与阿尔茨海默病相关：岩藻甾醇、松茸甾醇、硫胺素、十八碳四烯酸和高良姜素-A，其中前两种成分的口服生物利用度（OB）≥30%，且类药性（DL）≥0.18。详细信息见表4。对于麻黄，从TCMIP数据库中检索出28种成分，从TCMSP数据库中检索出363种成分。采用与昆布相同的方法，共检索出25种与阿尔茨海默病相关的成分。其中，口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18的6种成分——槲皮素、柚皮素、柚皮苷元、二氢槲皮素、豆甾醇和木犀草素——列于表5的顶部。
Hub基因-疾病网络及富集分析
Hub基因-疾病网络如图6C所示。昆布与麻黄的共同靶基因为ACHE，其相关疾病为阿尔茨海默病（AD）和认知功能障碍。昆布单独作用的靶基因包括ALKBH3和ELOVL4，分别相关的疾病为衰老和脑萎缩。
昆布的GO富集结果（BP、MF和CC）（图7A、图8A、图9A）和麻黄的GO富集结果（图7B、图8B、图9B）以柱状图形式展示。同时展示了昆布（图10A）和麻黄（图10B）的Reactome通路。用箭头标记的富集条目与“激素-突触-神经元”轴相关，例如昆布中的类固醇激素受体活性、神经元投射和类固醇激素介导的信号通路，以及麻黄中的化学突触传递、雌激素依赖性基因表达和神经系统过程。
图1：基因表达数据获取、单核RNA测序分析及细胞类型鉴定。（A）用于分析准备的来自GEO数据集的样本。（B）所有细胞核的二维UMAP图（男性N = 116,101；女性N = 103,994）。（C）按性别划分的各类细胞比例。（D）5个已确立的细胞类型标志基因的平均表达在UMAP图上的投影。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：星形胶质细胞具有异质性，并在阿尔茨海默病中表现出性别特异性的转录组变化。（A）星形胶质细胞核的UMAP图（N = 59,010）。（B）性别特异性差异表达基因（DEGs）。（C,D）圆形图展示了从GO和KEGG数据库获得的星形胶质细胞差异表达基因功能显著富集的术语（GO：C，KEGG：D）。（E）在GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个星形胶质细胞-性别差异表达基因。（F）GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个星形胶质细胞-性别差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（G）显著的性别特异性差异表达基因的平均表达水平在UMAP图上的投影。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：小胶质细胞具有异质性，并在阿尔茨海默病中表现出性别特异性的转录组变化。（A）小胶质细胞核的UMAP图（N = 14,265）。（B）性别特异性差异表达基因（DEGs）。（C,D）圆形图展示了从小胶质细胞DEGs的GO和KEGG数据库中获得的显著功能富集术语（GO：C，KEGG：D）。（E）在GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个小胶质细胞-性别DEGs。（F）GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个小胶质细胞-性别DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（G）显著的性别特异性DEGs的平均表达水平在UMAP图上的投影。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：少突胶质细胞具有异质性，并在阿尔茨海默病中表现出性别特异性的转录组变化。（A）少突胶质细胞核的UMAP图（N = 77,466）。（B）性别特异性差异表达基因（DEGs）。（C,D）圆形图展示了从GO和KEGG数据库获得的少突胶质细胞差异表达基因的功能富集结果（GO：C，KEGG：D）。（E）在GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个少突胶质细胞-性别差异表达基因。（F）GO和KEGG通路中出现频率最高的前30个少突胶质细胞-性别差异表达基因的蛋白质互作（PPI）网络。（G）显著的性别特异性差异表达基因的平均表达水平在UMAP图上的投影。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：差异表达基因（DEGs）及其高频基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的重叠情况。（A,B）维恩图展示每种胶质细胞的关键基因及其相应的PPI网络。（C,D）维恩图展示每种胶质细胞中在GO和KEGG通路中富集的前30个高频性别特异性差异表达基因及其相应的PPI网络。请点击此处查看该图的高清版本。
图 6：以 NLGN4Y 及其靶向中药为核心构建的网络图。（A）基因-转录因子-微小RNA协同调控网络。（B）NLGN4Y 的基因-药物-中药网络。（C）昆布与麻黄的中药-基因-疾病网络。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：昆布与麻黄的 GO（BP）富集分析。（A）昆布的前 20 个富集生物过程。（B）麻黄的前 20 个富集生物过程。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：昆布与麻黄的 GO（分子功能）富集分析。（A）昆布的前 20 个富集分子功能。（B）麻黄的前 20 个富集分子功能。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：昆布与麻黄的GO（CC）富集分析。（A）昆布前20个富集的细胞组分。（B）麻黄前20个富集的细胞组分。请点击此处查看该图的放大版本。
图10：昆布与麻黄的Reactome通路分析。（A）昆布的Reactome通路。（B）麻黄的Reactome通路。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：星形胶质细胞中性别特异性差异表达基因的关键基因。 请点击此处下载该表格。
表2：小胶质细胞中性别特异性差异表达基因的关键基因。 请点击此处下载该表格。
表3：少突胶质细胞中性别特异性差异表达基因的关键基因。 请点击此处下载该表格。
表4：昆布的活性成分对阿尔茨海默病（AD）的作用。 请点击此处下载该表格。
表5：麻黄活性成分对阿尔茨海默病的作用。 请点击此处下载该表格。
补充图1：R软件使用的截图。 请点击此处下载该文件。
补充表1：样品信息。 请点击此处下载该文件。
补充表 2：标记基因。 请点击此处下载该文件。
补充文件 1：R 代码。 请点击此处下载该文件。
讨论
阿尔茨海默病（AD）的流行病学、病理学及临床表现中已发现性别特异性19。本研究通过分析AD患者中具有性别特异性的胶质基因及相关通路，进一步证实了“激素-突触-神经元轴”潜在的病理机制。NLGN4Y 是三种胶质细胞中唯一共有的基因，被选为AD性别特异性的生物标志物。调控NLGN4Y的转录因子（TF）和miRNA与性别差异及神经系统发育密切相关。此外，靶向中药昆布和麻黄被认为可能影响“激素-突触-神经元轴”，并通过调节性别特异性，成为AD治疗的潜在候选药物。
与其他整合算法相比，Harmony算法在整合稀有细胞数据、优化大样本的内存使用和计算速度，以及适应具有多样化细胞来源和技术平台的复杂实验设计方面具有显著优势18。质控和数据整合步骤是提高分析准确性和可靠性的关键环节，使研究人员能够更深入地理解阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的生物学机制。严谨执行这些步骤对于获得单细胞核RNA测序实验结果的整体质量和有效性至关重要。
本方案中的一项改进是使用 SCTransform 函数对数据进行归一化和标准化20。此步骤确保了数据在后续分析中具有可比性和一致性。为减轻批次效应，额外进行了数据整合步骤，有助于校正批次效应并提高结果的准确性。当其中一个样本（GSM5106107）的表现与其他样本相比出现异常时，进行了故障排查，并将其从分析中剔除。
本研究的一个局限性在于所采用的样本量相对较小，这可能会限制研究结果对更广泛人群的代表性。此外，使用来自多个实验室和研究团队的数据引入了内在的异质性，可能限制了结果的可重复性和普适性。尽管通过基因-转录因子-miRNA共调控网络鉴定了NLGN4Y的关键调控因子，但仍需进一步的实验验证以明确这些调控因子的功能作用及其潜在机制。虽然富集分析提示麻黄和昆布可能是性别特异性阿尔茨海默病治疗的潜在候选药物，但仅依赖生物信息学预测不足以确立其有效性和安全性。验证这些有前景药物的治疗效果，还需开展额外的实验和临床研究。
本研究中阐述的方法在多个研究领域展现出显著潜力，特别是在阿尔茨海默病（AD）中胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）的识别方面。此类研究有望阐明男性与女性个体之间细微的致病差异，从而推动性别特异性治疗策略的制定。此外，该方法还可应用于其他神经退行性疾病，有助于识别性别特异性的差异表达基因，并加深对这些疾病潜在机制的理解。
综上所述，本研究提出了一种全面且稳健的分析阿尔茨海默病（AD）患者单细胞核RNA测序数据的实验方案，有望为开发个体化治疗干预措施铺平道路。此外，本研究中采用的方法可推广至其他神经退行性疾病，有助于揭示性别特异性的基因表达模式，并加深对这些复杂疾病的理解。
披露
本手稿不存在利益冲突，所有作者均已批准该投稿发表。
致谢
作者感谢 Jessica S Sadick、Michael R O'Dea、Philip Hasel 等人提供了 GSE167490 数据集。作者感谢 Faten A Sayed、Lay Kodama、Li Fan 等人提供了 GSE183068 数据集。作者感谢刘书晴在数据分析方面的帮助，以及杨雯提供数据分析平台。本研究受到国家自然科学基金（82174511）、成都中医药大学杏林学者计划、学科人才科研提升项目（QJJJ2022001）、辽宁省兴辽人才计划（XLYC 1807083）、四川省中医药管理局基金（2023MS578）、国家级大学生创新创业训练计划项目（202310633003X）以及成都中医药大学大学生科研实践创新课题（ky-2023100）的资助。刘汉杰和杨慧参与了研究设计、数据收集与解释，以及论文的撰写和修改。刘书晴和李思雨参与了研究设计、数据收集及论文撰写。杨雯和 Anwar Ayesha 负责数据收集与解释。谭鑫负责图表的制作。蒋岑、刘毅和谢露霜提出了研究构想，并对稿件进行了审阅和修改。所有作者均对文章作出了贡献，并认可所提交的版本。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数据库 | |||
| Coremine Medical 数据库 | 由挪威、中国科学院、中国医学科学院、美国国家医学图书馆及其他机构联合开发 | 当您在 CoreMine Medical 中探索概念时，您将访问一个结构化的数据库，该数据库会根据统计相关性将重要概念与您的主题相关联并进行排序。例如，如果您输入 "阿尔茨海默病，" 除了检索讨论该疾病的文献和资源外，您还将能够查看网络和列表，以展示您的查询概念与其他生物医学概念之间的关联。这不仅为您提供了与检索主题相关概念的概览，还作为浏览这些概念相关信息的界面。 链接：https://coremine.com/medical/ | |
| 基因表达综合数据库（GEO） | 美国国家生物技术信息中心（NCBI） | GEO 是一个公共功能基因组学数据存储库，支持符合 MIAME 标准的数据提交。该数据库接收基于芯片和测序的数据。同时提供多种工具，帮助用户查询和下载实验数据以及经过审编的基因表达谱。 网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| 基于整合药理学的中药研究平台（TCMIP，版本：2.0） | 无 | 基于整合药理学的中医药网络计算研究平台（TCMIP v2.0）简介，http://www.tcmip.cn/）该平台是以《中药百科全书》（ETCM）在线数据库为基础的智能数据挖掘平台，集成了中医药大数据管理与药理学计算服务。其目标在于揭示中医药理论的科学内涵与中医药原创思维的科学价值，总结并传承名医经验，控制中药质量，阐释中药作用原理，开展中药新药研发，特别是现代药物组合的发现与优化，提供坚实的数据基础与分析工具。在TCMIP v1.0基础上进行了全面升级，包含五大数据库与七大功能模块。通过系统集成与模块整合，实现对多层级关联的综合分析 "病证方剂" 交互网络可快速构建。作为智能化数据挖掘平台，TCMIP v2.0 将为揭示中医理论的科学内涵和中医原创思维的科学价值、名老中医经验的总结与传承、中药质量控制、中药药理作用机制阐释、中药新药研发，特别是现代中药复方发现与优化，提供坚实的数据基础与分析平台。 网址：http://www.tcmip.cn/TCMIP | |
| NetworkAnalyst | 无 | Networkanalyze 是一个用于基因表达分析和荟萃分析的在线可视化分析平台。该平台可进行基因表达的比较、定量、差异和富集分析，蛋白质-蛋白质相互作用分析，多数据集整合分析，并能够绘制高价值图像，如 PCA 图、蛋白质-蛋白质相互作用网络图、热图、火山图、韦恩图等。 网址：https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ | |
| PubMed 数据库 | 美国国家生物技术信息中心（NCBI） | PubMed 数据库是由美国国家医学图书馆（NLM）维护的生物医学文献数据库，旨在向全球的科学家、医生、研究人员和学生提供最新的医学研究成果。该数据库收录了来自世界各地的生物医学文献，包括期刊文章、论文、书籍等。截至目前，PubMed 数据库已收录超过 3000 万篇文章，并每周持续更新。 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| R 软件 | Ross Ihaka 和 Robert Gentleman | R 是一种用于统计计算和图形的语言及环境。它是一个 GNU 项目，类似于由贝尔实验室（原 AT&T）开发的 S 语言和环境。&T（现为 Lucent Technologies）的 John Chambers 及其同事开发。R 可以被视为 S 的一种不同实现。存在 一些重要的差异，但为 S 编写的许多代码在 R 中无需修改即可运行。 网址：https://www.r-project.org/ | |
| 传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP） | 浙江九维健康有限公司 | TCMSP 不仅是一个数据仓库，还是一个分析平台，供用户全面研究中药（TCM）：包括活性成分的鉴定、药物靶点的筛选、化合物-靶点-疾病网络的构建，以及涉及类药性（DL）、口服生物利用度（OB）、血脑屏障（BBB）、肠道上皮渗透性（Caco-2）、ALogP、负性表面积分数（FASA-）和分子中负电荷原子数量的详细药物药代动力学信息 氢键 供体/受体 (黄酮/黄酮醇含量)。迄今为止，TCMSP 已引起广泛关注，多个研究团队在约一年内利用我们的 TCMSP 数据库发表了十余篇论文。 网址：https://tcmsp-e.com |
参考文献
- Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 19 (4), 1598-1695 (2023).
- Xie, L., et al. Electroacupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Front Neurosci. 15, 689629(2021).
- Xie, L., et al. Inflammatory factors and amyloid beta-induced microglial polarization promote inflammatory crosstalk with astrocytes. Aging (Albany NY). 12 (22), 22538-22549 (2020).
- Hampel, H., et al. The amyloid-beta pathway in Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 26 (10), 5481-5503 (2021).
- Baik, S. H., et al. A breakdown in metabolic reprogramming causes microglia dysfunction in Alzheimer's disease. Cell Metab. 30 (3), 493-507 (2019).
- Fisher, D. W., Bennett, D. A., Dong, H. Sexual dimorphism in predisposition to Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 70, 308-324 (2018).
- Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone h4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metab. 34 (4), 634-648 (2022).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease. J Cell Biol. 217 (2), 459-472 (2018).
- Brandebura, A. N., Paumier, A., Onur, T. S., Allen, N. J. Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurosci. 24 (1), 23-39 (2023).
- Peng, L., Bestard-Lorigados, I., Song, W. The synapse as a treatment avenue for Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 27 (7), 2940-2949 (2022).
- Tubi, M. A., et al. White matter hyperintensities and their relationship to cognition: Effects of segmentation algorithm. Neuroimage. 206, 116327(2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Soreq, L., Bird, H., Mohamed, W., Hardy, J. Single-cell RNA sequencing analysis of human Alzheimer's disease brain samples reveals neuronal and glial specific cells differential expression. PLoS One. 18 (2), e0277630(2023).
- Sadick, J. S., et al. Astrocytes and oligodendrocytes undergo subtype-specific transcriptional changes in Alzheimer's disease. Neuron. 110 (11), 1788-1805 (2022).
- Chen, Y., Colonna, M. Microglia in Alzheimer's disease at single-cell level. Are there common patterns in humans and mice. J Exp Med. 218 (9), e20202717(2021).
- Brase, L., et al. Single-nucleus RNA-sequencing of autosomal dominant Alzheimer disease and risk variant carriers. Nat Commun. 14 (1), 2314(2023).
- Ringner, M. What is principal component analysis. Nat Biotechnol. 26 (3), 303-304 (2008).
- Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
- Vegeto, E., et al. The role of sex and sex hormones in neurodegenerative diseases. Endocr Rev. 41 (2), 273-319 (2020).
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 20 (1), 296(2019).
重印与许可
