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方法文章

CD4 T细胞在复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

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DOI：

10.3791/66553

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2024年1月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

采用小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，从活化阶段及免疫效应功能的角度，研究CD4 T细胞在EAE发病及复发过程中的作用。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）并导致脱髓鞘。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究MS的典型动物模型。在本研究中，我们旨在探讨CD4 T细胞在EAE发病和复发过程中的作用，重点关注其激活阶段及免疫应答。为建立EAE小鼠模型，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55肽段与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后对雌性小鼠进行免疫。每日评估临床评分，结果显示EAE组小鼠表现出典型的复发-缓解模式。苏木精-伊红（H&E）染色和Luxol快蓝（LFB）染色分析显示，EAE小鼠中枢神经系统存在显著的炎性细胞浸润和脱髓鞘现象。在激活阶段，CD4+CD69+效应T（Teff）细胞和CD4+CD44+CD62L-效应记忆T（Tem）细胞均可能参与EAE的启动 ，但复发阶段可能主要由CD4+CD44+CD62L- Tem细胞主导。此外，在免疫功能方面，辅助性T（Th）1细胞主要参与EAE的启动过程，而Th1和Th17细胞均参与复发阶段，且在EAE病理过程中，调节性T（Treg）细胞的免疫抑制功能受到抑制。

引言

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）并导致脱髓鞘1,2。最近的一项研究表明，它是影响青年人群的最常见致残性疾病，且其发病率在全球范围内持续上升3。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的典型动物模型，可模拟人类MS炎症阶段的多个方面4。从免疫功能的角度来看，尚未接触过抗原的初始CD4 T细胞被称为辅助性T（Th）0细胞。这些细胞经过成熟和活化过程后表现出多种功能。根据其特定功能，CD4 T细胞可分为多个亚群，包括Th1、Th2、调节性T（Treg）、滤泡辅助性T（Tfh）、Th17、Th9和Th22细胞5。普遍认为，Th1和Th17细胞亚型是EAE发病机制中的关键因素6。Th1细胞可分泌干扰素γ（IFN-γ），而Th17细胞则分泌白细胞介素（IL）-17及其他炎症因子，这些因子能够激活小胶质细胞和星形胶质细胞等其他免疫细胞。这些细胞产生如IL-18、IL-12、IL-23和IL-1β等炎症性细胞因子7，可进一步诱导Th1/Th17细胞的免疫应答，导致进行性脱髓鞘和轴突损伤。从活化阶段的角度来看，CD4 T细胞具有预先决定的命运，可发育为不同的细胞亚群和分化 状态，包括初始型、效应型和记忆型T细胞8。初始CD4 T细胞在不同环境中增殖并分化为具有不同功能的多种效应亚群9。大多数效应细胞寿命较短，仅有少量T细胞发育为记忆T细胞，当再次遇到相同抗原时可迅速发挥效应功能，从而为机体提供高效且持久的保护10,11。

尽管目前的研究表明CD4 T细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发生过程中发挥着重要作用，但不同CD4 T细胞亚群（根据其活化阶段和免疫效应功能分类）如何参与EAE的发病和复发仍不明确。在本研究中，我们通过免疫髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55肽在C57BL6/J小鼠中建立了EAE模型，并重点围绕CD4 T细胞的活化阶段及其免疫功能，探讨了EAE的发病 和复发机制。

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方案

本研究共使用18只6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，随机分为对照组（n = 6）和EAE组（n = 12）。小鼠购自宁夏医科大学实验动物中心。小鼠饲养于温湿度可控、12小时光照/黑暗循环的环境中，并可自由获取新鲜水和食物。研究开始前，已获得宁夏医科大学实验动物伦理委员会的伦理批准。

1. C57BL/6 小鼠中复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎的建立

  1. 试剂溶解
    1. 将 5.4 mg MOG35-55（材料表）溶解于 1.8 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中。称取 12.6 mg 结核分枝杆菌 H37RA（材料表），加入 1.8 mL 完全弗氏佐剂（CFA）溶液（材料表）中。使用移液器（材料表）将 360 µL 百日咳毒素（PTX；材料表）溶解于 7.2 mL PBS 中。
  2. MOG35-55 与 CFA 乳剂的制备
    1. 使用步骤 1.1 中准备的两个 5 mL 注射器分别吸取 MOG35-55 溶液和 CFA 溶液，并通过三通阀连接。在冰上持续混合 1 小时，直至形成乳白色的油包水乳剂。
      注意：当乳剂滴入水中后漂浮于水面且不扩散时，表明乳剂已成功制备。
  3. 小鼠麻醉
    1. 拧开麻醉机蒸发器前端的加液密封盖，沿中心密封螺钉缓慢倒入 20 mL 异氟烷，然后锁紧加液密封盖。切换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流与麻醉诱导箱（材料表）相通。
    2. 连接空气泵电源，打开空气泵开关，旋转并调节氧气流量计前端的气源阀，使输出气体流速为 400 mL/min。打开蒸发器，将诱导浓度调节至 3%，等待麻醉气体充满诱导箱。
    3. 约 1 分钟后，将小鼠放入诱导箱内，关闭诱导箱，等待小鼠进入深度睡眠状态，表现为肌肉松弛、呼吸平稳；此时可判定小鼠已达到理想的麻醉状态（材料表）。
      注意：在小鼠完全麻醉前，应切换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流与麻醉面罩相通。
  4. 小鼠免疫
    1. 使用带针头的 1 mL 注射器，在 EAE 组小鼠背部四个位点皮下注射步骤 1.2 制备的乳剂，每点注射 200 µL，注射部位位于腋窝和腹股沟平面脊柱两侧约 0.5 cm 处12。每个位点使用 50 µL 乳剂（材料表）。
  5. PTX 注射
    1. 抓住小鼠尾巴将其从笼中取出，放置于笼盖金属网上。用第四和第五指夹住尾巴并轻轻上提，使身体和四肢保持前伸趋势。用中指和无名指固定小鼠头部，并捏住背部皮肤。
    2. 在步骤 1.4 免疫后的 0 小时和 48 小时，使用带针头的 1 mL 注射器沿腹中线两侧各 0.5 cm 处进行腹腔注射，穿刺深度为 1–2 cm，每只注射 200 µL PTX（材料表）。
      注意：在 MOG35-55 免疫后 48 小时注射 PTX 前，需按照步骤 1.3 所述方法对小鼠进行麻醉。需持续观察小鼠，直至其意识恢复到能够维持胸卧位为止。
    3. 对照组小鼠采用相同方法给予生理盐水处理，并每日评估临床评分。
      注意：根据以下标准评估小鼠 EAE 症状13：0 = 无疾病症状，1 = 尾巴完全瘫痪，2 = 后肢部分瘫痪或无力，3 = 后肢完全瘫痪，4 = 前肢和后肢均瘫痪，5 = 濒死状态。

2. 组织学染色分析

  1. 脑组织采集
    1. 按照步骤1.3麻醉小鼠。通过颈椎脱位处死小鼠，打开胸腔充分暴露心脏。剪开右心耳，使用装有针头的20 mL注射器从左心室缓慢灌注预冷的生理盐水，直至肝脏变为灰白色。
    2. 用4%多聚甲醛缓慢灌注，直至尾尖翘起、身体变僵硬、肝脏变坚韧。剪下头部，切开颅骨，用镊子取出脑组织，并将其固定于4%多聚甲醛溶液中24小时（材料表）。
  2. 石蜡切片制备
    1. 梯度脱水：将步骤2.1所得脑组织依次浸入70%乙醇中1小时、80%乙醇中1小时、95%乙醇中1小时、无水乙醇中1小时，更换新鲜无水乙醇，继续浸渍1小时（材料表）。
    2. 透明处理：将步骤2.2.1所得脑组织浸入二甲苯中30分钟，更换新鲜二甲苯，继续浸渍直至组织透明（材料表）。
    3. 包埋：将步骤2.2.2所得脑组织浸入石蜡中1小时，更换新鲜石蜡，继续包埋1小时，脱模后切成6 µm切片，将载玻片置于热水中展片，37 °C烘干，室温保存（材料表）。
    4. 脱蜡：将步骤2.2.3所得脑组织切片浸入二甲苯中20分钟，更换新鲜二甲苯，继续浸渍20分钟，再转移至无水乙醇中5分钟，更换新鲜无水乙醇，浸渍5分钟，随后浸入75%乙醇中5分钟，用自来水冲洗（材料表）。
    5. 苏木精-伊红（H&E）染色：将步骤2.2.4所得组织切片用苏木精染液染色3–5分钟，然后用自来水冲洗。用苏木精分化液短暂处理组织，彻底用自来水冲洗。再用苏木精Scott蓝化液处理组织，随后用自来水冲洗。依次浸入85%乙醇5分钟、95%乙醇5分钟，最后用伊红染液染色5分钟（材料表）。
    6. 脱水：将步骤2.2.5所得组织切片依次浸入无水乙醇中5分钟，更换新鲜无水乙醇，继续浸渍5分钟，再次更换新鲜无水乙醇，浸渍5分钟，随后浸入二甲苯中5分钟，更换新鲜二甲苯，浸渍5分钟，最后用中性树胶封片（材料表）。
    7. 使用显微镜观察脑组织切片，并进行图像采集与分析（材料表）。

3. LFB 染色分析

  1. 髓鞘采集：从鼠类脊柱头部末端起向尾部末端方向截取2个节段，再从尾部末端向头部方向截取2个节段，将脊髓冲出至尾端，随后将脊髓固定于4%多聚甲醛溶液中24小时。
    注意：髓鞘取自步骤2.1中相同的实验小鼠，心脏灌注步骤与2.1相同。
  2. 石蜡切片脱蜡与水化：将步骤3.1中的切片依次放入二甲苯中20分钟，更换新鲜二甲苯后继续浸泡20分钟，无水乙醇中5分钟，更换新鲜无水乙醇后浸泡5分钟，75%乙醇中5分钟，最后用自来水冲洗。
  3. 快蓝染色：将Luxol快蓝染色液A置于60 °C烘箱中预热30分钟。将步骤3.2的切片放入染色液A中，用塑料膜覆盖，染色1小时以防止切片干燥，随后取出切片并迅速用自来水冲洗。
  4. 背景分化：将步骤3.3的切片放入热的Luxol快蓝染色液B中2秒，立即转入Luxol快蓝染色液C中分化15秒，用水冲洗至髓鞘呈蓝色而背景几乎无色为止。
  5. 伊红复染：将步骤3.4的切片置于65 °C烘箱中干燥。干燥完成后从烘箱中取出，冷却至室温。将切片浸入95%乙醇并进行伊红复染1分钟。
  6. 脱水与封片：将步骤3.5的切片依次放入无水乙醇中5分钟，更换新鲜无水乙醇后继续浸泡5分钟，再次更换新鲜无水乙醇后继续浸泡5分钟，二甲苯中5分钟，更换新鲜二甲苯后浸泡5分钟。冲洗并干燥样本后，用中性树胶封片。
  7. 显微镜观察：使用正置光学显微镜（材料表）采集并分析图像。

4. 流式细胞术分析

  1. 打开小鼠腹腔，用镊子取出脾脏，并在冰上用剪刀将其剪成1.5–2.5 cm的小块，置于PBS中。使用2.5 mL注射器活塞在10 mL含2%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中研磨脾脏，并通过70 µm细胞筛网，以获得单细胞悬液（材料表）。
    注意：脾脏来自步骤2.1中的同一只小鼠。
  2. 将步骤4.1中获得的悬液转移至15 mL离心管中，加入5 mL红细胞裂解缓冲液，冰上裂解10分钟。用含2% FBS的RPMI-1640洗涤，350 × g离心5分钟，弃上清，用含2% FBS的RPMI-1640重悬细胞。
  3. 使用自动细胞计数仪（材料表）计数细胞，并将细胞浓度调整至1 × 106 个/mL。
  4. 取100 µL细胞悬液加入1.5 mL离心管中，加入1 µL抗小鼠CD16/32抗体14（0.5 mg/mL），孵育30分钟以阻断非特异性染色。用RPMI-1640洗涤，350 × g离心5分钟，弃上清，用含2% FBS的RPMI-1640将细胞重悬于100 µL溶液中。
  5. 加入针对效应T细胞（Teff）的特异性抗体CD45（Alexa Fluor 700）、CD3（FITC）、CD4（APC）和CD69（BV674）进行染色15，每种抗体各2 µL，孵育30分钟。另取细胞加入针对记忆T细胞（Tem）的特异性抗体CD45（Alexa Fluor 700）、CD3（FITC）、CD4（APC）、CD44（BV421）和CD62L（PE）进行染色16，每种抗体各2 µL，孵育30分钟。染色后用RPMI-1640洗涤，350 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于350 µL PBS中。使用流式细胞仪及配套软件分析细胞比例（材料表）。

通过细胞因子微球阵列分析细胞因子

  1. 使用细胞因子微球阵列（材料表）检测小鼠脑组织中的 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子（TNF）-α 和 IFN-γ，方法如下所述。
  2. 按照步骤 2.1 所述方法收集小鼠脑组织。
  3. 总蛋白提取：取 50 mg 脑组织（对照组、EAE 峰值期组和 RR 期组各三只小鼠），切割并称重后放入 1.5 mL 离心管中，加入含 PMSF、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液 500 µL。
  4. 将脑组织切成约 1 mm3 的小块，使用超声波匀浆器在 400 W 条件下处理，开启 5 秒，关闭 5 秒，重复 5 次。将离心管置于冰上 10 分钟，于 12000 x g 离心 5 分钟，收集上清液（材料表）。
  5. 按以下方法制备小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子标准品。
    1. 打开一管冻干的小鼠 Th1/Th2/Th17 标准品，将其转移至一个 15 mL 圆锥形聚丙烯管中，并在管顶标记为“标准品”。
    2. 用 2.0 mL 检测稀释液重悬标准品，室温平衡 15 分钟，通过移液轻轻混匀重悬后的蛋白。
    3. 标记若干 12 mm × 75 mm 离心管，并按以下稀释比例依次排列：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128 和 1:256。在每支标记好的试管中加入 300 µL 检测稀释液。
    4. 进行梯度稀释：将最高浓度标准品 300 µL 转移至 1:2 稀释管中，通过移液充分混匀；然后从 1:2 管中取 300 µL 转移至 1:4 管，依此类推直至 1:256 管。另准备一支仅含检测稀释液的 12 mm × 75 mm 管作为 0 pg/mL 的阴性对照。
      注意：需通过移液充分混匀，禁止涡旋，以防微球上的抗体脱落。
    5. 为混合小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子捕获微球，准备 19 支试管，包括每组（对照组、EAE 峰值期组和 RR 期组）3 个样本的标准品。在混合前，剧烈涡旋捕获微球悬液 5 秒。将每种捕获微球各取 190 µL 加入同一管中，标记为“混合捕获微球”，并彻底涡旋混匀。
      注意：抗体偶联的微球会随时间沉降，因此在取样前必须涡旋混匀原管。
    6. 开始检测时，涡旋混匀混合捕获微球，向所有检测管中各加入 50 µL 微球悬液。根据表 1，向对照管中加入 50 µL 小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子标准品稀释液。
    7. 向所有检测管中加入 50 µL 小鼠 Th1/Th2/Th17 PE 检测试剂，室温避光孵育 2 小时。每管加入 1 mL 洗涤缓冲液，于 200 x g 离心 5 分钟，小心吸弃上清液。
    8. 每管加入 300 µL 洗涤缓冲液重悬微球沉淀，使用 FCAP Array 软件分析小鼠 Th1/Th2/Th17 细胞因子数据（材料表）。

  

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结果

临床评分评估
如图1所示，对照组小鼠未表现出任何临床症状。用MOG35-55免疫的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）组小鼠在免疫后约12天出现尾部麻痹。至第16天，症状发展为完全性后肢瘫痪（定义为高峰期，Peak）。此后，症状逐渐缓解。小鼠的临床症状在约第25天再次加重，并于第30天左右再次达到完全性后肢瘫痪（定义为复发期，RR）。值得注意的是，此次症状持续时间较前次更长，呈现出典型的复发-缓解特征。复发-缓解型EAE小鼠在疾病进展过程中会经历发作、缓解和复发等不同阶段，具有一定的周期性和波动性。

组织学分析
对照组小鼠脑组织结构完整，血管分布均匀，界限清晰，无炎性细胞浸润。（图2A）。EAE组小鼠在疾病高峰期，脑组织中可见大量炎性细胞浸润（图2B），在血管周围形成袖套样改变（红色箭头指示）。同样，在EAE组小鼠的复发缓解...

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讨论

多发性硬化症（MS）是中枢神经系统最常见的自身免疫性脱髓鞘疾病，全球有数百万人受其影响17。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是模拟MS临床病理特征的典型动物模型18。研究表明，MS患者由于中枢神经系统内轴突和神经元的退化，会出现认知功能障碍及其他残疾19,20,21。在EAE模型的高峰期和复发-缓解（RR）阶段，小鼠表现出尾部及后肢瘫痪。此外，观察到炎性细胞浸润中枢神经系统，导致不同程度的髓鞘丢失。这些结果表明本实验中EAE模型建立成功。

MOG35-55 与 CFA 的乳化过程需在冰上进行，以防止匀质过程中因产热导致 MOG35-55 降解。百日咳毒素（PTX）通过腹腔注射给予，以增强血管通透性，使 T 细胞更易穿过血脑屏障并到达神经元周围的髓鞘22。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到宁夏回族自治区自然科学基金（2022AAC03601 和 2023AAC02087）及宁夏医科大学科研基金（XM2019052）的资助。感谢宁夏医科大学医学科学与技术研究中心的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉机蒸发器诺瓦普20-17368
 异氟烷Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司792632
70 μm细胞滤筛XIYAN Co., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD45 抗体Biolegend103128
APC 抗小鼠 CD4 抗体Biolegend100616
自动细胞计数器江苏集慕生物科技有限公司JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) 小鼠 Th1/Th2/Th17 CBA 试剂盒BD 生物科学560485
生物素标记的抗小鼠 CD16/32 抗体Biolegend101303
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD69 抗体Biolegend104532
BV786 大鼠抗小鼠 CD62L（MEL-14）BD Pharmingen563109
柱状组织&Cell 蛋白提取试剂盒上海酶工程生物医药科技有限公司PC201Plus
完全弗氏佐剂Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司 SLCH4887
脱水机DIAPATHDonatello
一次性无菌注射器（1 mL）Yikang Group210820
一次性无菌注射器（2.5 mL）Yikang Group210820
一次性无菌注射器（5 mL）Yikang Group210820
染色机DIAPATHGiotto
包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5
乙醇干细胞研究中心100092683
胎牛血清普罗赛尔生命科学&科技有限公司FSP500
FITC 豚鼠抗小鼠 CD3e (145-2C11)BD Pharmingen553062
流式细胞仪Becton, Dickinson and CompanyFACSCelesta
流式细胞仪Becton, Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo 软件BD 生物科学10.8.1
冷冻平台武汉俊杰电子有限公司 JB-L5
载玻片ServicebioG6004
HE染色液套装ServicebioG1003
苏木精-伊红溶液ServicebioG1002
高速冷冻离心机赛默飞世尔科技Mogafugo8R
成像系统尼康尼康 DS-U3
Luxol快蓝染色试剂盒ServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
结核分枝杆菌 H37RABD Pharmingen231141
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）AnaSpecAS-60130-1
中性树胶干细胞研究中心10004160
组织者KEDEEKD-P
烘箱实验室GFL-230
病理切片机LeicaRM2016
百日咳博德特菌来源的百日咳毒素Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司P7208
磷酸盐缓冲液ServicebioG4202
移液0.5-10 μLDLAB Scientific7010101004
移液器 100-1000 μLDLAB Scientific7010101014
移液器 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640普罗赛尔生命科学&有限公司PM150110
三通阀广东康华医疗有限公司A06
组织牵开器浙江科华仪器有限公司KD-P
直立式光学显微镜尼康尼康 ECLIPSE E100
二甲苯干细胞研究中心10023418

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