本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。
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本文内容
摘要
摘要
核小体是真核生物染色质的基本单位，其生物物理特性及与染色质结合蛋白的相互作用已成为众多单分子研究的重点。在这些研究中，DNA上的核小体重建通常采用盐梯度透析法，该方法可精确控制沿DNA锚定链形成的核小体的位置和数量。然而，该方案耗时较长，且需要大量DNA和组蛋白八聚体作为输入材料。为了提供一种替代策略，本文描述了一种利用组蛋白伴侣蛋白Nap1的原位（in situ）核小体重建方法，适用于单分子力谱和荧光显微镜检测。该方法使用户能够在任意DNA模板上组装核小体，无需强核小体定位序列，可根据需求调节核小体密度，并减少试剂用量。原位（in situ）核小体的形成在数秒内完成，实验流程更简便，且可便捷地过渡到单分子测量。文中进一步介绍了两种下游检测方法的应用实例，用于探究核小体的力学特性以及可视化单个蛋白质在染色质上的行为。
引言
真核生物染色质的基本包装单位是核小体，其中约147个碱基对（bps）的DNA缠绕在一组核心组蛋白八聚体上1,2。除了基因组包装功能外，核小体结构还构成了另一层丰富的生物物理调控机制，染色质结合蛋白在执行其多种功能时可利用这一结构3,4。由于这些单位在极小尺度上发挥作用（例如，纳米级长度、皮牛顿级作用力），实验上获取和测量核小体的物理特性一直面临技术挑战，因此对其探测需要足够的灵敏度和精度，以有效揭示其功能机制。此外，染色质结合蛋白通常与其底物发生瞬时相互作用，而大多数整体测量方法缺乏足够的时间分辨率来阐明这些相互作用的动力学过程5。幸运的是，单分子技术的发展使得实时观察和操控单个蛋白质及其相互作用成为可能，从而揭示了发生在纳米尺度上的分子事件的机制信息6。特别是，单分子关联力与荧光显微技术（smCFFM）结合了高分辨率荧光检测与力学操控工具，能够同时解析染色质及染色质-蛋白质复合物的力学特性、组成成分及其协调行为7,8。
在特异性采用....
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 生物素标记DNA的制备
- 准备一个120 µL的反应体系，包含20 µg的λ DNA、33 µM的生物素标记dCTP、33 µM的生物素标记dUTP、33 µM的生物素标记dATP、33 µM的dGTP、10单位的Klenow酶以及1× NEB Buffer 2。
注意：本实验步骤特别使用线性双链（ds）、无甲基化的噬菌体λ基因组DNA（48,502 bp），其具有12个核苷酸 （nt）的5'单链（ss）DNA突出端23。然而，该方案可调整用于任何长度或序列的线性双链DNA，只要其含有至少数个核苷酸的5'单链突出端，突出端的长度和核苷酸序列将决定在每个末端安装的生物素化核苷酸数量，以用于后续在光镊之间进行连接。此外，反应体系可按比例缩小。例如，可在30 µL反应体系中使用5 µg DNA。另外，通过此方法生成的DNA底物不具有扭转约束。如需构建具有扭转约束的DNA，可参考已发表的文献24,25。 - 在室温下孵育反应体系15分钟。
- 加入10 mM EDTA，并在75 °C下孵育20分钟。
- 进行乙醇....
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结果
使用步骤3中所述的装置（图1A），通过二维扫描中出现的红色荧光焦点（图1B，左）或在延时显微图（kymograph）上的轨迹（图1B，右），可观察到DNA连接链上核小体的形成。正确缠绕的核小体在共聚焦检测的衍射极限内（约300 nm）表现出随时间保持静止的荧光轨迹。值得注意的是，在衍射极限范围内彼此靠近形成的多个核小体在空间上无法分辨，会表现为更亮的焦点或轨迹。然而，通过对单个核小体轨迹的光漂白步数进行分析，常观察到1步（图1C）或2步（图1D）光漂白事件，结合本样品中H4蛋白约70%的标记率，表明这些焦点主要包含单核小体。此外，基于本实验条件下单个LD655荧光染料的平均光子计数，估算了每条核小体轨迹中标记H4蛋白的拷贝数，结果显示核小体位点中绝大多数（>75%）含有1或2个标记的H4拷贝（图1E<.......
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讨论
本方案在核小体重建方面具有多项优势，包括减少试剂用量和操作时间，同时能够实现分子伴侣依赖性的核小体形成，且适用于任意（潜在天然的）DNA序列。此外，原位（in situ）方法简化了实验流程，并便于向单分子水平的核小体力学及蛋白质-染色质相互作用检测过渡。然而，该方法的局限性包括无法精确控制核小体在DNA上的定位（即使引入强核小体定位序列），以及难以精确调控每条DNA锚定链上形成的核小体数量（尽管可通过标准化实验流程进行经验性优化）。因此，采用该方法的研究者是以牺牲核小体定位和密度的精确控制为代价，换取更简便的操作流程和更低的试剂需求，具体选择应根据实验的具体需求而定。还需注意的是，由于锚定DNA较长（约48.5 kbp）以及缓冲液条件的限制，当前方案无法解析DNA的外圈结构32。若需获取有关DNA外圈结构以及核小体间堆叠的信息，使用者可选择缩短DNA长度，在DNA上加载更高密度的核小体，和/或采用盐梯度透析法，将核小体定位在由规则连接子长度分隔的强定位序列上。最后，组蛋白八聚体与DNA之间可能发生非特异性结合；因此，在结果解读时需同时考虑荧光信号和力学信号。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
G. N. L. C. 承认获得美国国立卫生研究院（NIH）下属国家心理健康研究所的支持，资助编号为 F31MH132306。S. L. 获得罗伯逊基金会、国际Rett综合征基金会以及美国国立卫生研究院（NIH）（资助编号 R01GM149862）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x HR 缓冲液 | N/A | N/A | 30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM 醋酸镁, 50 mM 氯化钾, 0.1 mg/mL BSA |
| 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水） | N/A | N/A | 137 mM 氯化钠, 2.7 mM 氯化钾, 10 mM 磷酸氢二钠, 1.8 mM 磷酸二氢钾 |
| 冰醋酸 | Millipore Sigma | AX0074-6 | 用于配制 tris acetate |
| Biotin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-BIOX-S | |
| Biotin-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
| Biotin-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A9418-50G | 溶于 H2O 并经 0.22 µm 滤膜过滤 |
| Cy3 马来酰亚胺单反应性染料 | Cytiva | PA23031 | 带有马来酰亚胺功能基团的 Cy3 荧光染料 |
| dGTP | New England Biolabs | N0442S | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 R | Fisher Scientific | 05-414-051 | 带制冷功能的台式离心机 |
| 乙醇，纯级 | Millipore Sigma | 459844 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Millipore Sigma | E9884 | 溶于 H2O 配制成 0.5 M 溶液 |
| 人组蛋白八聚体（H4, L50C；H2A, K119C） | N/A | N/A | 重组组蛋白蛋白及携带标记突变的组蛋白均按先前所述方法在本实验室纯化（参见参考文献 33, 34, 35, 36）。简言之，重组组蛋白在 BL21 (De3) pLySS 细胞（Promega）中表达。超声破碎后收集包涵体，并在变性条件下提取组蛋白。组蛋白被透析至缓冲液 A（7 M 尿素, 10 mM tris 盐酸盐 pH 8.0, 100 mM 氯化钠, 1 mM EDTA, 和 5 mM 2-巯基乙醇）中，然后加入装有 Q Sepharose Fast Flow（Cytiva）的重力柱。流出液再加入装有 SP Sepharose Fast Flow（Cytiva）的重力柱，通过添加含 600 mM 氯化钠的缓冲液 A 洗脱组蛋白。携带标记突变的组蛋白（H4, L50C；H2A, K119C）在纯化后，使用马来酰亚胺功能化染料（Cytiva, Lumidyne）以 20:1 的染料与蛋白摩尔比进行偶联（参见参考文献 33, 34）。组蛋白八聚体通过在变性条件下等摩尔混合各野生型或荧光标记组蛋白，透析至含 2 M 氯化钠的高盐缓冲液中，随后按先前所述方法通过尺寸排阻色谱纯化（参见参考文献 36, 37）。此外，单个组蛋白蛋白或预制组蛋白八聚体也可商业购买（例如 Epicypher）。 |
| 成像缓冲液 | N/A | N/A | 20 mM tris 盐酸盐 pH 8.0, 100 mM 氯化钠 |
| Klenow 片段（3' 至 5' 外切酶缺陷型） | New England Biolabs | M0212S | |
| λ DNA（dam⁻, dcm⁻） | Thermo Fisher Scientific | SD0021 | 无甲基化 λ DNA |
| LD655-MAL | Lumidyne Technologies | 9 | 带有马来酰亚胺功能基团的 LD655 荧光染料 |
| 连接组蛋白 H1.4（A4C） | N/A | N/A | 本实验室制备的纯化重组蛋白（参见参考文献 38） |
| LUMICKS C-Trap Dymo | LUMICKS | N/A | 双光镊配置；仪器标准材料由制造商提供 |
| 醋酸镁溶液 | Millipore Sigma | 63052-100ML | 用于配制 HR 缓冲液 |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | 随 Klenow 片段试剂盒提供 |
| Pluronic F-127 | Millipore Sigma | P2443-250G | 溶于 H2O 并经 0.22 µm 滤膜过滤 |
| 氯化钾 | Millipore Sigma | P3911 | 用于配制 PBS 和 HR 缓冲液 |
| 磷酸二氢钾 | Millipore Sigma | P0662 | 用于配制 PBS |
| S. cerevisiae Nap1 | N/A | N/A | Nap1 按先前所述方法在本实验室纯化（参见参考文献 33, 34）。此外，Nap1 也可商业购买（例如 Active Motif）。 |
| 醋酸钠 | Millipore Sigma | 241245 | 溶于 H2O 配制成 3 M 溶液 |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | S9888 | 用于配制 PBS 和成像缓冲液 |
| 磷酸氢二钠 | Millipore Sigma | S9763 | 用于配制 PBS |
| SPHERO 生物素包被微球（3.0–3.4 µm） | Spherotech | TP-30-5 | |
| Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c 分光光度计 | Fisher Scientific | ND2000 | NanoDrop 分光光度计 |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-500 | 溶于 H2O 并调节至适当 pH；用于配制成像缓冲液和 tris acetate |
参考文献
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260....
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