本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。
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本文内容
摘要
摘要
适应性免疫反应依赖于T细胞在病原体和异物刺激下通过血液、淋巴和组织迁移的能力 。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要整合来自环境和局部免疫细胞的多种信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和黏附分子。此外，T细胞的运动性还受到动态变化的微环境信号的影响，这些信号可改变T细胞的活化状态、转录图谱以及黏附分子的表达等。体内环境中，这些相互交织的因素使得难以区分对T细胞迁移起独立作用的信号。本实验方案提供了一整套从T细胞分离到计算机辅助分析的方法，用于在高度特异的环境条件下实时评估T细胞迁移 。 这些条件 可能有助于 阐明调控T细胞迁移的分子机制，加深我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制性证据 。 深入理解影响细胞 迁移的分子相互作用，对于开发更有效的治疗手段具有重要意义 。
引言
T细胞是适应性、抗原特异性免疫应答的主要效应细胞。在群体水平上，T细胞具有异质性，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。其中，CD8+ T细胞是免疫系统主要的细胞毒性效应细胞，能够直接清除被感染或功能异常的细胞1。
成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴系统循环以寻找抗原。在感染过程中，T细胞在血液或组织中接触到抗原后，迅速迁移至脾脏或最近的引流淋巴结，以启动有效的免疫应答。无论哪种情况，T细胞都会被激活，经历克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液（如果尚未在血液中）。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体的下调，以及多种整合素和趋化因子受体的上调，这些受体对组织特异性迁移至关重要2。最终，T细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号在内的多种环境信号共同驱动的。
趋化因子 broadly 可分为两大类：（1）稳态信号，对细胞分化、存活和基础功能至关重要；（2）炎症信号，例如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，这些信号在趋化作用中起必需作用。通常情况下，趋化因子形成一种信号梯度，驱动细胞的定向迁移，即趋化作用，同时还能激活整合素的表达1。趋化作用受到精细调控且高度敏感，T 细胞能够响应微小的梯度变化，从而被引导至特定方向或位置。
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方案
动物实验方案已获罗切斯特大学动物资源委员会批准。本研究中的小鼠饲养于罗切斯特大学动物设施的无病原体环境中。实验使用6至12周龄（15-30 g）的雄性/雌性C57BL/6小鼠。小鼠组织分离可在实验台面上进行，操作时需佩戴手套保护双手 以及 佩戴面罩遮盖口鼻，也可在生物安全柜内操作。所有细胞培养和培养板制备操作必须在生物安全柜内进行。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. CD8+ T细胞的纯化与激活
- 材料准备
- 用于CD8+ T细胞的阴性筛选：从杂交瘤细胞系GK1.5和M5/114抗体的上清液中制备阴性筛选培养基，这两种抗体分别产生抗CD4和抗MHCII。将上清液按1:1比例混合，过滤后于4 °C保存以备后续使用（>每百万总细胞含每种抗体>0.5 µg）。或者，也可使用市售的CD8+ T细胞分离试剂盒。
- 用于T细胞活化：将500 µL CD3（10 µg/mL）和CD28（16 µg/mL）抗体加入1x DPBS（不含钙和镁）中，加入未经组织培养（TC）处理的24孔板中，并于4 °C过夜孵育，以确保抗体结合到板上。
注意：抗体和蛋白质在未经TC处理的培养板/培养皿上的包被效果优于常规TC处理的培养板，因此T细胞制备过程中使用未经....
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结果
通过流式细胞术检测CD69和CD44表达水平的升高，可确认T细胞的活化状态，这两种分子是小鼠T细胞活化的典型标志物。6此外，可通过流式细胞术检测CD3以确定T细胞群体的纯度+ CD8+ T细胞。该方法可获得 >90 % CD8+ T细胞群
T细胞迁移可通过软件辅助的细胞追踪程序进行评估，这些程序既具有可重复性，又可根据研究者的需求进行调整。用于确定实验效应的一些基本参数包括：细胞速度（单位时间内迁移的长度，用于确定细胞移动的快慢）、位移（迁移距离，即从起点到终点的直线距离，用于确定细胞迁移的远近）、轨迹长度（迁移距离，即迁移路径的总长度，用于确定细胞迁移的总路程）以及迂曲指数（MI，取值范围为0至1，用于衡量迁移路径的直线程度，1表示完全直线）。这些参数被用于评估初始态和活化态CD8+ T细胞在CXCL12存在下沿ICAM-1包被的玻璃表面爬行时的迁移差异（图1）。与初始态T细胞相比.......
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讨论
理解汇聚信号的生物学效应 体内 具有挑战性且不易解释。本文提供的方案为在高度明确且具有生物学相关性的条件下理解T细胞迁移提供了一种合理的方法。这些条件可根据研究者的判断进行设定，且该方案可针对不同T细胞群体、活化状态和细胞表型的需求进行调整。此外，通过明确的抗体阻断方法，可对多种配体与受体相互作用进行探究。7,8 配体包被玻璃的实验步骤8,9,10该技术还一直是开发工程化免疫细胞的关键平台11,12.
实验方案中的关键步骤包括次级淋巴组织的分离、T细胞的活化、玻璃成像培养皿的包被以及数据分析。对于缺乏经验的操作者而言，嵌在组织中的淋巴结 .......
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披露
作者声明，所有研究和稿件撰写均在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
感谢金实验室的历任和现任成员，他们为这些实验方案的逐步完善做出了贡献。代表性数据的获得得益于美国国立卫生研究院国家过敏与传染病研究所（NIAID NIH HHS）资助项目 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/美国，以及美国国立心肺血液研究所（NHLBI NIH HHS）资助项目 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/美国。本出版物的部分成果得益于机构露丝·L·卡什斯坦国家研究服务奖（Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）资助编号 T32 GM135134 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 培养皿 | 康宁 | 353003 | 或同等产品 |
| 15 mL 一次性离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339650 | 或同等产品 |
| 1× DPBS | Gibco | 14190144 | 不含钙和镁 |
| 6 孔板，非 TC 处理 | Corning | 3736 | 或同等产品 |
| 70 µm细胞滤筛 | FisherScientific | 352350 | 或同等产品 |
| ACK裂解缓冲液 | ThermoFisher | A1049201 | 或同等产品 |
| Allegra 6KR 离心机 | 赛默飞世尔科技 | Sorvall 16R 配备 TX400 3655 转子及吊篮 | 或同等产品 |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | 或同等产品 |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | 或同等产品 |
| 离心 | 赛默飞世尔科技 | Sorvall ST 16R | 或同等产品 |
| IV型胶原蛋白 | Corning | 354233 | 或同等产品 |
| DeltaT 培养皿，0.17 mm 厚玻璃，透明 | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads 羊抗大鼠 IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 磁力架 | 赛默飞世尔科技 | 12301D | 或同等产品 |
| EasySep小鼠T细胞分离试剂盒 | 干细胞 | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | 或同等产品 |
| 纤连蛋白 | SigmaAldrich | 10838039001 | 或同等产品 |
| Fiji | http://fiji.sc/ | 网络链接 | |
| 滤光片组 | 尼康或奥林巴斯 | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | 或同等产品 |
| HQ CCD相机 | CoolSNAP | 或同等产品 | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | 网络链接 | |
| ImageJ 自动追踪插件 | http://imagej.net/TrackMate | 网络链接 | |
| ImageJ 手动追踪插件 | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | 网络链接 | |
| L-15 | 各种 | 参见材料部分 | 培养基配方：Leibovitz’不含酚红的 L-15 培养基（Gibco），添加 1–5 g/L 葡萄糖 |
| L-15培养基（Leibovitz），无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 21083027 | |
| 鲁尔锁一次性注射器 | Fisher Scientific | 14-955-459 | 或同等产品 |
| 淋巴细胞分离液 | 康宁 | 25-072-CI | 或同等产品 |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM非必需氨基酸 | 赛默飞世尔科技 | 11140050 | 或同等产品 |
| 显微镜加热系统 | Okolab | okolab.com | 可提供定制设计 |
| Millicell EZ 载玻片 | Millipore | C86024 | |
| Mojosort 小鼠 CD8+ Naïve T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480043 | |
| 小鼠 E-钙黏蛋白 | R&D 系统 | 8875-EC-050 | 或同等产品 |
| 小鼠外科解剖工具包 | Fisher Scientific | 13-820-096 | 或同等产品 |
| NIS 元件 | 尼康 | 软件 | |
| 非TC 24孔板 | 康宁 | 353047 | 或同等产品 |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15140122 | 或同等产品 |
| 蛋白A | 赛默飞世尔科技 | 或同等产品 | |
| R9 | 各种 | 参见材料部分 | 培养基配方：RPMI 1640 培养基，添加 10% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂（Gibco）、20 mM HEPES 缓冲液（Gibco）、1% MEM 非必需氨基酸（Gibco）、50 μM β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich） |
| 重组小鼠 ICAM-1 Fc 融合蛋白 | R&研发系统 | 796-IC-050 | 或同等产品 |
| 重组小鼠 IL2 | Biolegend | 575410 | 或同等产品 |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | 或同等产品 |
| T形针 | Fisher Scientific | S99385 | 或同等产品 |
| TE2000-U 显微镜 | 尼康 | 或同等产品 | |
| 多种重组小鼠趋化因子 | R&D 系统 | 或同等产品 | |
| VCAM-1 Fc 融合蛋白 | R&安培和D系统 | 643-VM-050 | 或同等产品 |
| Volocity | PerkinElmer | 软件 |
参考文献
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al....
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