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方法文章

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

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DOI：

10.3791/66580

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2024年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

本文内容

摘要

本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。

摘要

适应性免疫反应依赖于T细胞在病原体和异物刺激下通过血液、淋巴和组织迁移的能力 。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要整合来自环境和局部免疫细胞的多种信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和黏附分子。此外，T细胞的运动性还受到动态变化的微环境信号的影响，这些信号可改变T细胞的活化状态、转录图谱以及黏附分子的表达等。体内环境中，这些相互交织的因素使得难以区分对T细胞迁移起独立作用的信号。本实验方案提供了一整套从T细胞分离到计算机辅助分析的方法，用于在高度特异的环境条件下实时评估T细胞迁移 。 这些条件 可能有助于 阐明调控T细胞迁移的分子机制，加深我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制性证据  。 深入理解影响细胞 迁移的分子相互作用，对于开发更有效的治疗手段具有重要意义 。

引言

T细胞是适应性、抗原特异性免疫应答的主要效应细胞。在群体水平上，T细胞具有异质性，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。其中，CD8+ T细胞是免疫系统主要的细胞毒性效应细胞，能够直接清除被感染或功能异常的细胞1。

成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴系统循环以寻找抗原。在感染过程中，T细胞在血液或组织中接触到抗原后，迅速迁移至脾脏或最近的引流淋巴结，以启动有效的免疫应答。无论哪种情况，T细胞都会被激活，经历克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液（如果尚未在血液中）。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体的下调，以及多种整合素和趋化因子受体的上调，这些受体对组织特异性迁移至关重要2。最终，T细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号在内的多种环境信号共同驱动的。

趋化因子 broadly 可分为两大类：（1）稳态信号，对细胞分化、存活和基础功能至关重要；（2）炎症信号，例如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，这些信号在趋化作用中起必需作用。通常情况下，趋化因子形成一种信号梯度，驱动细胞的定向迁移，即趋化作用，同时还能激活整合素的表达1。趋化作用受到精细调控且高度敏感，T 细胞能够响应微小的梯度变化，从而被引导至特定方向或位置。

除了这些与T细胞相关的因素外，迁移还受到细胞外基质（ECM）组成和密度的影响。细胞外基质由包括胶原蛋白和蛋白聚糖在内的多种蛋白质构成的致密网络组成，为T细胞表面的黏附性整合素受体提供了支架。整合素是一类多样化的跨膜蛋白家族，每种整合素都具有高度特异性的结合结构域以及下游信号传导效应。T细胞表面整合素受体的动态表达使其能够快速适应不断变化的环境3。重要的是，整合素连接了细胞外基质与细胞内细胞骨架肌动蛋白网络，二者协同作用产生T细胞移动所需的推进力。

总之，迁移模式因免疫细胞表型或环境信号的不同而有所差异。这些复杂的生物学过程受到T细胞表面、周围细胞以及局部感染组织中细胞因子、趋化因子和整合素表达的严格调控。体内的这些迁移机制可能 十分复杂，并可能由多种叠加信号共同作用所致4。由于这种复杂性，可能难以在看似相互关联的变量之间建立因果关系。为克服这一难题，已有多种体外方法可用于研究T细胞迁移的特定方面，例如对特定趋化因子信号的响应，以及T细胞整合素与细胞外基质结合蛋白之间的相互作用。本实验方案介绍了分离和激活小鼠CD8+ T细胞的方法，以及在二维空间中进行体外迁移实验和用于分析特定T细胞迁移行为的计算分析工具。这些方法对使用者具有优势，因为它们不需要文献中所述其他某些细胞迁移实验所必需的复杂材料或设备。通过这些方法获得的细胞迁移数据可以 以简明的方式提供免疫应答的证据，从而为进一步的体内深入研究奠定基础。

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方案

动物实验方案已获罗切斯特大学动物资源委员会批准。本研究中的小鼠饲养于罗切斯特大学动物设施的无病原体环境中。实验使用6至12周龄（15-30 g）的雄性/雌性C57BL/6小鼠。小鼠组织分离可在实验台面上进行，操作时需佩戴手套保护双手 以及 佩戴面罩遮盖口鼻，也可在生物安全柜内操作。所有细胞培养和培养板制备操作必须在生物安全柜内进行。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. CD8+ T细胞的纯化与激活

  1. 材料准备
    1. 用于CD8+ T细胞的阴性筛选：从杂交瘤细胞系GK1.5和M5/114抗体的上清液中制备阴性筛选培养基，这两种抗体分别产生抗CD4和抗MHCII。将上清液按1:1比例混合，过滤后于4 °C保存以备后续使用（>每百万总细胞含每种抗体>0.5 µg）。或者，也可使用市售的CD8+ T细胞分离试剂盒。
    2. 用于T细胞活化：将500 µL CD3（10 µg/mL）和CD28（16 µg/mL）抗体加入1x DPBS（不含钙和镁）中，加入未经组织培养（TC）处理的24孔板中，并于4 °C过夜孵育，以确保抗体结合到板上。
      注意：抗体和蛋白质在未经TC处理的培养板/培养皿上的包被效果优于常规TC处理的培养板，因此T细胞制备过程中使用未经TC处理的培养板。
  2. 将70 µm细胞筛置于一个10 cm培养皿（或等效容器）中，并向筛内加入2 mL R9培养基（R9培养基：RPMI 1640 ，添加10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌剂、20 mM HEPES缓冲液、1% MEM非必需氨基酸、50 µM β-巯基乙醇）。
  3. 根据实验设计要求，选取具有适当遗传背景、性别、年龄和体重的小鼠。
  4. 采用CO2吸入法实施安乐死，随后进行颈椎脱位，或根据当地动物护理与使用规程并经机构批准的其他适当安乐死方法。
  5. 将小鼠仰卧放置，四肢伸展并垂直于身体，使用小鼠解剖T型针或等效工具将足垫固定于解剖板上。使用小鼠外科解剖剪在腹部腹侧皮肤下部做一条浅表性、位于中线的切口，并沿中线直切至下颌（约8 cm）。分离皮肤与腹膜层，暴露淋巴结。将皮肤垂直于躯干方向拉伸并固定。5
    1. 使用钝头镊子（或标准小鼠外科解剖工具包中的其他合适工具）双侧轻柔地摘取颈、腋窝、臂部和腹股沟淋巴结。转移至第1.2步中已准备好的细胞筛中。
    2. 切开腹膜，取出脾脏。转移至第1.2步中已准备好的细胞筛中。
    3. 将小鼠尸体放入适当的生物危害废物容器中处理。
  6. 在第1.2步准备的70 µm细胞筛上，使用2 mL R9培养基通过反复顺时针和逆时针旋转组织破碎工具半圈，对次级淋巴组织进行机械破碎，以制备单细胞悬液。
    注意：使用3 mL或10 mL鲁尔锁式注射器的活塞端可有效压碎并均质化组织。用户可根据需要选择其他替代材料。
  7. 用7 mL培养基冲洗细胞、注射器末端、细胞筛和培养皿，确保细胞筛保持直立，防止较大的组织碎片或细胞聚集体进入单细胞悬液中。
  8. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
  9. 在室温（20 °C）下以270 x g 离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。
  10. 加入500 µL裂解缓冲液，作用1分钟以去除红细胞。加入9.5 mL R9培养基稀释，于270 x g （20 °C）离心5分钟，弃去上清液。
  11. 将细胞沉淀重悬于10 mL先前制备的含抗MHCII和抗CD4抗体的阴性筛选培养基中（见步骤1.1.1）。室温（20 °C）摇动30分钟。
  12. 以270 x g离心5分钟 ，弃去上清液。用10 mL R9培养基洗涤3次。
  13. 同时，在15 mL锥形管中，用7 mL培养基洗涤200 µL羊抗大鼠IgG磁珠。将管置于磁力架上，吸除培养基，重复洗涤两次。最后将磁珠重悬于7 mL R9培养基中。
  14. 以270 x g （20 °C）离心5分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于第1.13步制备的7 mL磁珠悬液中。室温（20 °C）摇动45分钟。
  15. 通过磁珠耗竭法富集CD8+ T细胞。将锥形管直接置于磁力架上（不加盖），静置3分钟以去除与抗体/磁珠结合的细胞。CD8+ T细胞应保留在上清中。保持管子仍在磁力架上，用移液管或等效工具收集细胞悬液，转移至新的15 mL管中。于270 x g （20 °C）离心5分钟，并用培养基洗涤3次。
  16. 用1x DPBS洗涤预包被的活化板（步骤1.1.2）两次，注意不要直接将液体滴加至板底表面。
  17. 可选步骤：进行活/死淋巴细胞分离以去除死细胞。
    1. 将细胞转移至15 mL锥形管中。轻柔地将2 mL淋巴细胞分离液加至细胞悬液底部。在室温下以900 x g低加速度和低减速度离心10分钟。
      注意：活细胞将聚集在培养基与分离液的界面处（中间白色层），死细胞则沉淀于管底，可在最后弃去。
    2. 将含有活淋巴细胞的中间层转移至新管中，在室温下以270 x g离心5分钟，弃去上清液。
  18. 将细胞沉淀重悬于12 mL含10 U/mL重组小鼠IL-2的培养基中。每孔接种1 mL至未经TC处理的24孔板中，于37 °C孵育过夜。

2. 分离活化的 CD8+ T 细胞

  1. 使用标准台式光学显微镜，采用 4x 或 10x 物镜观察细胞。
    注意：活化的 T 细胞相较于未活化 T 细胞体积更大，呈圆形或长形，并在孔内形成密集的细胞簇。
  2. 为收集活化细胞，使用 1 mL 移液器吹打细胞，确保充分混匀孔板边缘的细胞，然后将细胞转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。
    注意：活化细胞黏附性更强，需更剧烈地进行吹打。
  3. 用 1 mL R9 培养基洗涤孔内残留细胞，必要时重复一次。在 270 x g（20 °C）条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. 按照步骤 1.17–1.18 的方法进行活/死淋巴细胞分离，以去除死细胞。
  5. 在非 TC 6 孔板中，使用含 IL-2 的 R9 培养基每 3–4 天通过去除死细胞的方式维持 T 细胞生长。
    注意：在早期活化阶段，T 细胞在尺寸较小的孔中增殖效果更佳，可能与 T 细胞之间的相互接触或 T 细胞分泌的可溶性因子促进其活化有关。T 细胞快速增殖会导致培养基在培养后 24–48 小时内变黄。此时，应收集细胞并将其转移至更大的孔（未包被、非 TC 6 孔板）中，加入足量新鲜培养基以维持细胞生长（通常每孔 5 mL）。当培养基颜色变黄提示耗尽时，或每 3–4 天定期更换新鲜培养基。

3. 玻璃培养皿的准备

  1. 使用 300 µL/cm2 的 Protein A（0.1 mg/mL）在 4 °C 下过夜包被玻璃细胞迁移小室或培养板，然后通过向培养皿中加入 1× DPBS 并倾倒弃去的方式洗涤两次，再进行下一步操作。
  2. 在室温下，使用 300 µL/cm2 的重组小鼠 ICAM-1 或 VCAM-1 Fc 融合蛋白（0.1–2.75 mg/mL）与一种重组小鼠趋化因子（0.1–10 µg/mL）共同包被迁移小室或培养板，孵育 2–3 小时。其他整合素配体（如纤连蛋白、小鼠 IV 型胶原和小鼠 E-钙黏蛋白）可在 4 °C 下以 2.5–10 µg/mL 的浓度直接包被小室过夜。
    1. 在加细胞前，立即通过向培养皿中加入 1× DPBS 并倾倒弃去的方式洗涤小室两次。
      注意：T 细胞在不同浓度的整合素配体和趋化因子中的迁移行为可能因其活化、分化、致敏和启动状态的不同而有所差异。强烈建议在多种不同浓度下检测细胞迁移能力。
  3. 若需共培养 T 细胞与其他细胞（如癌细胞）以实时测量 T 细胞对癌细胞的杀伤作用，则应在成像开始前 24 小时将贴壁细胞接种于包被玻璃的培养板上。

4. 细胞的制备

  1. 可选：根据制造商方案，或在 37 °C 条件下，用所选细胞示踪染料以每 1 x 107 个细胞 1 µg/mL 的浓度在 1x DPBS 中对 T 细胞和贴壁细胞染色 15 分钟。
  2. 使用血细胞计数板或等效设备对细胞进行计数。
  3. 在 37 °C 培养箱中，将 1 x 105 个 CD8+ T 细胞（或所需数量）接种于补充有 1–5 g/L 葡萄糖的 Leibovitz's L-15 培养基中。
    注意：L-15 培养基的配方无需使用 CO2-碳酸氢钠系统，其通过游离碱性氨基酸、磷酸盐缓冲液和半乳糖维持 pH 水平。
  4. 可选：进行整合素阻断。
    1. 将 T 细胞与针对整合素的阻断抗体（1–10 µg/mL，抗小鼠 CD11a (M17/4)、抗小鼠 CD18 (M18/2)、抗小鼠 VLA-4 (9C10)）预先孵育 10 分钟，并在相同抗体存在条件下进行爬行实验。

5. 时间序列显微成像

  1. 进行视频显微镜观察。
  2. 对于T细胞，每10-60秒采集一次明场和荧光图像，持续10-60分钟，或根据所需的采集参数进行设置。
    注意：T细胞迁移对温度敏感，小鼠T细胞迁移的最佳温度为37 °C。本方案所用的温度控制系统包括一个封闭且隔热的显微镜载物台，配备有附加加热系统。成像室置于成像载物台上，该室周边设有充满蒸馏水的槽，可在成像过程中维持恒定的温度和湿度。微孔位于成像室的中央。

6. T细胞迁移的软件辅助分析

  1. 使用 Volocity 软件评估 T 细胞迁移。
    1. 开放 Volocity 并创建一个 新的图像序列.
    2. 选择 和 移动 将所有延时视频显微镜影片导入 Volocity 的蓝色区域。
    3. 使用对比度增强工具调整亮度和对比度至研究者期望的设置。
    4. 检查图像尺寸：20倍镜下为0.325 µm，10倍镜下为0.65 µm。
    5. 序列：设置时间点 （例如，若每15秒拍摄一张图像，持续20分钟，则共81张图像，即每分钟4张）。
    6. 取消勾选 所有时间点 在 测量选项卡.
    7. 使用强度查找对象——滑动滑块，使其恰好位于峰值右侧。
    8. 根据大小排除对象：排除直径小于10 µm和大于100 µm的细胞，以去除细胞碎片或非细胞颗粒。排除迁移时间少于记录时间20%的T细胞（具体阈值可根据不同研究者的定义而调整）。
    9. 忽略静态物体 （复选框）
    10. 自动连接断裂的纤维束 （复选框）
    11. 将最短路径设置为不超过 20 µm。
    12. 细胞迁移轨迹是随时间连接同一细胞位置的连线。确保追踪算法通过检测每个帧中分割所识别的单个物体位置，并在各帧之间匹配这些物体，从而实现追踪。
    13. 通过选择保存新方案 测量 > 保存实验方案 > 命名新方案
    14. 点击 测量所有时间点 在 测量选项卡.
    15. 按时间跨度从高到低排序轨迹。
    16. 记录研究者定义为具有良好轨迹的所有细胞的轨迹 ID 编号。自动细胞追踪后，需对每个细胞轨迹进行手动评估，以排除错误识别或中断的轨迹。排除具有不良轨迹的细胞。
    17. 将文件导出为逗号分隔的文本格式，并将数据传输至所需的分析软件。
      注意：基本参数：速度（µm/min）、位移（净移动距离，µm）、轨迹长度（总路径长度，µm）和蜿蜒指数（MI；净位移/轨迹长度。MI = 1 表示完全直线的轨迹）。
  2. 使用 Image J 进行手动追踪。
    1. 打开插件并选择 追踪 和 手动追踪设置参数——时间间隔、x/y 轴校准（像素大小）和 z 轴校准（在手动追踪模式下）。通过点击开始单个细胞的追踪 添加轨迹，首先在第一个时间点选择一个细胞，并将其延续至所有时间点。接着，点击 末端轨迹对所有目标细胞重复此步骤。
      注意：Trackmate 是另一种用于细胞追踪的工具，是一款可获取的自动追踪软件 通过 ImageJ 插件

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结果

通过流式细胞术检测CD69和CD44表达水平的升高，可确认T细胞的活化状态，这两种分子是小鼠T细胞活化的典型标志物。6此外，可通过流式细胞术检测CD3以确定T细胞群体的纯度+ CD8+ T细胞。该方法可获得 >90 % CD8+ T细胞群

T细胞迁移可通过软件辅助的细胞追踪程序进行评估，这些程序既具有可重复性，又可根据研究者的需求进行调整。用于确定实验效应的一些基本参数包括：细胞速度（单位时间内迁移的长度，用于确定细胞移动的快慢）、位移（迁移距离，即从起点到终点的直线距离，用于确定细胞迁移的远近）、轨迹长度（迁移距离，即迁移路径的总长度，用于确定细胞迁移的总路程）以及迂曲指数（MI，取值范围为0至1，用于衡量迁移路径的直线程度，1表示完全直线）。这些参数被用于评估初始态和活化态CD8+ T细胞在CXCL12存在下沿ICAM-1包被的玻璃表面爬行时的迁移差异（图1）。与初始态T细胞相比...

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讨论

理解汇聚信号的生物学效应 体内 具有挑战性且不易解释。本文提供的方案为在高度明确且具有生物学相关性的条件下理解T细胞迁移提供了一种合理的方法。这些条件可根据研究者的判断进行设定，且该方案可针对不同T细胞群体、活化状态和细胞表型的需求进行调整。此外，通过明确的抗体阻断方法，可对多种配体与受体相互作用进行探究。7,8 配体包被玻璃的实验步骤8,9,10该技术还一直是开发工程化免疫细胞的关键平台11,12.

实验方案中的关键步骤包括次级淋巴组织的分离、T细胞的活化、玻璃成像培养皿的包被以及数据分析。对于缺乏经验的操作者而言，嵌在组织中的淋巴结 ...

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披露

作者声明，所有研究和稿件撰写均在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

感谢金实验室的历任和现任成员，他们为这些实验方案的逐步完善做出了贡献。代表性数据的获得得益于美国国立卫生研究院国家过敏与传染病研究所（NIAID NIH HHS）资助项目 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/美国，以及美国国立心肺血液研究所（NHLBI NIH HHS）资助项目 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/美国。本出版物的部分成果得益于机构露丝·L·卡什斯坦国家研究服务奖（Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）资助编号 T32 GM135134 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 cm 培养皿康宁353003或同等产品
15 mL 一次性离心管赛默飞世尔科技339650或同等产品
1× DPBSGibco14190144不含钙和镁
6 孔板，非 TC 处理Corning3736或同等产品
70 µm细胞滤筛FisherScientific352350或同等产品
ACK裂解缓冲液ThermoFisherA1049201或同等产品
Allegra 6KR 离心机赛默飞世尔科技Sorvall 16R 配备 TX400 3655 转子及吊篮或同等产品
β-巯基乙醇SigmaM3148或同等产品
CellTrace VioletThermoFisherC34571或同等产品
离心赛默飞世尔科技Sorvall ST 16R或同等产品
IV型胶原蛋白Corning354233或同等产品
DeltaT 培养皿，0.17 mm 厚玻璃，透明Bioptechs04200417C
Dynabeads 羊抗大鼠 IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 磁力架赛默飞世尔科技12301D或同等产品
EasySep小鼠T细胞分离试剂盒干细胞19851
FBSSigmaAldrichF2442-500ML或同等产品
纤连蛋白SigmaAldrich10838039001或同等产品
Fijihttp://fiji.sc/网络链接
滤光片组尼康或奥林巴斯
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080或同等产品
HQ CCD相机CoolSNAP或同等产品
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/h网络链接
ImageJ 自动追踪插件http://imagej.net/TrackMate网络链接
ImageJ 手动追踪插件https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html网络链接
L-15各种参见材料部分培养基配方：Leibovitz’不含酚红的 L-15 培养基（Gibco），添加 1–5 g/L 葡萄糖
L-15培养基（Leibovitz），无酚红赛默飞世尔科技21083027
鲁尔锁一次性注射器Fisher Scientific14-955-459或同等产品
淋巴细胞分离液康宁25-072-CI或同等产品
M5/114ATCCTIB-120
MEM非必需氨基酸赛默飞世尔科技11140050或同等产品
显微镜加热系统Okolabokolab.com可提供定制设计
Millicell EZ 载玻片MilliporeC86024
Mojosort 小鼠 CD8+ Naïve T细胞分离试剂盒Biolegend480043
小鼠 E-钙黏蛋白R&D 系统8875-EC-050或同等产品
小鼠外科解剖工具包Fisher Scientific13-820-096或同等产品
NIS 元件尼康软件
非TC 24孔板康宁353047或同等产品
青霉素-链霉素ThermoFisher15140122或同等产品
蛋白A赛默飞世尔科技或同等产品
R9各种参见材料部分培养基配方：RPMI 1640 培养基，添加 10% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂（Gibco）、20 mM HEPES 缓冲液（Gibco）、1% MEM 非必需氨基酸（Gibco）、50 μM β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）
重组小鼠 ICAM-1 Fc 融合蛋白R&研发系统796-IC-050或同等产品
重组小鼠 IL2Biolegend575410或同等产品
RPMI 1640xThermoFisher11875093或同等产品
T形针Fisher ScientificS99385或同等产品
TE2000-U 显微镜尼康或同等产品
多种重组小鼠趋化因子R&D 系统或同等产品
VCAM-1 Fc 融合蛋白R&安培和D系统643-VM-050或同等产品
VolocityPerkinElmer软件

参考文献

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