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基于CRISPR的模块化组装法用于高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库

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DOI：

10.3791/66581

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2024年5月17日

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1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）方案，该方法利用公开可获得的cDNA/ORF资源，在黑腹果蝇（Drosophila）中高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库。CRISPRmass可应用于多种质粒文库的编辑。

摘要

功能基因组学筛选为研究基因功能提供了一种强有力的手段，其依赖于全基因组范围质粒文库的构建。传统的质粒文库构建方法耗时且操作繁琐。因此，我们近期开发了一种简单高效的高通量构建全基因组上游激活序列-互补DNA/开放阅读框（UAS-cDNA/ORF）质粒文库的方法，即基于CRISPR的模块化组装技术（CRISPRmass）。本文以构建基于GAL4/UAS系统的UAS-cDNA/ORF质粒文库为例，详细描述了CRISPRmass的操作流程。该流程包括大规模并行的两步试管反应，随后进行细菌转化。第一步是利用CRISPR/Cas9系统与单导向RNA（sgRNA）共同作用，切割位于cDNA或ORF 5'端附近共有的上游载体序列，从而线性化现有的cDNA或ORF文库质粒；第二步是通过单步反应将UAS模块插入已线性化的cDNA或ORF质粒中。CRISPRmass实现了多种质粒文库的简便、快速、高效且低成本构建。所获得的UAS-cDNA/ORF质粒文库可用于培养细胞中的功能获得性筛选，也可用于在Drosophila中构建全基因组范围的转基因UAS-cDNA/ORF文库。 

引言

全基因组无偏倚遗传筛选是鉴定参与特定生物学过程并阐明其机制的相关基因的有力方法，因此在生物学研究的各个领域被广泛应用。大约60%的Drosophila基因在人类中是保守的1,2，约75%的人类疾病基因在Drosophila中具有同源基因3。遗传筛选主要分为两类：功能缺失（LOF）和功能获得（GOF）。在Drosophila中进行的LOF遗传筛选在阐明几乎各个生物学领域调控机制方面发挥了关键作用。然而，大多数Drosophila基因并不表现出明显的LOF表型4，因此GOF筛选是研究这些基因功能的重要方法4,5。

GAL4/UAS 双元系统常用于组织特异性基因表达研究 果蝇6在此系统中，组织特异性表达酵母转录激活因子GAL4，该因子可结合GAL4响应元件（UAS），从而激活下游遗传组分（如cDNA和ORF）的转录6进行全基因组范围的获得性功能筛选 果蝇，我们需要构建一个全基因组范围的UAS-cDNA/ORF质粒文库，随后构建一个转基因UAS-cDNA/ORF文库 果蝇.

通过常规方法从公开可用的cDNA/ORF克隆构建全基因组范围的UAS-cDNA/ORF质粒文库耗时且费力，因为每个基因都需要单独设计，包括引物设计与合成、聚合酶链式反应（PCR）、凝胶纯化、测序、限制性酶切等步骤7,8。因此，此类质粒文库的构建成为在黑腹果蝇（Drosophila）中创建全基因组转座子UAS-cDNA/ORF文库的限速步骤。最近，我们通过开发一种新方法——基于CRISPR的模块化组装技术（CRISPRmass）9，成功解决了这一问题。CRISPRmass的核心是通过基因编辑技术与无缝克隆技术相结合，对质粒文库中共有的载体序列进行操控。

本文介绍了一种名为CRISPRmass的实验方案，该方案包括大规模并行的两步试管反应，随后进行细菌转化。CRISPRmass是一种简单、快速、高效且成本低廉的方法，原则上可用于高通量构建各类质粒文库。

CRISPRmass 策略
CRISPRmass 的操作流程始于在 Escherichia coli（E. coli）转化之前进行的平行两步试管反应（图1）。第一步是利用 Cas9/sgRNA 切割 cDNA/ORF 质粒中相同的载体骨架。理想的切割位点位于 cDNA/ORF 的 5′ 端附近。切割产物无需纯化。第二步是通过 Gibson 组装将载体特异性的 UAS 模块插入经 Cas9/sgRNA 线性化的 cDNA/ORF 质粒中（下文简称单步反应），从而生成 UAS-cDNA/ORF 质粒。UAS 模块的 5′ 和 3′ 末端序列与线性化 cDNA/ORF 质粒的末端序列重叠，从而实现单步反应。

单步反应产物可直接用于大肠杆菌（E. coli）转化。理论上，只有含有目标UAS-cDNA/ORF的菌落能够在添加了对应于UAS模块抗生素抗性基因的选择性抗生素的Luria-Bertani（LB）平板上生长。UAS模块由核心UAS模块、一个不同于cDNA或ORF质粒所用的抗生素抗性基因，以及5′和3′端序列组成。核心UAS模块包含10个UAS拷贝、Hsp70最小启动子、用于phiC31介导基因组整合的attB序列，以及用于果蝇（Drosophila）的mini-white转化标记7。

方案

1. 确定cDNA/ORF上游的最佳Cas9/sgRNA切割位点

  1. 使用相同载体骨架制备cDNA或ORF质粒
    1. 从公共资源（例如）购买可获取的 cDNA/ORF 克隆 果蝇 基因组资源中心（DGRC，https://dgrc.bio.indiana.edu/）Gold 收藏10,11小鼠哺乳动物基因文库（MGC，https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/）以及人类CCSB-Broad慢病毒表达文库12在本方案中，我们以 DGRC 金集（Gold Collection）中提供的基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆为例。
    2. 使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA。使用分光光度计测定质粒的浓度。
  2. sgRNA的设计
    1. 访问 CHOPCHOP 网站（https://chopchop.cbu.uib.no/），点击按钮 粘贴目标 然后输入目标DNA序列。目标序列是位于cDNA/ORF 5'端上游的pOT2载体骨架中的20-100 bp区域。
    2. 选择物种 黑腹果蝇. 单击按钮 寻找靶位点选择预测效率高于80%的sgRNA候选序列。
  3. sgRNA的制备
    1. 订购经PAGE纯化的寡核苷酸，一条正向引物（5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′）其中（N）20 是sgRNA的靶向序列，以及sgRNA骨架的反向引物sgRNA-REV（5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′）。
      注意：建议使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的高质量寡核苷酸。
    2. 通过PCR制备DNA模板 体外 体外转录（IVT）sgRNA。按如下体系配制100 µL PCR反应：在PCR管中加入5 µL pX330模板（Addgene质粒42230，Feng Zhang惠赠；0.1 ng/µL）、5 µL正向引物（10 µM）、5 µL sgRNA-REV（10 µM）、50 µL 2x高保真PCR预混液和35 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水。
    3. 使用以下热循环条件进行PCR：98 °C预变性30 s，1个循环；98 °C变性10 s、51 °C退火10 s、72 °C延伸5 s，5个循环；98 °C变性10 s、72 °C延伸15 s，30个循环；72 °C终延伸2 min，1个循环。将反应体系置于PCR仪中孵育。
    4. 使用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。在紫外光下应可见凝胶上有一条约120 bp的DNA条带。使用凝胶回收试剂盒纯化该约120 bp的DNA片段。纯化后的DNA片段作为体外转录sgRNA的模板。
    5. 设置一个5 µL的体外转录（IVT）反应体系，体系组成如下：165 ng约120 bp的纯化凝胶DNA片段，1.65 µL NTP缓冲液混合物，0.33 µL T7 RNA聚合酶混合物，以及DEPC处理水。将反应体系在37 °C孵育4小时。随后按照某一试剂盒的说明书操作 体外 转录试剂盒
    6. 向体外转录（IVT）反应产物中加入45 µL经DEPC处理的水。将IVT反应产物视为RNA，并以DEPC处理的水作为空白对照。使用分光光度计测定sgRNA的浓度。稀释后sgRNA的浓度约为870 ng/µL。
    7. 用经DEPC处理的水将体外转录（IVT）反应产物稀释至20 ng/µL。分装后直接于-80 °C保存sgRNA。
      注意：体外转录（IVT）反应后，无需通过DNase消化去除DNA模板即可精确测定sgRNA浓度，因为DNA模板的量不足sgRNA的0.4% DNA 模板不会影响后续的 CRISPRmass 反应，因此无需进行 sgRNA 纯化。
  4. sgRNA的评估
    1. 用限制性内切酶消化含有pOT2载体骨架的cDNA/ORF质粒。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离所得DNA片段。使用凝胶回收试剂盒纯化DNA底物。
      注意：pOT2 载体骨架中包含 sgRNA 靶向序列的 DNA 片段可作为 Cas9/sgRNA 的 DNA 底物。Cas9/sgRNA 在该 DNA 底物上的切割位点呈不对称分布，因此 Cas9/sgRNA 对 DNA 底物的切割会产生两条大小不同的 DNA 片段，从而在消化反应中更容易与未切割的 DNA 底物区分开来。
    2. 配置5 µL Cas9切割反应体系，如下所示：0.2 µL的1.22 µM S. pyogenes Cas9，0.5 µL 20 ng/µL sgRNA，0.015 pmol DNA底物，0.5 µL 10x Cas9缓冲液，以及DEPC处理水。37 °C孵育反应1小时。
    3. 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。将未切割的DNA底物作为阴性对照与已消化的DNA底物一同上样。
      注意：此处的完整DNA底物是指未经过Cas9/sgRNA消化反应的DNA底物。Cas9/sgRNA对DNA底物的切割会产生两条大小不同的DNA片段，从而使其在消化反应中更容易与未切割的DNA底物区分开来。
    4. 通过数字成像系统分析切割模式（图2). 为后续的CRISPRmass实验选择最高效的sgRNA。 图2 结果显示，所有四种sgRNA均表现出高切割效率，可用于CRISPRmass。选择带下划线的sgRNA用于后续实验。
      注意：未切割的DNA底物越少，sgRNA在Cas9/sgRNA介导的DNA底物消化中效率越高。

2. UAS 模块的构建

注意：UAS 模块包含一个核心 UAS 以及约 20-40 bp 的 5′ 和 3′ 末端序列，这些末端序列分别与骨架切割位点的 5′ 和 3′ 末端重叠（图 1）。UAS 模块的 5′ 和 3′ 末端序列由 pOT2 载体的骨架切割位点决定。

  1. 将 pOT2 载体特异性的 UAS 模块克隆至 pCR8GW 载体的 EcoRI 位点，获得 pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 质粒（补充文件 1）。用 EcoRI 在 37 °C 下消化 pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 质粒 1 小时，释放 pOT2 载体特异性的 UAS 模块。
  2. 通过 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。使用凝胶回收试剂盒纯化 6178-bp 的 UAS 模块。将 UAS 模块稀释至 23 ng/µL，用于后续实验。该 6178-bp 片段可作为 UAS 模块，用于从基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆构建 UAS-cDNA/ORF 质粒。

3. 通过 CRISPRmass 大规模构建 UAS-cDNA/ORF 质粒

注意：CRISPRmass 已标准化为在 E. coli 转化之前进行大规模平行的两步试管反应（图 1）。

  1. 试管反应步骤 1
    1. 利用 Cas9/sgRNA 切割 cDNA/ORF 质粒中相同的载体骨架。将 0.2 mL 离心管置于冰上的铝制冷却块中，并仔细标记各管。按如下方法配制预混液。
      1. 单个反应体系中加入 0.16 µL 的 1.22 µM S. pyogenes Cas9、0.4 µL 的 20 ng/µL sgRNA、0.24 µL 的 10x Cas9 缓冲液、1.2 µL 的 DEPC 处理水。对于 N 个反应，加入 (N+1) × 0.16 µL 的 1.22 µM S. pyogenes Cas9、(N+1) × 0.4 µL 的 20 ng/µL sgRNA、(N+1) × 0.24 µL 的 10x Cas9 缓冲液、(N+1) × 1.2 µL 的 DEPC 处理水。
    2. 涡旋振荡，充分混匀后离心。将 2 µL 预混液分装至各管中。每管加入 0.4 µL 浓度为 0.019 µM 的 cDNA/ORF 质粒。在 37 °C 下孵育 1 小时以完成切割反应。
      注：使用 DEPC 处理水将每个质粒稀释至 0.019 µM。若某质粒浓度低于 0.019 µM，可直接将质粒 DNA 加入切割反应体系中。请使用无 RNase 的离心管和 DEPC 处理水。大规模操作这些步骤将耗时数小时。除非另有说明，所有试剂和反应均需保持在冰上。
  2. 试管反应步骤 2
    1. 通过单步反应组装，将步骤 2 中获得的载体特异性 UAS 模块插入 Cas9 线性化的 cDNA/ORF 质粒中。为每个样品设置一个 1.4 µL 的单步反应体系。将 0.2 mL 离心管置于冰上的铝制冷却块中，并仔细标记各管。
      1. 按如下方法配制预混液。单个反应中加入 0.07 µL 的 0.006 µM UAS 模块和 0.7 µL 的单步反应组装预混液。对于 N 个反应，加入 (N+1) × 0.07 µL 的 0.006 µM UAS 模块和 (N+1) × 0.7 µL 的单步反应组装预混液。
    2. 涡旋振荡，充分混匀后离心。将 0.77 µL 预混液分装至各管中。每管加入 0.7 µL Cas9 线性化的 cDNA/ORF 质粒。在 50 °C 下孵育 1 小时。
      注：单步组装反应产物无需纯化。大规模操作这些步骤将耗时数小时。除非另有说明，所有试剂和反应均需保持在冰上。
  3. 将单步组装反应产物大规模转化至 E. coli 中。
    1. 将 10 µL 吸头在 4 °C 预冷。将 1.5 mL 离心管置于冰上的铝制冷却块中预冷。
    2. 将感受态 E. coli 细胞在冰上解冻 5 分钟。将 10 µL 感受态细胞分装至每个预冷的 1.5 mL 离心管中。
      注：使用商业化提供的感受态 E. coli 细胞，其转化效率应至少达到 1 × 108 CFU/µg pUC19 DNA。
    3. 向 10 µL 感受态细胞中加入 1 µL 单步组装反应产物，轻轻混匀后置于冰上 30 分钟。
    4. 将离心管置于 42 °C 水浴中孵育 1 分钟，随后立即放回冰上冷却 2 分钟。
    5. 在室温下向每管加入 100 µL 预热至 37 °C 的 SOC 培养基，并在 37 °C 摇床（250 rpm）中孵育 1 小时。
    6. 将含有与 UAS 模块抗性基因相对应抗生素的 LB 平板预热至 37 °C。将细胞涂布于平板上，并在 37 °C 过夜培养。
      注：大规模操作这些步骤将耗时数小时。除非另有说明，所有试剂和反应均需保持在冰上。
  4. 验证通过 CRISPRmass 构建的 UAS-cDNA/ORF 质粒
    1. 挑取单克隆，接种于 4.5 mL 含相应抗生素（与 UAS 模块抗性基因匹配）的 LB 液体培养基中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下过夜培养。
    2. 使用质粒小提试剂盒提取质粒 DNA。设置 20 µL 限制性酶切反应体系：加入 300–500 ng/µL 质粒、适当的限制性内切酶、限制性酶切缓冲液和超纯水。在 37 °C 下孵育 1 小时。
    3. 通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，并使用数字成像系统进行分析（图 3）。

结果

我们应用 CRISPRmass 技术，利用 DGRC Gold Collection 中携带 pOT2 载体骨架的 3402 个 cDNA/ORF 克隆，构建了全基因组范围的 UAS-cDNA/ORF 质粒文库。对于每个 UAS-cDNA/ORF 构建体，我们仅随机分析了一个单菌落，随后使用 PstI 进行限制性酶切分析，结果显示 98.6% 的 UAS-cDNA/ORF 构建体成功构建9。采用 PstI 对携带 pOT2 载体骨架的 UAS-cDNA/ORF 构建体进行限制性酶切分析的原理如下：在 UAS 模块中，基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆含有两个 PstI 酶切位点，而 pOT2 载体骨架本身含有一个 PstI 酶切位点。因此，用 PstI 消化基于 pOT2 载体的 UAS-cDNA/ORF 构建体时，会产生一条 408 bp 的 UAS 模块特异性片段和一条 5649 bp 的 UAS 模块-载体连接结构特异性片段。出现 408 bp 和 5649 bp 的 PstI 酶切片段表明，基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆的 UAS-cDNA/ORF 构建体已成功构建，代表性结果如图 3所示。

CRISPR 质粒组装示意图；sgRNA 靶向、切割、Gibson 组装、大肠杆菌转化。
图 1：利用 CRISPRmass 构建 UAS-cDNA/ORF 文库的流程图。CRISPRmass 构建 UAS-cDNA/ORF 文库的技术流程。（1）第一步为试管内反应。cDNA/ORF 质粒的相同载体骨架通过 Cas9/sgRNA 进行切割。切割位点位于 cDNA/ORF 5′ 端上游邻近的载体骨架区域。切割产物无需纯化，可直接用于第二步试管内反应。切割反应中所用的 sgRNA 通过 in vitro 转录制备，无需纯化即可直接使用。随后，将切割位点 5′ 端的 28–40 bp（黄色框）定义为 5′ 端重叠区，切割位点 3′ 端的 28–40 bp（红色框）定义为 3′ 端重叠区。载体骨架携带抗生素 A 抗性基因（绿色框）。（2）第二步为试管内反应。一种载体特异性的 UAS 模块通过单步反应组装方式，连接至 Cas9 线性化的 cDNA/ORF 质粒中 cDNA/ORF 5′ 端的正上游位置，从而形成 UAS-cDNA/ORF 构建体。单步反应组装产物可直接用于 E. coli 转化。转化子在含有抗生素 B 的 LB 琼脂平板上进行筛选，该抗生素对应于载体特异性 UAS 模块中的抗生素 B 抗性基因（棕色框）。仅目标 UAS-cDNA/ORF 菌落能够生长。UAS 模块包含 10 个 UAS 拷贝、Hsp70 最小启动子、用于 phiC31 介导基因组整合的 attB 序列、用于 Drosophila 转基因的 mini-white 转化标记、用于阳性筛选的抗生素 B 抗性基因，以及实现单步反应组装的 5′ 端和 3′ 端重叠区。单步反应组装可有效排除 CRISPR/Cas9 可能引起的任何非靶向 DNA 切割产物。本图改编自9。请点击此处查看此图的放大版本。

DNA电泳结果；pOT2-CG4968/HindIII 酶切；碱基对梯状标记；条带分离分析。
图2：通过靶向pOT2载体骨架特定区域的sgRNA评估 体外 Cas9 切割分析 下划线标注的sgRNA被选用于CRISPRmass。M为DNA标记物。该图已修改自9. 请点击此处以查看此图的放大版本。

DNA电泳结果；条带分离，碱基对标记物；基因鉴定的凝胶分析。
图3：CRISPRmass生成的20个UAS-cDNA/ORF构建体的限制性酶切分析。 对构建体进行了PstI消化分析。所有UAS-cDNA/ORF构建体均显示出预期的限制性酶切图谱。M为DNA标记物。该图改编自9。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件1：pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70质粒的构建。 包含pOT2载体特异性UAS模块的质粒pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70是基于三个质粒pMartini-Amp、pBS-attB-UAS-Hsp70和pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70构建而成。请点击此处下载该文件。

讨论

CRISPRmass 中最关键的步骤是 sgRNA 的设计与评估。为 Cas9 选择高效 sgRNA 是 CRISPRmass 成功的关键。在将单步反应组装产物转化至大肠杆菌后，若大多数含抗生素的 LB 平板上观察到极少或无菌落生长，应通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的酶切情况。若质粒未充分酶切，需检查 Cas9 活性、sgRNA 是否降解以及质粒质量；若质粒已充分酶切，则需检查单步反应组装试剂，并确保感受态细胞的转化效率至少达到 1 × 108 cfu/µg pUC19 DNA。值得注意的是，使用铝制冷却块有助于大规模细菌转化操作。

CRISPRmass 的局限性源于其对载体骨架序列的操作和引入，这限制了在 cDNA 和 ORF 的 5' 或 3' 末端进行标记的可能性。

与其他所有现有方法不同7,8CRISPRmass 操控并整合载体骨架序列9因此，一旦设计并制备好UAS模块，CRISPRmass便无需针对每个质粒进行个性化设计或操作，而只需在细菌转化前进行大规模平行的两步试管反应，从而省去了PCR及其相关操作。此外，这两个 体外 转录的sgRNA和单步反应组装产物在后续实验中无需纯化。与Gateway克隆技术相比，CRISPRmass更适用于构建UAS-cDNA/ORF载体，特别是来源于较长或GC含量较高的cDNA/ORF，因为CRISPRmass不会对cDNA或ORF本身进行PCR扩增9.

CRISPRmass可用于高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库，以及编辑多种全基因组范围的质粒文库。通过将CMV启动子插入cDNA或ORF 5'端附近的共有载体序列中，CRISPRmass可应用于表达质粒文库的构建。CRISPRmass有望加速功能基因组学的发展。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（32071135 和 31471010）、上海市浦江人才计划（14PJ1405900）以及上海市自然科学基金（19ZR1446400）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝制冷却块AikbbioADMK-0296用于细菌转化
DEPC处理水InvitrogenAM9906
凝胶回收试剂盒OmegaD2500从琼脂糖凝胶中纯化DNA
凝胶成像系统Tanon2500B
HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒NEBE2050
NEBuilder HiFi DNA组装预混液NEBE2621
质粒小提试剂盒OmegaD6943从细菌细胞中分离质粒DNA
Q5热启动高保真2x预混液NEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
摇床培养箱Shanghai Zhichu ZQLY-180V
T系列多模块梯度PCR仪LongGeneT20用于PCR扩增 
Trans10化学感受态细胞TranGen BioTechCD101
紫外分光光度计ShimadzuBioSpec-nano用于测定DNA或RNA的浓度

参考文献

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