基于CRISPR的模块化组装用于UAS-cDNA/ORF质粒文库的高通量构建

Summary

我们提出了一种基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）方案，这是一种使用公开可用的cDNA/ORF资源在 果蝇 中高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒库的方法。CRISPRmass可用于编辑各种质粒文库。

Abstract

功能基因组学筛选为探测基因功能提供了一种强大的方法，并依赖于全基因组质粒库的构建。传统的质粒文库构建方法既费时又费力。因此，我们最近开发了一种简单高效的方法，即基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass），用于高通量构建全基因组上游激活序列互补DNA/开放阅读框（UAS-cDNA/ORF）质粒库。在这里，我们提出了一种CRISPRmass的方案，以构建基于GAL4 / UAS的UAS-cDNA / ORF质粒库为例。该方案包括大规模平行的两步试管反应，然后是细菌转化。第一步是使用 CRISPR/Cas9 和单向导 RNA （sgRNA） 切割与 cDNA 或 ORF 的 5' 端相邻的共享上游载体序列，对现有的互补 DNA （cDNA） 或开放阅读框 （ORF） cDNA 或 ORF 文库质粒进行线性化，第二步是使用一步反应将 UAS 模块插入线性化的 cDNA 或 ORF 质粒中。CRISPRmass可以简单、快速、高效且经济高效地构建各种质粒文库。UAS-cDNA/ORF 质粒文库可用于培养细胞中的功能获得性筛选，以及在 果蝇中构建全基因组转基因 UAS-cDNA/ORF 文库。

Introduction

无偏倚的全基因组基因筛选是识别参与特定生物过程的基因并阐明其机制的有力方法。因此，它在生物学研究的各个领域都有广泛的应用。大约 60% 的果蝇基因在人类 ^1,2 中是保守的，而 ~75% 的人类疾病基因在果蝇³ 中具有同源物。基因筛查主要分为功能丧失（LOF）和功能获得（GOF）两种类型。果蝇中的LOF遗传筛选在阐明控制生物学几乎每个方面的机制方面发挥了关键作用。然而，大多数果蝇基因没有明显的LOF表型⁴，因此，GOF筛选是研究这些基因功能的重要方法^4,5。

二元 GAL4/UAS 系统通常用于 果蝇⁶ 中的组织特异性基因表达。在该系统中，组织特异性表达酵母转录激活因子 GAL4，该激活因子与 GAL4 反应元件 （UAS） 结合，从而激活下游遗传成分（例如 cDNA 和 ORF）⁶ 的转录。为了在 果蝇中进行全基因组GOF筛选，我们需要构建全基因组UAS-cDNA/ORF质粒文库，然后构建果 蝇转基因UAS-cDNA/ORF文库。

通过常规方法从公开的cDNA/ORF克隆中构建全基因组UAS-cDNA/ORF质粒库既费时又费力，因为每个基因都需要个体化设计，包括引物设计和合成、聚合酶链反应（PCR）和凝胶纯化、测序、限制性酶切等^7,8.因此，构建这样的质粒文库是在果蝇中创建全基因组转基因UAS-cDNA/ORF文库的限速步骤。最近，我们通过开发一种新方法，即基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）⁹，成功地解决了这个问题。CRISPRmass的核心是通过基因编辑技术和无缝克隆技术的结合，操纵质粒库的共享载体序列。

在这里，我们提出了CRISPRmass的协议，其中包括大规模并行的两步试管反应，然后是细菌转化。CRISPRmass是一种简单、快速、高效且具有成本效益的方法，原则上可用于各种质粒文库的高通量构建。

CRISPRmass策略
CRISPRmass的程序从 大肠杆菌 （大肠杆菌）转化之前的平行两步试管反应开始（图1）。第 1 步是通过 Cas9/sgRNA 切割 cDNA/ORF 质粒的相同载体骨架。理想的切割位点位于 cDNA/ORF 的 5′ 末端附近。裂解产物无需纯化。第 2 步是通过 Gibson 组装将载体特异性 UAS 模块插入到 Cas9/sgRNA 线性化的 cDNA/ORF 质粒中（以下简称单步反应），得到 UAS-cDNA/ORF 质粒。UAS 模块的 5′ 和 3′ 末端序列与线性化 cDNA/ORF 质粒的序列重叠，可实现一步反应。

一步反应产物直接进行 大肠杆菌 转化。从理论上讲，只有所需的 UAS-cDNA/ORF 菌落才能在含有对应于 UAS 模块抗生素耐药基因的选择性抗生素的 Luria-Bertani （LB） 平板上生长。UAS 模块由核心 UAS 模块、不同于 cDNA 或 ORF 质粒的抗生素抗性基因以及 5′ 和 3′ 末端序列组成。核心 UAS 模块包括 10 个 UAS 拷贝、一个 Hsp70 最小启动子、一个用于 phiC31 介导的基因组整合的 attB 序列和一个用于 果蝇⁷ 的迷你白色转化标记。

Protocol

1. cDNA/ORF上游最佳Cas9/sgRNA切割位点的测定

1. 具有相同载体骨架的cDNA或ORF质粒的制备
   1. 购买公共资源中可用的cDNA/ORF克隆，例如果蝇基因组资源中心（DGRC，https://dgrc.bio.indiana.edu/）Gold Collection^10,11，小鼠哺乳动物基因集合（MGC，https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/）和人类CCSB广小病毒表达文库¹²。在该协议中，我们以基于pOT2载体的cDNA / ORF克隆为例，该克隆在DGRC Gold Collection中可用。
   2. 使用质粒小量制备试剂盒提取质粒 DNA。用分光光度计测量质粒的浓度。
2. sgRNA的设计
   1. 访问 CHOPCHOP 网站 （https://chopchop.cbu.uib.no/）。单击"粘贴目标" 按钮，然后输入感兴趣的 DNA 序列。目标序列是位于 cDNA/ORF 5' 末端上游的 pOT2 载体骨架中的 20-100 bp 区域。
   2. 选择物种 果蝇 melanogaster。单击按钮 查找目标站点。选择预测效率高于 80% 的 sgRNA 候选物。
3. sgRNA的制备
   1. 订购 PAGE 纯化的寡核苷酸，正向引物 （5′ -TAATACGACTCACTATAGG（N）₂₀GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′），其中（N）₂₀ 是sgRNA的靶序列，sgRNA支架反向引物sgRNA-REV（5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′）。
      注:推荐使用PAGE纯化的高质量寡核苷酸。
   2. 通过PCR制备DNA模板，用于sgRNA的 体外 转录（IVT）。设置100μL PCR反应如下:5μL模板pX330（Addgene质粒42230，Feng Zhang的礼物;0.1ng / μL），5μL正向引物（10μM），5μLsgRNA-REV（10μM），50μL2x高保真PCR预混液和35μL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水在PCR管中。
   3. 使用以下热循环条件进行PCR:98°C的1个循环30秒;5 个循环，98 °C 10 秒，51 °C 10 秒，72 °C 5 秒;30 个循环，98 °C 10 秒，72 °C 15 秒;72°C的1个循环2分钟。在热循环仪中孵育反应。
   4. 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。在紫外线下，凝胶上应可见 ~120 bp 的 DNA 片段。使用凝胶提取试剂盒纯化 ~120 bp DNA 片段。纯化的DNA片段用作sgRNA的IVT模板。
   5. 设置 5 μL IVT 反应，如下所示:165 ng ~120-bp 纯化的凝胶 DNA 片段、1.65 μL NTP 缓冲液混合物、0.33 μL T7 RNA 聚合酶混合物和 DEPC 处理过的水。将反应在37°C孵育4小时。按照 体外 转录试剂盒的手动说明进行操作。
   6. 向 IVT 反应产物中加入 45 μL DEPC 处理过的水。将IVT反应产物作为RNA，并使用DEPC处理过的水作为空白对照。用分光光度计测量sgRNA的浓度。稀释的 sgRNA 浓度约为 870 ng/μL。
   7. 用DEPC处理过的水将IVT反应产物稀释至20ng / μL。将sgRNA直接分装并储存在-80°C。
      注:在IVT反应之后，由于DNA模板的量小于sgRNA的0.4%，并且DNA模板不影响随后的CRISPRmass反应，因此无需通过DNase消化去除DNA模板以测量sgRNA的精确浓度。因此，不需要sgRNA纯化。
4. sgRNA的评估
   1. 用限制性内切酶消化带有 pOT2 载体骨架的 cDNA/ORF 质粒。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离所得DNA片段。用凝胶提取试剂盒纯化DNA底物。
      注:含有 pOT2 载体骨架的 sgRNA 靶向序列的所得 DNA 片段用作 Cas9/sgRNA 的 DNA 底物。Cas9/sgRNAs的切割位点在DNA底物中不对称分布，因此，Cas9/sgRNAs对DNA底物的切割产生两个不同大小的DNA片段，这使得它们在消化反应中更容易与未切割的DNA底物区分开来。
   2. 设置5μL Cas9裂解反应，如下:0.2μL1.22μM 化脓性链球菌 Cas9,0.5μL20ng / μL sgRNA，0.015pmolDNA底物，0.5μL10x Cas9缓冲液和DEPC处理的水。将反应在37°C孵育1小时。
   3. 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离裂解产物。将完整的 DNA 底物加载作为消化 DNA 底物的阴性对照。
      注:此处，完整DNA底物是指未被Cas9 / sgRNAs消化反应的DNA底物。Cas9/sgRNAs切割DNA底物产生两个不同大小的DNA片段，这使得它们在消化反应中更容易与未裂解的DNA底物区分开来。
   4. 通过数字成像系统分析裂解模式（图2）。为后续的 CRISPRmass 实验选择最有效的 sgRNA。 图 2 显示，所有四种 sgRNA 都表现出高切割效率，可用于 CRISPRmass。选择带下划线的 sgRNA 进行后续实验。
      注:未解脱的 DNA 底物越少，sgRNA 对 DNA 底物的 Cas9/sgRNA 消化效率就越高。

2. UAS模块的构造

注意:UAS模块包括一个核心UAS和大约20-40 bp的5'和3'末端序列，分别与骨架切割位点的5'和3'末端重叠（图1）。UAS模块的5′和3′末端序列由pOT2载体的骨架切割位点确定。

1. 将 pOT2 载体特异性 UAS 模块克隆到 pCR8GW 载体的 EcoRI 位点，得到 pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 质粒（补充文件 1）。通过在37°C下用EcoRI消化pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70质粒1小时来释放pOT2载体特异性UAS模块。
2. 通过0.7%琼脂糖凝胶电泳分离裂解产物。使用凝胶提取试剂盒纯化 6178-bp UAS 模块。将 UAS 模块稀释至 23 ng/μL 用于后续实验。该 6178-bp 片段用作 UAS 模块，用于从 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆构建 UAS-cDNA/ORF 质粒。

3. CRISPRmass大规模构建UAS-cDNA/ORF质粒

注:CRISPRmass被标准化为 大肠杆菌 转化之前的大规模平行两步试管反应（图1）。

1. 试管反应步骤1
   1. 通过Cas9/sgRNA切割cDNA/ORF质粒的相同载体骨架。将 0.2 mL 试管放在冰上的铝冷却块中，并小心地标记试管。按如下方式制备预混液。
      1. 对于单个反应，加入 0.16 μL 1.22 μM 化脓性链球菌 Cas9、0.4 μL 20 ng/μL sgRNA、0.24 μL 10x Cas9 缓冲液、1.2 μL DEPC 处理过的水。对于 N 反应，加入 （N+1） x 0.16 μL 1.22 μM 化脓性链球菌 Cas9、（N+1） x 0.4 μL 20 ng/μL sgRNA、（N+1） x 0.24 μL 10x Cas9 缓冲液、（N+1） x 1.2 μL DEPC 处理过的水。
   2. 涡旋，混合均匀，然后旋转。将 2 μL 预混液分装到每个试管中。向每个试管中加入 0.4 μL 0.019 μM 的 cDNA/ORF 质粒。将裂解反应在37°C孵育1小时。
      注:用DEPC处理过的水将每个质粒稀释至0.019μM。如果质粒的浓度低于0.019μM，则将质粒DNA直接添加到裂解反应中。使用无 RNase 的试管和 DEPC 处理过的水。大规模执行这些步骤将需要几个小时。除非另有说明，否则将试剂和反应物放在冰上。
2. 试管反应步骤2
   1. 通过一步反应组装将步骤 2 中的载体特异性 UAS 模块插入 Cas9 线性化的 cDNA/ORF 质粒中。为每个样品设置 1.4 μL 单步反应。将 0.2 mL 试管放在冰上的铝冷却块中，并小心地标记试管。
      1. 按如下方式制备预混液。对于单个反应，加入 0.07 μL 0.006 μM UAS 模块和 0.7 μL 单步反应组装预混液。对于 N 反应，加入 （N+1） x 0.07 μL 0.006 μM UAS 模块和 （N+1） x 0.7 μL 单步反应组装预混液。
   2. 涡旋，混合均匀，然后旋转。将 0.77 μL 预混液分装到每个试管中。向每个试管中加入 0.7 μL Cas9 线性化的 cDNA/ORF 质粒。将反应在50°C孵育1小时。
      注:不需要纯化单步组装反应产物。大规模执行这些步骤需要几个小时。除非另有说明，否则将试剂和反应物放在冰上。
3. 将一步组装反应产物大规模转化为 大肠杆菌 。
   1. 在 4 °C 下预冷 10 μL 吸头。 在冰上的铝冷却块中预冷 1.5 mL 试管。
   2. 在冰上解冻感受态 大肠杆菌 细胞 5 分钟。将 10 μL 感受态细胞分装到每个预冷的 1.5 mL 管中。
      注:使用市售的感受态 大肠杆 菌细胞，转化效率至少为 1 x 10⁸ CFU/μg pUC19 DNA。
   3. 将 1 μL 单步组装反应产物加入 10 μL 感受态细胞中，轻轻旋转混合，然后置于冰上 30 分钟。
   4. 将试管在42°C水浴中孵育1分钟，然后立即在冰上冷却2分钟。
   5. 在室温下向每个试管中加入100μL SOC培养基（预热至37°C），并在37°C的振荡培养箱（250rpm）中孵育1小时。
   6. 将含有对应于UAS模块的抗生素耐药基因的抗生素的LB板加热至37°C。将细胞铺展到平板上，并在37°C下孵育过夜。
      注意:大规模执行这些步骤需要几个小时。除非另有说明，否则将试剂和反应物放在冰上。
4. 验证由CRISPRmass构建的UAS-cDNA/ORF质粒
   1. 选择单个菌落并将其接种在 4.5 mL LB 液体培养基中，该培养基补充有与 UAS 模块的抗生素耐药基因相对应的适当抗生素选择。在37°C下孵育过夜，同时以250rpm振荡。
   2. 使用质粒小量制备试剂盒提取质粒 DNA。设置 20 μL 限制性酶切反应，如下所示:300-500 ng/μL 质粒、适当的限制性内切酶、限制性酶切缓冲液和超纯水。将反应在37°C孵育1小时。
   3. 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过数字成像系统进行分析（图3）。

Results

我们应用CRISPRmass使用来自DGRC Gold Collection的3402个带有pOT2载体骨架的cDNA/ORF克隆生成全基因组UAS-cDNA/ORF质粒文库。我们仅随机分析了每种 UAS-cDNA/ORF 构建体的一个菌落，随后用 PstI 进行限制性分析表明，98.6% 的 UAS-cDNA/ORF 构建体成功创建⁹。使用 PstI 对带有 pOT2 载体骨架的 UAS-cDNA/ORF 构建体进行限制性分析的基本原理如下。对于基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆，UAS 模块中有两个 PstI 位点，pOT2 载体骨架中有一个 PstI 位点。因此，使用 PstI 消化基于 pOT2 载体的 UAS-cDNA/ORF 构建体可产生 408 bp UAS 模块特异性片段和 5649 bp UAS 模块载体组装特异性片段。408 bp 和 5649 bp PstI 片段表明，基于 pOT2 载体的 cDNA/ORF 克隆的 UAS-cDNA/ORF 构建体已成功创建，代表性结果如图 3 所示。

图 1:使用 CRISPRmass 构建 UAS-cDNA/ORF 文库的流程图。 用于构建UAS-cDNA/ORF文库的CRISPRmass管道。（1）第一步试管反应。cDNA/ORF质粒的相同载体骨架被Cas9/sgRNA切割。切割位点位于 cDNA/ORF 5′ 末端上游相邻的载体骨架中。裂解产物未经纯化，直接进行试管反应的第二步。用于切割反应的sgRNAs是通过 体外 转录制备的，无需纯化即可直接使用。然后，将切割位点的 5' 端（黄框）的 28-40 bp 定义为 5' 端重叠，将切割位点的 3' 端（红框）的 28-40 bp 定义为 3' 端重叠。载体骨架携带抗生素A抗性基因（绿框）。（2）第二步是试管反应。载体特异性 UAS 模块通过一步反应组装连接到 cDNA/ORF5′ 末端上游的 Cas9 线性化 cDNA/ORF 质粒中，从而产生 UAS-cDNA/ORF 构建体。一步反应组装产品直接进行 大肠杆菌 转化。在含有抗生素B的LB琼脂平板上选择转化体，该抗生素B对应于载体特异性UAS模块的抗生素B抗性基因（棕色盒）。只有所需的 UAS-cDNA/ORF 集落才能生长。UAS 模块包括 10 个拷贝的 UAS、一个 Hsp70 最小启动子、一个用于 phiC31 介导的基因组整合的 attB 序列、一个用于 果蝇 转基因的迷你白色转化标记、一个用于阳性选择的可选抗生素 B 抗性基因，以及支持单步反应组装的 5′ 末端重叠和 3′ 末端重叠。一步反应组装可过滤掉由 CRISPR/Cas9 引起的任何潜在脱靶 DNA 切割。这个数字是从⁹ 修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:通过 体外 Cas9 切割分析评估靶向 pOT2 载体骨架特定区域的 sgRNA。 带下划线的 sgRNA 被选为 CRISPRmass。M 是 DNA 标记。这个数字是从⁹ 修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:CRISPRmass 生成的 20 个 UAS-cDNA/ORF 构建体的限制性分析。 通过PstI酶切分析了这些构建体。观察到所有UAS-cDNA/ORF构建体的预期限制性模式。M 是 DNA 标记。这个数字是从⁹ 修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件1:pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70质粒的构建。 含有质粒pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70的pOT2载体特异性UAS模块基于pMartini-Amp、pBS-attB-UAS-Hsp70和pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70三种质粒构建。 请点击这里下载此文件。

Discussion

CRISPRmass最关键的步骤是sgRNA的设计和sgRNA的评估。为 Cas9 选择高效的 sgRNA 是 CRISPRmass 成功的关键。如果在用单步反应组装产物转化大肠杆菌后，在大多数含抗生素的LB平板上观察到很少或没有菌落，则通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒消化。如果质粒未得到良好消化，则检查Cas9活性、sgRNA降解和质粒质量;如果质粒消化良好，则检查单步反应组装试剂，并确保感受态细胞的转化效率至少为 1 x 10⁸ CFU/μg pUC19 DNA。值得注意的是，使用铝制冷却块可以缓解大规模的细菌转化。

CRISPRmass 的局限性源于其对载体骨架序列的操作和整合，这限制了在 5' 或 3' 端标记 cDNA 和 ORF 的可能性。

与所有其他现有方法 ^7,8 不同，CRISPRmass 操作并整合载体骨架序列⁹。因此，一旦设计和制备了UAS模块，CRISPRmass就不需要对每个质粒进行个性化设计或操作，而是在细菌转化之前大规模平行的两步试管反应，避免了PCR及其相关操作。此外，体外转录的sgRNA和一步反应组装产物都不需要纯化用于后续实验。与Gateway克隆技术相比，CRISPRmass更适合生成UAS-cDNA/ORF构建体，特别是来自长链或富含GC的cDNA/ORF，因为CRISPRmass本身不会PCR扩增cDNA或ORFs9^。

CRISPRmass可用于UAS-cDNA/ORF质粒文库的高通量构建，也可用于编辑各种全基因组质粒文库。CRISPRmass可以通过将CMV启动子插入到cDNA或ORFs的5'端附近的共享载体序列中来应用于表达质粒文库的构建。CRISPRmass有望加速功能基因组学的发展。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
铝冷却块	Aikbbio	ADMK-0296	进行细菌转化
DEPC 处理过的水	Invitrogen	AM9906
凝胶提取试剂盒	Omega	D2500	从琼脂糖凝胶中纯化 DNA
成像系统	Tanon	2500B
HiScribe T7 快速高产 RNA 合成试剂盒	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液	NEB	E2621
质粒小量试剂盒	Omega	D6943	从细菌细胞中分离质粒
DNA Q5 热启动高保真 2x 预混液	NEB	M0494
化脓性链球菌 Cas9	金斯瑞	Z03386
摇动培养箱	上海知初	ZQLY-180V
LongGene	T20	多模块热循环仪	PCR
Trans10 化学感受态细胞	TranGen BioTech	CD101
紫外分光光度计	岛津	BioSpec-nano	测量 DNA 或 RNA 的浓度