为透射电子显微镜制备视网膜类器官样本

摘要

本方案为视网膜类器官样本的透射电子显微镜制备提供了优化且详细的实验流程，适用于对成熟视网膜类器官中突触结构进行分析的相关研究。

摘要

视网膜类器官（ROs）是一种三维培养系统，在特定条件下由诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来，可模拟人类视网膜的特征。ROs中突触的发育与成熟已通过免疫细胞化学和功能学方法得到研究。然而，关于突触连接超微结构的直接证据仍然有限，其中包括特殊的带状突触和传统的化学突触。透射电子显微镜（TEM）具有高分辨率以及在阐明人类和多种物种视网膜发育与突触成熟过程中的悠久研究历史，是探索ROs中突触结构的有力工具，已在ROs研究领域广泛应用。因此，为了更深入地在纳米尺度上探究RO突触连接的结构并获得高质量的显微证据，我们开发了一种简单且可重复的RO TEM样品制备方法。本文详细描述了该实验方案所用试剂及具体步骤，包括RO的固定前处理、后固定、包埋和成像。

引言

视网膜是人类和哺乳动物中重要的视觉感觉器官，具有明显的层状结构，包含三个容纳神经元胞体的核层以及两个由突触连接形成的网状层¹，其中包括常规突触和特化的带状突触^2,3。带状突触在以分级方式传递囊泡冲动方面起着关键作用^2,3。视觉过程涉及电信号和光信号在各级神经元和突触之间的传递，最终到达视觉皮层^4,5。

视网膜类器官（ROs）是一种源自诱导多能干细胞（iPSCs）的三维（3D）培养系统，可模拟视网膜组织的生理状态 体外^1,6,7该方法在视网膜疾病研究方面具有广阔前景⁸药物筛选⁹，并可作为视网膜色素变性等不可逆性视网膜退行性疾病的一种潜在治疗手段¹⁰ 和青光眼¹¹. 作为一种强大的 体外 光学传导系统中，视网膜类器官内的突触是促进有效信号转换与传递的关键结构⁵.

视网膜类器官（RO）的发育可根据其形态特征和分子表达谱大致分为三个阶段^6,12。第一阶段（约D21-D60）的RO包含视网膜神经前体细胞、大量视网膜神经节细胞（RGCs）以及少量星爆型无长突细胞（SACs），对应于人类胎儿发育的第一个时期。第二阶段（约D50-D150）的RO表达部分光感受器前体细胞、中间神经元以及与突触形成相关的基因，代表一个过渡阶段。第三阶段（约D100-D150之后）的RO中，光感受器发育成熟，对应 于人类胎儿发育的第三个阶段^6,12,13。值得注意的是，与第一阶段和第二阶段的RO相比，第三阶段的RO具有明显的层状结构，其突触已成熟¹²，包括存在带状突触¹⁴。此外，最近一项研究证实，这些成熟突触能够传递光信号，表明其具备功能性¹³。因此，第三阶段的RO常被用于研究突触结构。

免疫组织化学被广泛应用于研究各种分子蛋白的表达。然而，光学显微镜的局限性在于其每次只能观察有限数量的特定细胞和分子，导致无法全面分析细胞与其周围环境之间的关系。透射电子显微镜（TEM）具有高分辨率，其分辨极限为0.1–0.2 nm，比光学显微镜高出约10–20倍¹⁵。TEM弥补了光学显微镜的不足，已被用于阐明人类^16,17以及多种物种^18,19,20,21的视网膜发育和突触成熟过程。TEM能够直接区分突触前和突触后结构^18,20，甚至可对核糖体^2,3、囊泡²²和线粒体²³等亚细胞结构进行全方位观察。因此，TEM是鉴定类器官（ROs）中突触类型以及在纳米尺度上探索突触连接超微结构的必要工具。

必须强调，样品制备对于获得高质量的电子显微图像至关重要。尽管已有研究对类器官（ROs）进行了电镜观察^12,13,24，但其详细操作步骤尚不明确。由于电镜图像的质量在很大程度上取决于类器官的固定效果和试剂渗透情况，因此在样品制备过程中需要考虑多种关键因素。为此，为了更有效地研究类器官中的突触连接，本文介绍了一种具有良好重复性的方法，详细展示了类器官固定、包埋以及观察位点鉴定的操作要点。

方案

1. 从iPSCs获得ROs²⁵

注意：视网膜类器官（RO）由iPSCs衍生而来，通过修改先前报道的方法获得。

1. 使用细菌蛋白酶（参见材料表）在约90%融合度时解离iPSCs。将细胞集落切成小块，并用细胞刮刀刮取。
2. 收集后，将细胞团块重悬于0.25 mL冰上预冷的Matrigel中。在37 °C孵育20分钟后，用DMEM/F12培养基（含0.5% N2补充剂、1% B27补充剂、0.1 mM β-巯基乙醇、0.2 mM L-谷氨酰胺替代物、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）分散已固化的凝胶。将此时间定义为分化的第0天。
3. 经过5天的悬浮培养后，细胞聚集形成细胞囊。将这些细胞囊转移至100 mm的培养皿中，使其贴壁并继续生长。
4. 在第15天，使用细菌蛋白酶解离贴壁细胞，并在DMEM/F12培养基（含2% B27补充剂、0.1 mM非必需氨基酸）中进行培养。
5. 在第21天，更换为20 mL含血清的培养基（DMEM/F12培养基、8% FBS、2% B27补充剂、100 mM牛磺酸和2 mM L-谷氨酰胺替代物），之后每周更换一次培养基。

2. ROs 的前方固定

1. 用移液器将一个培养的视网膜类器官（RO，约 D180，直径约 1~2 mm 为最佳）从培养皿轻柔转移至 1.5 mL 微量离心管中，并标记 RO 的相关信息。
   注意：若 RO 过大，可在含固定液的培养皿中，在显微镜下用剃须刀片将其切成两半，或切除结构不良的组织。
2. 用移液器从 1.5 mL 微量离心管中移除培养基。加入 1.5 mL 用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）稀释的 2% 多聚甲醛-2% 戊二醛固定液，在室温（RT）固定 4 小时。将微量离心管于 4 °C 过夜保存。
   注意：此步骤可暂停最多 1 周，但建议尽早继续操作。若 RO 放置时间过长，可能导致细胞自溶，破坏 RO 的超微结构。由于 RO 结构脆弱，应避免旋转、振荡、翻转或剧烈操作。

3. 视网膜类器官的后固定

1. 去除2%多聚甲醛-2%戊二醛固定液，加入1 mL pH 7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤3次，每次10分钟。洗涤过程中轻轻悬浮视网膜类器官（ROs）于1.5 mL微量离心管中，以确保充分冲洗。每增加一天固定时间，洗涤次数增加两次，以彻底去除 尽可能去除残留的固定剂。
2. 用移液器吸除残留的 PBS，加入约 150 µL 1% 锇酸（OsO₄），确保组织块完全浸没。将微量离心管放入避光盒中，于室温下避光浸透 1 小时。
   注意：OsO₄ 是一种强氧化剂，必须在通风橱中操作。

4. 染色与脱水

注意：从这一步开始必须打开除湿机，以干燥环境。

1. 用移液器除去OsO4，用0.01 M PBS（pH 7.4）洗涤3次，每次10分钟，然后用去离子水洗涤3次，每次10分钟。
   注意：为确保彻底清洗渗透压计（ROs），建议将ROs悬空放置。将四氧化锇（OsO4）吸入专用废液瓶中。
2. 移除最后一次去离子水清洗，每管加入约 150 µL 醋酸铀溶液（确保组织块完全浸润），室温避光染色 1–2 小时。微离心管需避光保护。
3. 在通风橱中移除乙酸铀，加入1 mL 50%丙酮，脱水10分钟。随后依次使用70%、80%、90%、100%和100%丙酮对ROs进行梯度脱水，每次脱水持续10分钟。
   注意：每次更换时需保留少量液体浸泡ROs，以防止其暴露于空气和湿气中。此外，由于丙酮具有挥发性，操作应尽快迅速进行。将乙酸铀酰抽吸至专用废液瓶中。

5. 渗入

1. 弃去丙酮，加入约 150 µL 丙酮与 Epon-812 树脂按 1:1 比例配制的混合液，置于 37 °C 烘箱中 1 小时。
2. 移除上述混合液，替换为丙酮与 Epon-812 树脂按 1:4 比例配制的混合液，置于 37 °C 烘箱中过夜。
3. 小心将视网膜类器官转移至含有约 500 µL 纯环氧树脂的新管中，置于 45 °C 烘箱中 1 小时。

6. 包埋

1. 按照制造商说明书，提前将试剂盒中的组分混合，于50 mL离心管中配制30-50 mL纯环氧树脂。将纯环氧树脂缓慢倒置旋转30分钟，以减少混合过程中引入的气泡。随后，将其置于37 °C烘箱中20分钟。取2/3体积的纯环氧树脂加入包埋模具的槽内。
2. 使用牙签将ROs挑入装有纯环氧树脂的包埋模具中。
3. 用纯环氧树脂充满槽内，直至表面略微凸起或隆起。
4. 调整ROs在包埋模具两端的位置，以实现定向包埋。将包埋模具置于45 °C烘箱中1-2小时，然后转移至65 °C烘箱中固化48-72小时。

7. 半薄切片定位

1. 使用砂纸打磨包埋块较长四边周围组织外多余的环氧树脂，形成梯形面。将包埋块安装到样品台座上，并用L型螺丝刀拧紧固定螺栓。然后将玻璃刀安装在刀架上，并用手拧紧螺母。
2. 修除多余的树脂，直至暴露出目标区域。
3. 向玻璃刀的水槽中加水。使用半薄切片机切割厚度为1 µm的半薄切片，并用细针将其转移至载玻片上。
4. 加入50 µL 1%甲苯胺蓝溶液对半薄切片进行染色，置于加热板上95 °C孵育1分钟。用蒸馏水冲洗2分钟。使用20倍普通光学显微镜观察切片结构。

8. 超薄切片

1. 按照步骤 7.1 所述安装包埋块和玻璃刀。调整刀与组织块之间的距离、槽内液面高度以及切片速度。使用超薄切片机切割厚度约为 70–100 nm 的超薄切片，并用带支持膜的铜网（200 目）捞取切片。
2. 在双重染色程序中，用 3% 柠檬酸铅染色超薄切片 15 分钟，以增强对比度。

9. 通过透射电子显微镜成像类器官

1. 启动软件（参见材料表）。
2. 点击记忆模式按钮，大致标记每张超薄切片。
3. 寻找突触结构。
   1. 在低倍镜下区分类器官（ROs）的层状结构。
   2. 定位外核层（ONL），该层具有电子密度较深的细胞核结构；随后移动至光感受器终末，此处聚集大量囊泡。寻找仅含一条突触带的视杆细胞终末，以及含有多个突触带的视锥细胞终末。
   3. 移至内丛状层（IPL），寻找具有小型突触带的类似结构。
4. 采集显微图像。
   1. 点击开始，输入相应的放大倍数。
   2. 保存图像。

结果

通过iPSC分化建立3D视网膜类器官（ROs）为研究视网膜疾病机制和干细胞替代治疗提供了强有力的工具。尽管已有研究通过功能实验和免疫细胞化学方法证明了ROs中存在突触连接，但关于经典突触和带状突触的直接超微结构证据仍十分有限。本文介绍了一种利用透射电子显微镜（TEM）研究ROs中两类突触超微结构的方法。在培养180天后，对ROs进行固定、染色、包埋并制备超薄切片。TEM观察显示，光感受器轴突末梢存在带状突触（图1 和 图2），这些突触分布于外丛状层（OPL）。在TEM下可见，视杆细胞球状突触凹陷周围的带状结构与水平细胞形成马蹄形结构（图1）。视杆细胞通常仅含有一个带状突触，而视锥细胞则含有多个带状突触（图2）。此外，还在内丛状层（IPL）中观察到无长突细胞之间的经典化学突触（图3）。在TEM下，化学突触由三部分组成：突触前成分、突触间隙和突触后成分。突触前和突触后部位对应的细胞膜比其他区域略厚，两层膜之间的狭窄间隙称为突触间隙。突触前膜胞质侧含有大量突触小泡。本研究证实了由iPSC来源的3D ROs中存在完整的突触连接结构。但需注意的是，各步骤之间冲洗不充分会导致样品制备过程中出现黑色颗粒沉淀（图4）。

图 1：类视网膜器官（ROs）中杆状细胞带状突触的透射电子显微镜（TEM）图像。 （A,B）杆状细胞与水平细胞形成马蹄形结构。在类视网膜器官（ROs）的外丛状层（OPL）中，每个杆状细胞球状末梢均可见一个单一的带状突触（箭头所示），周围环绕着大量突触小泡。比例尺 = 0.2 µm。缩写：ROs = 类视网膜器官；HC = 水平细胞；OPL = 外丛状层。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：视网膜类器官（ROs）中视锥细胞带状突触的透射电镜图像。 在视网膜类器官（ROs）外丛状层（OPL）的视锥细胞足突中，可见三个明显的带状突触（箭头所示）。标尺 = 0.2 µm。缩写：TEM = 透射电镜（transmission electron microscopy）；ROs = 视网膜类器官（retinal organoids）；OPL = 外丛状层（outer plexiform layer）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：类器官中化学突触的透射电镜图像。在视网膜类器官（ROs）的内丛状层（IPL）中，观察到无长突细胞之间形成的典型化学突触。该化学突触由三部分组成：突触前成分、突触间隙和突触后成分。在突触前膜部位的细胞质中可见大量突触小泡。箭头指示突触传递的方向，显示多个小泡从一个AC1突起传递至另一个AC2结构。比例尺 = 0.2 µm。缩写：TEM = 透射电子显微镜；ROs = 视网膜类器官；IPL = 内丛状层；ACs = 无长突细胞。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 4：样品制备过程中可能出现的问题示例。 由于步骤之间冲洗不充分，视锥细胞突触小体中存在大量黑色颗粒（圆圈）。箭头：带状突触。比例尺 = 0.2 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文中，我们介绍了一种通过透射电镜观察类器官中常规突触及带状突触超微结构的详细方案。该方案基于此前报道的视网膜制备方法，并进行了若干修改。²⁰为提高样品处理的成功率和透射电镜照片的质量，需考虑以下关键点。首先，必须认识到视网膜类器官（ROs）由诱导性多能干细胞（iPSCs）发育而来，形成无血管结构的细胞团块^6,26 和胶质细胞²⁶这种缺失可能导致组织结构的紧密性低于 体内 视网膜。因此，为保持其结构和完整性，必须轻柔操作视网膜组织。添加液体时应沿管壁缓慢加入，以尽量减少扰动。

重要的是，在方案步骤4中确保组织彻底脱水，并在开始脱水步骤前开启除湿机以降低室内湿度。更换丙酮时应快速操作，并保留部分液体以浸没组织，防止RO组织结构受到严重破坏。未充分脱水的组织在高海拔电子显微镜环境下会急剧收缩，且组织中的水分 阻碍包埋剂的渗透。

由于视网膜类器官（ROs）呈透明球状，因此在切取半薄切片时需确保正确的方向，以获得完整的层状结构。最后，发育至第3阶段（约D100-D150之后）的ROs被视为成熟类器官，具备完整的突触结构¹²，因此建议在此类ROs中开展对突触连接（包括带状突触和化学突触）的研究。

尽管先前的研究已提供了一些关于视网膜类器官（RO）突触的超微结构证据，但尚未详细描述RO样本制备的完整流程以及各类突触结构的鉴定方法^12,13,24。Capowski等人采用多种技术研究了不同人多能干细胞（hPSC）系在不同阶段诱导产生的RO的特性，其中包括电子显微照片显示视锥细胞足突中存在富含囊泡的带状突触，表明由不同hPSC系在第3阶段诱导产生的RO已具备成熟且功能完整的特征¹²。Cowan等人利用透射电子显微镜（TEM）和双光子成像技术证实了成熟RO中功能性带状突触结构的形成¹³，但未明确指出突触类型（视锥或视杆突触）。然而，我们多批次的显微图像结果显示，带状突触的膜结构具有理想的清晰度和对比度，说明本方法具有可行性与可重复性。此外，我们根据形态学特征的不同对不同类型的突触进行了鉴定：视锥突触通常较大，含有多个带状结构，而视杆突触通常较小，仅含一个带状结构；在化学突触中，囊泡聚集于突触前结构，且突触间隙的电子密度增强。

类器官中突触连接的超微结构完整性对其功能至关重要。利用透射电子显微镜（TEM）研究这些连接，在多个领域具有广泛而重要的优势，例如体外研究视网膜的发病机制、在类器官中进行药物筛选，以及评估类器官的分化技术等。由于受限于二维TEM成像，仅能观察到类器官超微结构的特定方面，难以对突触的整体结构进行立体分析。此外，分化过程的局限性可能导致细胞定位异常^13,26，进一步增加了观察的复杂性。因此，未来结合体积电子显微镜成像与三维重建技术，有望克服这些局限性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	Corning	430167
丙酮	Electron Microscopy Science	10000
B27 添加剂	Gibco	A3582801
细胞刮刀	Santa Cruz	sc-395251
铜网	北京中镜科仪技术有限公司	AZH400HH
DigitalMicrograph 软件	Gatan, Inc.		软件
Dispase	StemCell Technologies	#07913	细菌蛋白酶
DMEM/F12 培养基	Gibco	#11320033
包埋模具	北京中镜科仪技术有限公司	GZ10592
Epon-812 树脂	Electron Microscopy Science	#14900
胎牛血清（FBS）	Biological Industries	#04-0021A
戊二醛	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
柠檬酸铅	北京中镜科仪技术有限公司	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-谷氨酰胺替代物
Matrigel	Corning	356234
显微镜载玻片	CITOTEST	80312-3161
N2 添加剂	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	PB/PBS 的组分
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	PB/PBS 的组分
非必需氨基酸	Sigma	#M7145
光学显微镜	实验室双目光学生物显微镜	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
烘箱	Bluepard	BPG9040A
多聚甲醛	Electron Microscopy Science	157-8
青霉素-链霉素	Gibco	#15140-122
半/超薄切片机	Reichert-Jung	396649
牛磺酸	Sigma	#T0625
甲苯胺蓝	生工生物	E670105-0100
透射电子显微镜	HITACHI	H-7500
醋酸铀	TED PELLA	CA96049
β-巯基乙醇	Sigma	444203