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脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

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DOI：

10.3791/66616

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2024年4月5日

 ,  , 
1Laser Research Centre, Faculty of Health Science, University of Johannesburg

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。

摘要

脂肪来源的干细胞（ADSCs）具有类似于干细胞的多能间充质特性，因其能够向多种细胞类型分化，并促进细胞迁移、增殖以及减轻炎症反应，故常被用于再生医学。然而，ADSCs在伤口中的存活和定植常面临挑战，主要原因是局部存在不利的炎症环境。为解决这一问题，已开发出可维持ADSC在伤口中活性的水凝胶，以加速伤口愈合过程。本研究旨在评估光生物调节疗法（PBM）在三维细胞培养体系中对ADSC增殖及细胞毒性的协同影响。将永生化ADSC以2.5 × 103个细胞的密度接种于10 µL水凝胶中，并使用波长为525 nm和825 nm的二极管光源，以5 J/cm2和10 J/cm2的能量密度进行照射。在PBM处理后24小时和10天分别评估细胞形态变化、细胞毒性和增殖情况。结果显示，ADSC呈现圆形形态，以单个细胞或球状聚集体的形式均匀分布于凝胶中。重要的是，PBM与三维培养体系均未对细胞产生细胞毒性作用，且PBM显著提高了ADSC的增殖速率。综上所述，本研究证实水凝胶可作为ADSC三维培养的适宜环境，并提出PBM是一种有效的增强策略，尤其可缓解三维细胞培养中常见的增殖缓慢问题。

引言

ADSCs 是具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的间充质多能祖细胞。这些细胞可在脂肪抽吸术过程中从脂肪组织的基质血管组分（SVF）中分离获得。1脂肪源性干细胞（ADSCs）因其来源丰富、获取过程微创、易于获取且特性明确，已成为再生医学中理想的干细胞类型。2干细胞治疗通过促进细胞迁移、增殖和新生血管形成，并减轻伤口内的炎症反应，为伤口愈合提供了一种可能的途径。3,4大约80%的ADSCs再生能力归因于其分泌组介导的旁分泌信号传导5此前有研究提出，将干细胞或生长因子直接局部注射到受损组织中，可引发足够的反应 体内 修复机制6,7,8然而，这种方法面临若干挑战，例如由于炎症环境导致干细胞在受损组织中的存活率低下以及移植效率降低 9此外，其中一个被提及的原因是缺乏细胞外基质来支持移植细胞的存活与功能10为应对这些挑战，目前的研究重点已转向开发生物材料载体，以支持干细胞的存活与功能。

三维（3D）细胞培养增强细胞间及细胞与基质间的相互作用 体外 提供一个更接近真实情况的环境 体内 环境11水凝胶作为一类生物材料载体已被广泛研究，可为干细胞培养提供三维环境。这些结构由水和交联聚合物构成。12水凝胶包封ADSCs在培养过程中对细胞几乎无细胞毒性，同时可维持细胞活力6三维培养的干细胞表现出更强的干性维持能力和更优的分化潜能13类似地，在动物模型中，接种于水凝胶的脂肪来源间充质干细胞表现出更高的存活率和更快的伤口闭合速度14此外，水凝胶包封显著提高了ADSCs在伤口中的定植和滞留15,16TrueGel3D 由一种聚合物（聚乙烯醇或葡聚糖）制成，并通过交联剂（环糊精或聚乙二醇）固化。17该凝胶是一种合成水凝胶，不含任何可能干扰实验或在将凝胶移植到患者体内时引发免疫反应的动物源成分，同时能有效模拟细胞外基质18通过调整凝胶的成分和各个组分，可实现高度定制化。该凝胶可容纳不同类型的干细胞，并通过调节凝胶刚度支持多种细胞类型的分化19. 可通过添加多肽来创建附着位点20该凝胶可被金属蛋白酶的分泌降解，从而允许细胞迁移21最后，该材料透明，可适用于成像技术。

PBM 是一种微创且易于操作的低强度激光疗法，用于刺激细胞内发色团。不同波长对细胞产生不同的效应。22红光至近红外光范围内的光照通过增强电子传递链的通量，刺激三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）生成增加。23蓝光和绿光范围内的光照可激活光敏离子通道，促使钙、镁等阳离子非特异性地进入细胞，已知这一过程可促进细胞分化。24其净效应是产生第二信使，进而促进转录因子的表达，触发细胞迁移、增殖和分化等下游细胞过程。25PBM可用于在将细胞移植到不利环境（如受损组织）之前，对细胞进行预处理以促进其增殖或分化26移植前后对ADSCs进行PBM（630 nm和810 nm）照射显著增强了这些细胞的存活率和功能 体内 在糖尿病大鼠模型中27再生医学需要足够数量的细胞以有效修复组织28在三维细胞培养中，与二维细胞培养相比，脂肪源性干细胞（ADSCs）的增殖速率较慢。6然而，PBM 可通过增强细胞活力、增殖、迁移和分化能力，用于优化 ADSCs 的三维细胞培养过程。29,30.

方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息，请参见材料表。本方案已在图1中以图示形式概括。

1. 二维（2D）细胞培养

注意：永生化的ADSCs（1 × 106 个细胞）保存在液氮中，温度为-195.8 °C，冻存管中含1 mL细胞冻存液。

  1. 准备二维细胞复苏培养基和二维培养瓶
    1. 将39 mL基础培养基转移至50 mL离心管中
    2. 向基础培养基中添加20%胎牛血清（FBS；10 mL）和抗生素（1 mL）（0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL两性霉素B）进行富集。
    3. 通过将6 mL细胞复苏培养基转移至T75培养瓶中进行预处理，并在37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育45分钟（可在进行细胞复苏操作的同时完成此步骤以节省时间）。
      注意：使用前将完全培养基预热至37 °C，储存时置于4 °C，最长保存1周。
  2. 二维细胞复苏
    1. 从液氮储存罐中取出一支冻存管，在37 °C水浴中快速解冻，直至完全融化。
    2. 将冻存管在离心机中以1006 × g离心5分钟（20 °C），随后弃去上清液。
    3. 用1 mL预热的细胞复苏培养基重悬细胞沉淀。
    4. 将重悬的细胞均匀接种至已预处理的培养瓶中（终体积为7 mL），并在37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育。
    5. 24小时后弃去并更换细胞复苏培养基。
    6. 每2–3天更换一次培养基，直至培养瓶中的细胞达到汇合状态。
  3. 二维培养瓶细胞收获为单细胞悬液及细胞计数
    1. 从培养箱中取出二维培养瓶，将培养基弃入适当的废液容器中。
    2. 向培养瓶中加入10 mL冲洗液冲洗细胞，以去除残留物和蛋白沉积，随后弃去冲洗液。
    3. 向培养瓶中加入6 mL消化液以使细胞脱落。将培养瓶置于37 °C、5% CO2和85%湿度条件下孵育2分钟。
      注意：在显微镜下观察培养瓶，确认所有细胞均已脱落。若未完全脱落，可轻轻敲击培养瓶并继续孵育1分钟。
    4. 待所有细胞脱落后，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并向管中加入1 mL含20% FBS的细胞复苏培养基，以中和消化液的作用。
    5. 在1711 × g条件下离心5分钟（20 °C）。
    6. 弃去上清液，用1 mL完全培养基重悬细胞。
    7. 取10 µL细胞悬液，置于500 µL微量离心管中，与10 µL台盼蓝按1:1比例混合。
    8. 取10 µL台盼蓝-细胞混合液，重复加入细胞计数板中两次。
    9. 将细胞计数板放入自动细胞计数仪中。仪器将显示每毫升的总细胞数以及活细胞和死细胞数量。计算平均活细胞数，并确定后续嵌入三维水凝胶所需的活细胞数量（见步骤2.2.6）。

2. 三维细胞培养

  1. 配制3D完全培养基
    1. 将44 mL基础培养基转移至50 mL离心管中。
    2. 向培养基中添加10%胎牛血清（FBS，5 mL）以及抗生素（1 mL）（0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL两性霉素B）。
      注意：使用前将完全培养基预热至37 °C，并在4 °C下保存，最多保存一周。
  2. 配制水凝胶
    1. 通过离心（20 °C下，1000 × g 离心30秒）快速葡聚糖小瓶，使材料浓缩。向快速葡聚糖小瓶中加入175 µL水，以获得终浓度为30 mmol/L反应性基团的溶液。
    2. 涡旋含有快速葡聚糖溶液的离心管（中速涡旋30秒），直至材料完全溶解。将溶解后的溶液置于冰上孵育5分钟。离心管短暂离心后，再短暂涡旋，并在后续使用过程中保持在冰上。
    3. 离心交联剂（20 °C下，1000 × g 离心30秒）以浓缩材料。向交联剂小瓶中加入188 µL水，以获得终浓度为20 mmol/L巯基的溶液。
    4. 涡旋含有交联剂溶液的离心管（中速涡旋30秒），直至所有材料完全溶解。将溶解后的交联剂在室温（RT）下孵育5分钟。离心管短暂离心后，再短暂涡旋，并在后续使用过程中保持在室温。
    5. 为降低成本，将水凝胶方案从30 µL调整为10 µL（具体细节见表1）。
    6. 制备细胞悬液，使每10 µL水凝胶中接种2.5 × 103个细胞。
    7. 根据表1中的组分配制主混合液。将9 µL主混合液转移至96孔条板的一个孔中。
    8. 在主混合液转移3分钟后，加入1 µL可降解交联剂，使凝胶固化。
    9. 在水凝胶上覆盖170 µL预热的完全培养基，孵育1小时。1小时后更换培养基。
      注意：包埋于水凝胶中的细胞已在3D培养系统中准备好，可用于后续实验或分析。根据需要遵循其他相关方案进行下游应用。

3. 光生物调节照射

  1. 设置激光器
    1. 为二极管激光系统设置绿色（525 nm）或近红外（825 nm）波长。打开激光器，并按照推荐时长进行预热。
    2. 让激光器达到稳定状态，以稳定其输出功率。这可确保照射的一致性和准确性。
    3. 使用激光功率计测量激光器的输出功率。记录每种波长的功率值。
    4. 使用公式1（激光照射时间）计算激光照射时间。将表2中的数值代入公式1，以确定每种能量密度下的适当照射时间。在公式1中，“r”表示激光照射区域的半径。
      功率密度公式 \( mW/cm^2 = \frac{mW}{\pi \times r^2} \)，数学方程。
      功率密度换算公式：W/cm² = mW/cm² ÷ 1000；数学方程。
      时间计算公式，\( \text{时间 (s)} = \frac{J/\text{cm}^2}{W/\text{cm}^2} \)，物理方程。
      公式1
    5. 参考表2获取计算所需的特定参数，包括能量密度（5 J/cm² 或 10 J/cm²）和激光输出功率。
  2. 照射三维细胞培养物
    1. 在更换完全培养基（步骤2.2.9）后，将含有水凝胶包埋细胞的96孔板置于二极管激光系统下。根据选定的能量密度（5 J/cm² 或 10 J/cm²）和选定的波长（绿色或近红外），使用计算出的激光照射时间对水凝胶进行照射。因此，各培养样本仅接受一次剂量照射。
    2. 确保每个实验组均设有对照组（n = 4），即包埋于水凝胶中但未接受光生物调节治疗（PBM）的ADSCs。
      注意：务必佩戴适用于所用光波长的安全护目镜。激光在安全柜外使用，因此使用前必须对区域进行彻底消毒。
    3. 将培养板置于37 °C、5% CO2、85%湿度条件下培养，持续整个实验过程。照射后，分别培养24小时用于首次分析，或培养10天用于第二次分析阶段。

4. 形态学

  1. 倒置光学显微镜观察
    1. 打开倒置光学显微镜，预热数分钟。确保显微镜已正确对准并完成校准。
    2. 根据实验设置，将样品制备于显微镜载玻片或专用细胞培养皿上。校准显微镜以获得最佳成像条件。
    3. 根据需要调节焦距、亮度和对比度。选择显微镜上的20倍物镜，用于观察和记录细胞形态。
    4. 将样品置于显微镜载物台上，通过目镜对目标细胞进行调焦。利用目镜或相机视图观察并记录细胞形态，注意细胞的形状、大小及任何显著特征。
    5. 将相机模块连接至显微镜，设置数码成像系统，确保相机与显微镜之间连接正确且通信正常。
    6. 使用20倍物镜拍摄所观察细胞的数码图像。通过相机控制调节曝光、焦距及其他相关参数。
      注意：确保所获取的图像质量高，并能代表性地反映细胞形态。
    7. 在计算机上启动成像软件，采集图像，并利用软件内的分析工具对细胞形态进行分析。
    8. 根据实验目标，测量细胞尺寸、计数细胞或执行其他相关分析。
    9. 使用软件在图像上添加适当的比例尺。根据物镜的已知放大倍数，准确标示图像的比例。

5. 生物化学检测

  1. 细胞回收
    注意：需要将细胞从水凝胶中以单细胞悬液的形式回收，以便进行后续的下游生化检测。
    1. 准备酶解细胞回收溶液。在无菌环境下，按1:20（溶液：PBS）的比例，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释酶解细胞回收溶液，配制工作液。若需从特定数量的凝胶或孔中回收细胞，请根据每孔凝胶使用30 µL回收溶液计算所需总体积。
    2. 向每个含有待回收细胞的凝胶或孔中加入30 µL工作液。通过轻轻摇动或旋转培养板，确保回收溶液均匀分布。根据推荐的孵育时间将培养板与回收溶液一起孵育。该信息通常可在供应商提供的产品说明书或实验方案中找到。
    3. 孵育结束后，小心将培养板从孵育箱中取出。在1409 × g 条件下离心5分钟（20 °C），使细胞沉淀。具体离心条件请参考产品说明书或实验方案。离心完成后，小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
    4. 用220 µL无菌PBS轻柔重悬细胞沉淀。充分混匀，以获得均一的单细胞悬液。此时细胞已准备好用于后续生化检测。请根据目标检测的具体实验方案操作，并结合回收细胞的特性及实验设置要求进行。
  2. 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测
    1. 对于每个孔，小心移除50 µL完全培养基，尽量避免扰动细胞层。
    2. 向每个含有剩余50 µL培养基的孔中直接加入50 µL细胞毒性试剂。通过上下吹打轻轻混匀，确保样品与试剂充分混合。
    3. 设置阳性对照。使用试剂盒中提供的阳性对照细胞，每50 µL细胞悬液中加入5 µL 10倍裂解液，设置三个重复孔。
    4. 将培养板按照推荐的温度和时间进行孵育。此步骤使细胞毒性试剂裂解细胞，并将LDH释放到培养基中。
    5. 孵育结束后，向每个含有细胞毒性试剂和细胞裂解物的孔中直接加入50 µL终止液。通过上下吹打轻轻混匀，确保反应被有效终止。
      注意：终止液可阻止LDH的进一步释放，并确保显色反应的稳定性。
    6. 按照仪器制造商的说明设置分光光度计酶标仪。在490 nm波长下读取各孔的吸光度。该波长专用于检测LDH反应生成的甲臜产物的比色信号。
    7. 从处理组和对照孔的吸光度读数中减去背景值。背景值应来自仅含培养基和细胞毒性试剂但不含细胞的孔。
    8. 分析各样本校正后的吸光度值，以确定细胞毒性水平。吸光度值越高，表明LDH释放越多，细胞毒性越高。
    9. 为确保统计准确性，每个实验组和对照组均应包含四个重复（见步骤3.2.2）。计算每组及对照的平均吸光度，并导入合适的统计分析软件中。
    10. 比较处理组与相应对照组的结果，准确评估细胞毒性效应，并记录所有吸光度读数、计算过程和实验条件，以备后续参考。
  3. ATP增殖检测
    1. 在无菌环境下，向每个孔中加入50 µL回收的细胞与50 µL ATP检测试剂混合液。
      注意：根据孔数和实验设计调整细胞和试剂的体积。为获得准确结果，应保持一致的体积比例。
    2. 将培养板置于摇床上，在避光条件下剧烈振荡5分钟，以确保细胞与试剂充分混匀。振荡结束后，在室温下额外孵育25分钟。此孵育过程可使试剂裂解细胞，并产生与ATP含量成正比的发光信号。
    3. 按照制造商说明设置酶标仪用于发光检测。测量每个含有细胞裂解物和ATP检测试剂的孔的发光值。确保酶标仪已设定为合适的发光检测参数。
    4. 从处理组和对照孔的发光值中减去背景信号。背景值应来自仅含ATP检测试剂和PBS但不含细胞的孔。
    5. 分析各样本校正后的发光值，以确定ATP水平，反映细胞增殖或活力状态。
    6. 为确保统计准确性，每个实验组和对照组均应包含四个重复（见步骤3.2.2）。计算每组及对照的平均发光值，并导入合适的统计分析软件中。
    7. 比较处理组与相关对照组的结果，准确评估ATP增殖情况。记录所有发光读数、计算过程和实验条件，以备后续参考。
      注意：对于所有以试剂盒形式进行的生化分析，应遵循制造商提供的试剂盒说明书或实验方案中的具体细节，如推荐的孵育时间、浓度以及任何附加步骤或注意事项。处理化学品和生物材料时，务必遵守实验室安全规范。

结果

为评估水凝胶的形态并直观检查细胞密度，采用倒置显微镜进行观察（图2）。在接种并接受PBM照射后24小时，ADSCs仍保持圆形形态。细胞以单细胞或葡萄串样簇状结构分散分布于凝胶中。在三维培养10天后，细胞形态未发生明显改变。实验组与对照组之间，以及不同实验组之间，均未观察到形态学上的显著差异。

为了评估光生物调节（PBM）照射以及使用水凝胶进行三维培养的细胞毒性效应，检测了乳酸脱氢酶（LDH）的释放量（图3）。在24小时或10天时，实验组与对照组之间均无显著差异，表明PBM照射和水凝胶培养对细胞无有害影响。

通过测定ADSCs的ATP含量来评估细胞增殖速率（图4）。与对照组相比，所有经PBM处理的实验组均表现出更高的增殖速率。在PBM处理后24小时，525 nm波长刺激产生的增殖速率最高。然而，在第10天时，825 nm波长组的增殖速率优于525 nm波长组。 在为期10天的培养结束时，825 nm、10 J/cm2组显示出最高的增殖速率。

水凝胶制备、PBM照射、形态学检测；聚合物细胞过程示意图。
图1：实验方案概览。 本图概述了实验流程，重点展示在96孔板中进行水凝胶制备、PBM照射，以及PBM照射后24小时和10天时的细胞形态学与生物化学检测。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示细胞培养形态的显微镜图像，比例尺为60 µm；细胞结构分析。
图2：接种后ADSCs发生自聚集。 细胞保持圆形至卵圆形形态，在水凝胶中以单个细胞或呈葡萄串样簇状聚集的形式分布，在接种并接受PBM照射后（A）24小时和（B）10天时均可观察到。培养10天后未见明显变化。对照组分别为（1和4），525 nm波长下5 J/cm2（2）和10 J/cm2（5），或825 nm波长下5 J/cm2（3）和10 J/cm2（6）。请点击此处查看该图的放大版本。

LDH 吸光度图：对照组与在 5、10 J/cm² 剂量下 525 nm、825 nm 光照暴露随时间变化的比较。
图 3：使用水凝胶中 525 nm 和 825 nm 二极管（5 J/cm2 和 10 J/cm2）照射后 24 小时和 10 天的细胞 LDH 渗漏作为细胞毒性的测量指标。 与实验对照组相比，未观察到细胞毒性显著增加。阳性对照代表完全细胞死亡。请点击此处查看该图的放大版本。

ATP 发光检测结果；柱状图比较了对照组、525 nm 和 825 nm 处理组在 24 小时和 10 天后的结果。
图 4：使用水凝胶中 525 nm 和 825 nm 激光二极管（能量密度分别为 5 J/cm2 和 10 J/cm2）照射后 24 小时和 10 天，以细胞内 ATP 水平作为细胞增殖的检测指标。 在两个时间点和两种能量密度下，所有实验组的增殖率均因光生物调节（PBM）照射而升高。显著性差异（P < 0.001）以 *** 表示。请点击此处查看该图的放大版本。

组分每孔体积 (µL)
SLO-Dextran 聚合物 (30 mmol/L)0.7
细胞悬液2
缓冲液0.8
水5.5
交联剂1
总体积10

表1：水凝胶（10 µL）试剂体积。

激光参数绿色 (G)近红外 (NIR)
光源二极管激光器二极管激光器
波长 (nm)525825
输出功率 (mW)553515
功率密度 (mW/cm2)57.4853.53

表2：激光参数。

讨论

脂肪来源干细胞（ADSCs）是再生医学中理想的细胞类型，因其可促进多种过程以辅助伤口愈合3,4。然而，仍存在若干需要克服的挑战，例如细胞在损伤部位的存活率低以及移植效果不佳9。本研究采用永生化细胞作为商业化细胞系，因其相比原代细胞可进行更多代次的传代，无需反复分离获取，且具有明确的特性以及均一的细胞群体，从而确保实验结果的一致性31。本研究旨在利用三维细胞培养技术，评估光生物调节（PBM）对ADSCs增殖能力及细胞毒性的增强潜力。根据制造商提供的30 µL水凝胶操作方案，本研究将其调整为10 µL以降低成本32。然而，体积的减少使得凝胶的制备与操作更为困难。

ADSCs 已被证明可在三维环境中自我聚集33同样，在本研究中，细胞形成了具有葡萄状外观的细胞聚集体，但也观察到单层细胞的存在。细胞脱落是球状体已知的特性，表现为细胞从主要的球状体或聚集体上脱离并释放到培养环境中。细胞脱落可源于细胞增殖，即在有丝分裂过程中，活细胞被释放，从而实现迁移。34或者，脱落可能是由于细胞死亡以及类球体或聚集体形态的丧失所致35，尤其是在较大的类球体中，由于坏死核心的增大所致。与二维培养中的梭形形态相比，细胞在三维培养中呈现圆形形态。与类似研究的结果一致，这些现象是由于细胞缺乏附着位点或可附着的细胞外基质所致6,9此外，细胞在凝胶中未表现出显著迁移，进一步提示需要附着位点36建议添加黏附肽或其他细胞外基质蛋白，以促进细胞的贴附、黏附和迁移。本研究的局限性在于使用倒置光学显微镜观察ADSCs的三维形态，而非采用Z轴层扫成像。PBM照射及三维培养在照射后24小时和10天均未对ADSCs的细胞毒性产生显著影响，表明水凝胶培养和PBM具有安全性，对细胞无不良影响。6,26在三维细胞培养中，脂肪来源干细胞（ADSCs）的增殖速率较二维细胞培养更慢。本研究中正常对照组较低的增殖率为此提供了支持证据。6PBM（525 nm 和 825 nm）显著提高了三维培养条件下ADSCs的增殖速率。最初，5 J/cm²剂量的绿光（525 nm）在两个时间点均表现出促进作用。2 和 10 J/cm2 与近红外光（825 nm）相比，fluences 在早期诱导了最高的增殖率。然而，在第10天时，近红外光（825 nm）在两种 5 J/cm 条件下均表现出最高的增殖率2 和 10 J/cm2 增殖率。类似地，PBM（525 nm 和 825 nm）已被证明可提高二维培养中的细胞增殖速率37建议同时包含波长组合组，因为其他研究已报道绿光和近红外光具有协同效应。

综上所述，所使用的水凝胶是一种合成水凝胶，具有极强的可定制性，能够满足不同应用的需求。本研究已证实，该凝胶在10天培养期间对细胞无细胞毒性作用。此外，尽管处于三维培养环境中，PBM仍表现出显著促进间充质干细胞（ADSCs）增殖的正向增强潜力。因此，这种水凝胶可作为伤口移植的潜在生物材料载体。未来的研究应致力于通过动物实验评估该凝胶在促进伤口愈合方面的潜在能力。若动物试验结果理想，则有望在临床应用中采集患者来源的ADSCs，将其包封并与PBM联合处理后再移植至伤口，以促进伤口愈合。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由南非国家研究基金会 Thuthuka 项目资助，资助号 TTK2205035996；非洲激光中心（ALC）由科学与创新部（DSI）资助，资助号 HLHA23X，任务编号 ALC-R007；约翰内斯堡大学研究委员会资助，资助号 2022URC00513；南非科技部南非研究讲席计划（DST-NRF/SARChI）资助，资助号 98337。资助机构在研究设计、数据收集、分析、解释以及论文撰写过程中均未发挥任何作用。作者感谢约翰内斯堡大学（UJ）和激光研究中心（LRC）提供设施与资源支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
525 nm 二极管激光器National Laser Centre of South AfricaEN 60825-1:2007
825 nm 二极管激光器National Laser Centre of South AfricaSN 101080908ADR-1800
96 孔条板Sigma-AldrichBR782301
两性霉素 BSigma-AldrichA2942抗生素（0.5%；0.5 mL）
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒PromegaG9681ATP 试剂，增殖检测试剂盒
Corning 2 mL 外螺纹聚丙烯冻存管Corning430659冻存管
CryoSOfreeSigma-AldrichC9249细胞冻存培养基
CytoTox96 非放射性细胞毒性检测试剂盒PromegaG1780细胞毒性试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基Sigma-AldrichD5796基础培养基（39 mL/44 mL）
FieldMate 激光功率计Coherent1098297
Corning 平底 96 孔透明聚苯乙烯板Sigma-AldrichCLS3370
胎牛血清BiochromS0615培养基添加剂（5 mL；10% / 10 mL；20%）
Hanks 平衡盐溶液（HBSS）Sigma-AldrichH9394冲洗液
Heracell 150i CO2 培养箱Thermo Scientific51026280
Heraeus Labofuge 400Thermo Scientific75008371用于 96 孔板的板式离心机
Heraeus Megafuge 16R 离心机ThermoFisher75004270
永生化 ADSCsATCCASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000第 37 代
Invitrogen Countess 3InvitrogenAMQAX2000台盼蓝自动细胞计数仪
Julabo TW20 水浴锅Sigma-AldrichZ615501用于将培养基加热至 37 °C 的水浴锅
Olympus CellSens EntryOlympusVersion 3.2 (23706) 成像软件：数字图像采集
Olympus CKX41OlympusSN9B02019倒置光学显微镜
Olympus SC30 相机OlympusSN57000530连接至倒置光学显微镜的相机
Corning 不透光 96 孔实心聚苯乙烯微孔板Sigma-AldrichCLS3912用于 ATP 发光检测的不透光孔
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333抗生素（0.5%；0.5 mL）
SigmaPlot 12.0Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3Sigma-AldrichTRUE3-1KT10 µL
TrueGel3D 酶法细胞回收溶液Sigma-AldrichTRUEENZ01:20
台盼蓝染色液Thermo Fisher - InvitrogenT102820.4% 溶液
TrypLE Select 酶（1x）Gibco12563029细胞解离溶液
Victor Nivo 酶标仪Perkin ElmerHH3522019094分光光度酶标仪

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