脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

摘要

本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。

摘要

脂肪来源的干细胞（ADSCs）具有类似于干细胞的多能间充质特性，因其能够向多种细胞类型分化，并促进细胞迁移、增殖以及减轻炎症反应，故常被用于再生医学。然而，ADSCs在伤口中的存活和定植常面临挑战，主要原因是局部存在不利的炎症环境。为解决这一问题，已开发出可维持ADSC在伤口中活性的水凝胶，以加速伤口愈合过程。本研究旨在评估光生物调节疗法（PBM）在三维细胞培养体系中对ADSC增殖及细胞毒性的协同影响。将永生化ADSC以2.5 × 10³个细胞的密度接种于10 µL水凝胶中，并使用波长为525 nm和825 nm的二极管光源，以5 J/cm²和10 J/cm²的能量密度进行照射。在PBM处理后24小时和10天分别评估细胞形态变化、细胞毒性和增殖情况。结果显示，ADSC呈现圆形形态，以单个细胞或球状聚集体的形式均匀分布于凝胶中。重要的是，PBM与三维培养体系均未对细胞产生细胞毒性作用，且PBM显著提高了ADSC的增殖速率。综上所述，本研究证实水凝胶可作为ADSC三维培养的适宜环境，并提出PBM是一种有效的增强策略，尤其可缓解三维细胞培养中常见的增殖缓慢问题。

引言

ADSCs 是具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的间充质多能祖细胞。这些细胞可在脂肪抽吸术过程中从脂肪组织的基质血管组分（SVF）中分离获得。¹脂肪源性干细胞（ADSCs）因其来源丰富、获取过程微创、易于获取且特性明确，已成为再生医学中理想的干细胞类型。²干细胞治疗通过促进细胞迁移、增殖和新生血管形成，并减轻伤口内的炎症反应，为伤口愈合提供了一种可能的途径。^3,4大约80%的ADSCs再生能力归因于其分泌组介导的旁分泌信号传导⁵此前有研究提出，将干细胞或生长因子直接局部注射到受损组织中，可引发足够的反应 体内 修复机制^6,7,8然而，这种方法面临若干挑战，例如由于炎症环境导致干细胞在受损组织中的存活率低下以及移植效率降低 ⁹此外，其中一个被提及的原因是缺乏细胞外基质来支持移植细胞的存活与功能¹⁰为应对这些挑战，目前的研究重点已转向开发生物材料载体，以支持干细胞的存活与功能。....

方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息，请参见材料表。本方案已在图1中以图示形式概括。

1. 二维（2D）细胞培养

注意：永生化ADSCs（1×10⁶ 个细胞）保存于含有1 mL细胞冻存液的冻存管中，置于-195.8 °C液氮中。

1. 准备二维细胞复苏培养基和二维培养瓶
   1. 将39 mL基础培养基转移至50 mL离心管中
   2. 向基础培养基中添加20%胎牛血清（FBS；10 mL）和抗生素（1 mL）（0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL两性霉素B）进行富集。
   3. 通过将6 mL细胞复苏培养基转移至T75培养瓶中进行预处理，并在37 °C、5% CO₂和85%湿度条件下孵育45分钟（可在进行细胞复苏操作的同时完成此步骤以节省时间）。
      注意：使用前将完全培养基预热至37 °C，4 °C保存时间最长不超过1周。
2. 二维细胞复苏
   1. 从液氮储存罐中取出一支冻存管，在37 °C水浴中快速解冻，直至完全融化。
   2. 将冻存管在离心机中以1006 × g离心....

结果

为评估水凝胶的形态并直观检查细胞密度，采用倒置显微镜进行观察（图2）。接种并接受PBM照射后24小时，ADSCs仍保持圆形形态。细胞以单细胞或葡萄串样簇状结构分散分布于凝胶中。在三维培养10天后，细胞形态未发生明显改变。实验组与对照组之间，以及不同实验组之间，均未观察到形态学上的显著差异。

为评估光生物调节（PBM）照射及使用水凝胶进行三维培养的细胞毒性效应，检测了乳酸脱氢酶（LDH）的释放量（图3）。在24小时或10天时，实验组与对照组之间均无显著差异，表明PBM照射和水凝胶培养对细胞无不良影响。

通过测定ADSCs的ATP含量来测量细胞增殖速率（图4PBM照射导致所有实验组的细胞增殖率均高于对照组。在PBM照射后24小时，525 nm波长刺激产生的增殖率最高；然而，在照射后10天时，825 nm波长的增殖率优于525 nm波长。.

讨论

脂肪来源干细胞（ADSCs）是再生医学中理想的细胞类型，因其可促进多种过程以辅助伤口愈合^3,4。然而，仍存在若干需要克服的挑战，例如细胞在损伤部位的存活率低以及移植效果不佳⁹。本研究采用永生化细胞作为商业化细胞系，因其相比原代细胞可进行更多代次的传代，无需反复分离获取，且具有明确的特性以及均一的细胞群体，从而确保实验结果的一致性³¹。本研究旨在利用三维细胞培养技术，评估光生物调节（PBM）对ADSCs增殖能力及细胞毒性的增强潜力。根据制造商提供的30 µL水凝胶操作方案，本研究将其调整为10 µL以降低成本³²。然而，体积的减少使得凝胶的制备与操作更为困难。

ADSCs 已被证明可在三维环境中自我聚集³³同样，在本研究中，细胞形成了具有葡萄状外观的细胞聚集体，但也观察到单层细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
525 nm 二极管激光器	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm 二极管激光器	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 孔条板	Sigma-Aldrich	BR782301
两性霉素 B	Sigma-Aldrich	A2942	抗生素（0.5%；0.5 mL）
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	G9681	ATP 试剂，增殖检测试剂盒
Corning 2 mL 外螺纹聚丙烯冻存管	Corning	430659	冻存管
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	细胞冻存培养基
CytoTox96 非放射性细胞毒性检测试剂盒	Promega	G1780	细胞毒性试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	Sigma-Aldrich	D5796	基础培养基（39 mL/44 mL）
FieldMate 激光功率计	Coherent	1098297
Corning 平底 96 孔透明聚苯乙烯板	Sigma-Aldrich	CLS3370
胎牛血清	Biochrom	S0615	培养基添加剂（5 mL；10% / 10 mL；20%）
Hanks 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma-Aldrich	H9394	冲洗液
Heracell 150i CO2 培养箱	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	用于 96 孔板的板式离心机
Heraeus Megafuge 16R 离心机	ThermoFisher	75004270
永生化 ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	第 37 代
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	台盼蓝自动细胞计数仪
Julabo TW20 水浴锅	Sigma-Aldrich	Z615501	用于将培养基加热至 37 °C 的水浴锅
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	成像软件：数字图像采集
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	倒置光学显微镜
Olympus SC30 相机	Olympus	SN57000530	连接至倒置光学显微镜的相机
Corning 不透光 96 孔实心聚苯乙烯微孔板	Sigma-Aldrich	CLS3912	用于 ATP 发光检测的不透光孔
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333	抗生素（0.5%；0.5 mL）
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D 酶法细胞回收溶液	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
台盼蓝染色液	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% 溶液
TrypLE Select 酶（1x）	Gibco	12563029	细胞解离溶液
Victor Nivo 酶标仪	Perkin Elmer	HH3522019094	分光光度酶标仪