斑马鱼鳞片中细胞动态的体外培养技术

摘要

本方案提供了一种利用简单方法研究细胞动态的技术 体外 培养技术。它使斑马鱼研究人员和教育工作者能够通过观察鳞片内荧光标记的细胞核和凋亡细胞，研究与骨稳态及基础细胞生物学相关的细胞过程。

摘要

斑马鱼鳞片在教学和科研的标准实验室中具有多种应用优势。鳞片易于采集，无需实施安乐死，且可在数周内再生；其质地透明且体积微小，可直接使用常规显微镜进行观察。斑马鱼鳞片在教育环境中尤为实用，能够为学生提供独特的动手学习机会，特别有助于理解细胞动态过程 体外 培养方法。本方案的主要目的是介绍一种利用常规实验室设备收集和体外维持斑马鱼鳞片的方法，以用于多种生物学研究。此外，本方案详细描述了如何通过检测参与骨吸收和骨形成过程的骨细胞活性，来研究骨稳态。方案还包括一些通用技术的附加实验流程，例如细胞核和凋亡细胞的可视化。 体外 培养方案以最少的试剂和设备获得可靠结果。本文讨论了使用该方法的优势 体外 斑马鱼鳞片培养以促进科学探究，并概述了支持其在教育环境中整合所需的资源。

引言

近年来，斑马鱼（Danio rerio）已成为遗传学、发育生物学和毒理学等多个科学领域中一种重要的模式生物^1,2,3。斑马鱼是一种原产于东南亚河流的小型热带淡水鱼⁴。由于其易于饲养、体型小、繁殖周期短且胚胎透明，斑马鱼已成为生物学研究中广受欢迎的模式生物¹。这些特性使其内部发育过程易于观察，因而非常适合用于研究发育生物学中的多种生物学过程。斑马鱼在遗传上与人类具有相似性；大约70%的人类基因至少有一个对应的斑马鱼基因，这使其成为研究人类遗传性疾病和疾病的理想模型^5,6。通过操控斑马鱼中的特定基因，研究人员可以获得有关基因功能和行为的宝贵信息，并可将这些发现应用于人类健康研究⁶、基因编辑以及转基因品系的构建^7,8。

斑马鱼鳞片在移除后能够再生^9,....

方案

本文所述所有实验方案均遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）的指导原则，并每年由圣玛丽大学/圣文森特山大学动物护理委员会根据协议编号20-14和21-12批准。在实施本实验方案之前，使用者必须确保遵守联邦和省级关于在科研或教学中使用动物的相关规定²³。本研究中所用试剂和设备的详细信息见《材料表》（Table of Materials）。

1. 规模化培养试剂的制备

1. 配制含 HEPES 的 DMEM 培养基（将 10 g DMEM 粉末和 5.95 g HEPES 溶于 1 L 蒸馏水或 dH₂O 中，pH 值为 6.91），分装后于 4 °C 保存。
2. 配制培养基工作液（88% 含 HEPES 的 DMEM 培养基、10% 胎牛血清和 2% 青霉素-链霉素溶液 [每毫升含 5000 单位青霉素和 5 mg 链霉素]），根据实验当天所需体积进行调整。
   注意：工作液必须每日新鲜配制，不可储存。培养基在使用前须始终保持低温（4 °C 或冰上）。
3. 将培养基工作液分装至实验所用容器中，本实验使用 0.2 mL 离心管或 96 孔板。分装后样品需置于冰上，待用时取出。
   注意：该溶液应新鲜配制，不可储存超过 1 天....

结果

最近，该规模化培养方案被用于研究骨稳态¹¹。鳞片在培养基中至少可存活2天。通过计数标记的细胞，分析培养期间每天（最长至3天）的凋亡细胞数量。结果表明，培养第3天时凋亡细胞数量显著增加，提示采用本方法进行培养时，培养时间应限制在2天以内。

通过比较鳞片的形态和细胞分布，发现鳞片具有对称形状，且细胞呈规则分布，表皮部分的细胞浓度较高¹¹（图 3A–C）。形态测量分析揭示了鳞片大小与细胞数量之间存在直接关系。可使用 DAPI 染色观察细胞核，通过细胞计数评估实验处理的效果。此外，Pasqualetti 等人¹³表明，鳞片环脊中出现的细胞核属于成骨细胞，如图 3F所示。

如本文所述，评估细胞核数量和凋亡细胞数.......

讨论

斑马鱼鳞片是一种易于获取的 体外 用于研究多种不同生物学过程的模型，通过培养方法和培养箱模拟其自然环境，可维持长达2天¹¹鳞片具有规则且成比例分布的细胞，使研究人员能够观察、计数和标记细胞，并使用基本的实验室设备进行简单的细胞生物学实验。此外，整个鳞片在4倍物镜下即可清晰可见，便于在实验过程中对细胞进行测量和定量分析。这一简便易行的方案可用于研究细胞 体外 使得研究人员能够在多种细胞生物学研究中利用斑马鱼鳞片，并通过不同处理来评估细胞。利用野生型或荧光转基因斑马鱼观察鳞片的能力，为进一步拓展学生的细胞生物学培训提供了额外优势。

有许多应用和资源可用于支持斑马鱼研究，例如转基因品系数据库以及CRISPR²⁹等基因编辑方案，更多资源可参见斑马鱼网络网站上列出的内容²⁷。本文所述的实验方案进一步丰富了面向各级学生的教育与研究资源（例如，饲养管理⁴、发育生物学

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 离心管	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	用于pH稳定及PRS的制备
凹面载玻片	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	用于细胞核的可视化
重氮盐（Fast Blue B）	Sigma	D9805	用于AP底物溶液
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）粉末	Sigma	D5523	用于大规模培养的培养基
甲磺酸三卡因（MS222）	Sigma	E10521	用于配制0.1% MS222
胎牛血清	Sigma	F4135	用于大规模培养的培养基
荧光显微镜	n/a	n/a
冰醋酸	Fisher	A38 212	用于醋酸盐缓冲液
甘油	VWR	BDH1172-4LP	80% 甘油储存用比例尺
HEPES	赛默飞世尔科技	15630106	用于大规模培养基培养
加热板	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	PBS 的配制
溶酶体示踪剂	赛默飞世尔科技	L7528	用于溶酶体  可视化
马来酸	Sigma	M0375	Tris-马来酸缓冲液
微量移液器	n/a	n/a
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma	319937	用于AP底物溶液
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma	319937	酶底物溶液配制
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	PBS 的配制
NaCl	Sigma	S9888	PBS 的配制
NaNO2	Sigma	S-2252	对于4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	4% PFA 的配制
NaOH	Sigma	S5881	用于固定比例尺和稳定 pH 值
Napthol-AS-TR-磷酸盐	Sigma	N6125	用于AP底物溶液
Napthol-AS-TR-磷酸盐	Sigma	N6125	酶底物溶液配制
盐酸副品红	Sigma	P3750	对于 PRS
青霉素-链霉素溶液，每毫升含5000单位青霉素和5毫克链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	用于大规模培养的培养基
个人防护装备（PPE）：一次性丁腈手套、护目镜／防溅眼镜和实验服。	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	用于固定比例
乙酸钠	Sigma	S2889	用于乙酸盐缓冲液
标准复式显微镜	n/a	n/a
磁力搅拌器	n/a	n/a
酒石酸	Sigma	T6521	酒石酸盐缓冲液
Tris 碱	罗氏	03 118 142 001	Tris-马来酸缓冲液