斑马鱼鳞片中细胞动态的体外培养技术

摘要

本方案提供了一种利用简单方法研究细胞动态的技术 体外 培养技术。它使斑马鱼研究人员和教育工作者能够通过观察鳞片内荧光标记的细胞核和凋亡细胞，研究与骨稳态及基础细胞生物学相关的细胞过程。

摘要

斑马鱼鳞片在教学和科研的标准实验室中具有多种应用优势。鳞片易于采集，无需实施安乐死，且可在数周内再生；其质地透明且体积微小，可直接使用常规显微镜进行观察。斑马鱼鳞片在教育环境中尤为实用，能够为学生提供独特的动手学习机会，特别有助于理解细胞动态过程 体外 培养方法。本方案的主要目的是介绍一种利用常规实验室设备收集和体外维持斑马鱼鳞片的方法，以用于多种生物学研究。此外，本方案详细描述了如何通过检测参与骨吸收和骨形成过程的骨细胞活性，来研究骨稳态。方案还包括一些通用技术的附加实验流程，例如细胞核和凋亡细胞的可视化。 体外 培养方案以最少的试剂和设备获得可靠结果。本文讨论了使用该方法的优势 体外 斑马鱼鳞片培养以促进科学探究，并概述了支持其在教育环境中整合所需的资源。

引言

近年来，斑马鱼（Danio rerio）已成为遗传学、发育生物学和毒理学等多个科学领域中一种重要的模式生物^1,2,3。斑马鱼是一种原产于东南亚河流的小型热带淡水鱼⁴。由于其易于饲养、体型小、繁殖周期短且胚胎透明，斑马鱼已成为生物学研究中广受欢迎的模式生物¹。这些特性使其内部发育过程易于观察，因而非常适合用于研究发育生物学中的多种生物学过程。斑马鱼在遗传上与人类具有相似性；大约70%的人类基因至少有一个对应的斑马鱼基因，这使其成为研究人类遗传性疾病和疾病的理想模型^5,6。通过操控斑马鱼中的特定基因，研究人员可以获得有关基因功能和行为的宝贵信息，并可将这些发现应用于人类健康研究⁶、基因编辑以及转基因品系的构建^7,8。

斑马鱼鳞片在移除后能够再生^9,10，并且可在基础（非CO₂）培养箱中培养一至三天，用于实验操作¹¹。在基础实验室中使用斑马鱼鳞片具有优势，因为它们可从麻醉的鱼类中取出，而无需实施安乐死。斑马鱼鳞片是真皮骨骼的组成部分，主要由两层构成：内层较厚，由胶原纤维层形成的部分矿化组织构成；外层高度矿化，含有交织成网状的胶原纤维^12,13 （图1A-C）。鳞片的这些形态学和细胞特征可在标准复式显微镜下清晰观察到。这些特性使斑马鱼鳞片成为研究细胞与分子过程的良好模型。例如，斑马鱼鳞片已被用于研究骨稳态，包括骨细胞活性^11,12；也被用于研究组织再生^9,14,15、基因通路与信号传导^14,16、代谢¹⁷、微生物群研究¹⁸等。与其它硬骨鱼类相似，斑马鱼对污染物和毒素等环境因素也极为敏感^19,20,21,22。因此，鱼鳞被用于研究鱼类种群对毒素的暴露情况。这些特性使鳞片成为向学生讲授环境因素对生物体影响的优秀教学模型。此外，来自转基因斑马鱼品系（如 Tg(osterix:mCherry) 和 Tg(runx2a:GFP)）的鳞片可为学生的实验增加更深层次的复杂性。

总之，通过使用斑马鱼鳞片，研究人员可以设计并开展实验，研究生物学的各个方面，从细胞机制到环境变化。斑马鱼在高等教育中也是一种宝贵的资源，因其可为实验设计、数据采集与分析提供实践操作的机会。斑马鱼还可用于高级课程和以研究为导向的项目中，以探索特定的研究领域。本文介绍了一种在科研和课堂教学环境中使用斑马鱼鳞片的实验方案。

方案

本文所述所有实验方案均遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）的指导原则，并每年由圣玛丽大学/圣文森特山大学动物护理委员会根据协议编号20-14和21-12批准。在实施本实验方案之前，使用者必须确保遵守联邦和省级关于在科研或教学中使用动物的相关规定²³。本研究中所用试剂和设备的详细信息见《材料表》（Table of Materials）。

1. 规模化培养试剂的制备

1. 配制含 HEPES 的 DMEM 培养基（将 10 g DMEM 粉末和 5.95 g HEPES 溶于 1 L 蒸馏水或 dH₂O 中，pH 值为 6.91），分装后于 4 °C 保存。
2. 配制培养基工作液（88% 含 HEPES 的 DMEM 培养基、10% 胎牛血清和 2% 青霉素-链霉素溶液 [每毫升含 5000 单位青霉素和 5 mg 链霉素]），根据实验当天所需体积进行调整。
   注意：工作液必须每日新鲜配制，不可储存。培养基在使用前须始终保持低温（4 °C 或冰上）。
3. 将培养基工作液分装至实验所用容器中，本实验使用 0.2 mL 离心管或 96 孔板。分装后样品需置于冰上，待用时取出。
   注意：该溶液应新鲜配制，不可储存超过 1 天。所有试剂信息请参见 表 1。

2. 从活鱼身上去除鱼鳞

1. 准备一个水容量约为 2 L 的容器或水箱，用于饲养 4-5 条成年斑马鱼。
   注意：适合斑马鱼的典型水质参数为 pH 7.5，温度 28.5 °C，电导率 640-781 µS，并保持 12 小时光照与 12 小时黑暗的循环。确保水箱中的温度始终保持恒定。
2. 使用渔网捕获 4-5 条成年斑马鱼，并将其放入上述准备好的斑马鱼暂养水箱中。
3. 准备一个至少含有 60 mL 水的容器，用于对鱼类进行麻醉。
   注意：该容器应足够大，使鱼能够自由活动，并具有足够的深度以防止其跳出。容器中应含有缓冲的 0.01% 三卡因甲磺酸盐（MS222），该溶液由斑马鱼用水配制而成（将用 0.3 g MS222、615 µL 1 M NaOH 溶于 300 mL 斑马鱼用水中配制的 0.1% MS222 溶液稀释十倍得到）。
   警告：进行本实验的人员必须获得机构动物伦理委员会的批准，方可捕获、麻醉和操作斑马鱼。此外，所使用的麻醉剂为低浓度三卡因甲磺酸盐（MS222），这是一种在鱼类生物学中常用的化学物质，但需妥善处理，例如佩戴一次性丁腈手套、护目镜/防溅眼镜及实验服（更多信息请参阅 MS222 的安全数据表）。
4. 准备一个恢复用容器，其规格与步骤 1 中所述相同（至少 2 L 水），用于在去鳞后放置鱼类。该容器应具备足够的空间和上述正确的水质参数。
5. 使用渔网，小心地将一条成年斑马鱼转移至含有 0.01% MS222 的容器中。等待鱼完全不动且鳃盖运动最小（通常少于 10 分钟）。
   注意：整个步骤每次仅处理一条鱼。在当前处理的鱼完成去鳞并已转移至恢复容器之前，不得对下一条鱼进行麻醉。
6. 将成年斑马鱼单独放置在铺有湿润纸巾的倒置培养皿上。
7. 在解剖体视显微镜下，使用精细镊子从单条鱼身上最多取下 10-12 片鳞片。鳞片应从鱼体侧部区域取下，该区域的鳞片较大且尺寸较其他部位更一致（图 2）。鱼体两侧均可取鳞。
   1. 沿鳞片自然方向（即从前向后方向）轻轻拉扯，逐片取下鳞片。此操作应尽可能迅速完成。
8. 将每一片单独的鳞片放入含有鳞片培养基工作液（按步骤 1.1 配制）的独立 0.2 mL 离心管中，以防止鳞片降解。也可使用 96 孔板作为替代方案。
   注意：将单个鳞片分别置于不同的管或孔中，可防止鳞片相互粘连，并便于追踪可能用于多个实验的单个鳞片。
9. 若特定实验需要对鳞片进行处理，可在本步骤中实施。有关具体方案示例，请参见步骤 4 和步骤 5。
10. 将装有鳞片的离心管放入 28 °C 培养箱中。每 24 小时更换一次培养基（使用培养基工作液）。本实验中使用的是非 CO₂ 培养箱。
11. 去鳞后，小心将斑马鱼放回恢复水箱，并持续观察直至其恢复活动。可使用移液管或曝气石向水箱供气，以加快恢复速度。
12. 一旦活动恢复，即将斑马鱼移回常规饲养水箱。请记住，应将已使用过的鱼与其他鱼分开饲养，以便其独立恢复，并追踪哪些鱼正处于鳞片再生阶段。
13. 在对同一批鱼重复进行去鳞操作前，需等待约 2 周时间。这将为其自然再生鳞片提供充足的时间。

3. 鳞片的固定

1. 用 200 µL 由 10x PBS 配制的 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）（配制 1 L 时，加入 80 g NaCl、2 g KCl 和 11.2 g Na₂HPO₄，加入 dH₂O₂O直至1 L。
2. 移除1x PBS，加入200 µL 4%多聚甲醛（PFA），4 °C条件下孵育过夜。配制100 mL PFA溶液：称取4 g多聚甲醛和0.1 g NaOH，加入1x PBS定容至100 mL。将溶液置于低温加热板上搅拌，直至完全溶解澄清，随后冷却至室温，并调节pH至7.4。储存于-20 °C。具体操作细节请参见 补充文件 1 （表1）
3. 固定后，用 200 µL 1x PBS 洗涤鳞片三次。将鳞片置于 4 °C 保存。
   注意：PFA 有害。更多信息请参阅安全数据表。所有操作均需妥善处理，包括使用适当的个人防护装备，如一次性丁腈手套、护目镜/防溅护目镜及实验服。

4. 骨稳态

注意：下文描述了两种骨稳态实验方法。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和碱性磷酸酶（AP）染色通常分别用于鉴定活化的破骨细胞和成骨细胞。破骨细胞负责吸收骨基质，而成骨细胞则负责沉积骨基质。在骨形成过程中，成骨细胞主要释放碱性磷酸酶（AP），而破骨细胞则将TRAP分泌至破骨细胞与骨基质之间的酸性微环境，以协助骨组织的降解与吸收^24,25,26。本实验方案亦可在斑马鱼信息网络（The Zebrafish Information Network）上获取²⁷ ，并已先前发表²⁸。碱性磷酸酶是多种细胞类型在代谢过程中均可产生的酶。该酶并非成骨细胞所特有，但在骨组织中，常被用作评估成骨细胞功能的标志物。

1. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
   1. 将每个固定的鳞片放入含有 200 µL dH₂O 的 0.2 mL 管或 96 孔板中。通过加入和吸出约 150 µL 的 dH₂O，每次 15 分钟，清洗鳞片三次。具体细节请参见 补充文件 1（表 2）。
   2. 将鳞片从 0.2 mL 管或孔中取出，放入含有 200 µL 50 mM 酒石酸缓冲液的新管中。在室温下孵育 1 小时。
      1. 配制 100 mM 酒石酸缓冲液时，准备一个玻璃容器，加入 2.3 g 酒石酸，并用 0.2 M 醋酸盐缓冲液（pH 5.5）定容至 100 mL，充分搅拌后于 4 °C 保存。配制 50 mM 酒石酸缓冲液时，将等体积的 dH₂O 与 100 mM 酒石酸缓冲液混合。具体细节请参见 补充文件 1（表 3 和表 4）。
   3. 从管中移除酒石酸缓冲液，加入 200 µL TRAP 底物溶液。在室温下避光孵育样品 1 小时。
      1. 准备一个避光的玻璃容器，加入 30 mL 100 mM 酒石酸缓冲液、1 mL 偶氮化 PRS（对品红盐酸盐溶液）和 2 mL 酶底物溶液，充分搅拌。
         注：该溶液不可储存，使用时需避光并置于室温。有关配制 TRAP 底物溶液所需的溶液，请参见 补充文件 1（表 5–9）。
   4. 移除 TRAP 底物溶液，通过加入和吸出约 150 µL 的 dH₂O，每次 15 分钟，清洗鳞片三次。
   5. 将鳞片从管中取出，放入含有 200 µL 80% 甘油（每 100 mL 中含 80 mL 甘油和 20 mL dH₂O）的新管或孔中，并用铝箔包裹以防止褪色，于 4 °C 保存。
   6. 在显微镜下观察鳞片时，使用凹面载玻片。
2. 碱性磷酸酶（AP）染色
   1. 将每个固定的鳞片放入含有 200 µL dH₂O 的 0.2 mL 管或 96 孔板中，通过加入和吸出约 150 µL 的 dH₂O，每次 15 分钟，清洗三次。具体细节请参见 补充文件 1（表 2）。
   2. 将鳞片从 0.2 mL 管或孔中取出，放入含有 200 µL 三羟甲基氨基甲烷-马来酸（tris-maleate）缓冲液的新管中，在室温下孵育 1 小时。
      1. 配制该缓冲液时，准备一个玻璃容器，加入 0.605 g 三羟甲基氨基甲烷（tris）缓冲剂和 0.55 g 马来酸，加 dH₂O 至 25 mL，充分搅拌，调节 pH 至 8.3，于 4 °C 保存。具体细节请参见 补充文件 1（表 10）。
   3. 从管中移除 tris-maleate 缓冲液，加入 200 µL AP 底物溶液，在室温下避光孵育 1 小时。
      1. 配制该溶液时，准备一个避光的玻璃容器，加入 8 mg 重氮盐，与 0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺中的萘酚-AS-TR-磷酸盐混合，再加入 10 mL tris-maleate 缓冲液（pH 8.3），充分搅拌。该溶液需现配现用。具体细节请参见补充文件 1（表 11）。
   4. 移除 AP 底物溶液，通过加入和吸出 200 µL 的 dH₂O，每次 15 分钟，清洗鳞片三次。
   5. 将鳞片从管中取出，放入含有 200 µL 80% 甘油并用铝箔包裹的新管或孔中，以防止褪色，于 4 °C 保存。
   6. 在显微镜下观察鳞片时，将鳞片置于凹面或凹槽载玻片上。
      注意：TRAP 和 AP 染色中使用的大多数试剂可能有害。请查阅每种化学品的安全数据表。所有操作均需规范处理，包括佩戴合适的一次性丁腈手套、护目镜/防溅护目镜以及实验服。

5. 斑马鱼鳞片中细胞动态的可视化

注意：可采用多种染色方法来显示鳞片之间的差异，并对鳞片内的细胞进行标记（图3B）。例如，以下列出了对鳞片细胞内的细胞核和溶酶体进行染色的方法。

1. 用于细胞核可视化的 DAPI 染色
   注意：DAPI 通过标记 DNA 来显示所有细胞的细胞核。DAPI 是一种荧光标记物，可强烈结合 DNA 序列中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的区域。
   1. 使用 DAPI 前，确保鳞片已在 4% 多聚甲醛中固定（步骤 3）。固定后用 200 µL 1× PBS 洗涤鳞片 5 分钟。
   2. 按 1:10 的稀释比例配制 DAPI 工作液：将 1 µL DAPI 与 9 µL 1× PBS 混合，总体积为 10 µL。
   3. 配制好 DAPI 溶液后，用镊子或塑料移液器将鳞片置于凹面载玻片上，吸去多余的 PBS，并加入约 10 µL 配制好的 DAPI 溶液。
      注意：DAPI 会立即对鳞片进行染色，因此可使用激发波长为 352–402 nm、发射波长为 417–477 nm 的荧光显微镜观察。DAPI 将所有细胞核染成亮蓝色。为在视野中观察整个鳞片，使用 4× 物镜；单个染色的细胞核可通过 20× 物镜观察。
   4. 计数经 DAPI 染色的细胞核数量，以确定鳞片中的细胞数量。
2. 用于活体样本中细胞死亡可视化的凋亡染色
   注意：可使用荧光染料标记凋亡细胞。例如，此处使用的荧光标记方案针对酸性环境，可用于标记和追踪溶酶体等酸性细胞器。这些细胞器数量的增加与细胞死亡程度升高相关。该染色应施用于未固定的鳞片，鳞片可为新鲜取下或体外培养不超过 2 天的样本。
   1. 根据生产商说明书，使用培养基作为稀释液配制用于凋亡追踪的荧光染色溶液。
      注意：荧光染料的浓度可能因所用凋亡检测方法的不同而显著变化。有关推荐浓度的具体信息，请参考所选染料的商业试剂盒说明书。
   2. 若鳞片此前经过培养，小心移除每个 0.2 mL 管或 96 孔板中各孔的培养基。
   3. 加入足量荧光染色液以完全覆盖整个鳞片（约 50 µL）。
   4. 用铝箔包裹所有管或孔，避免荧光褪色，室温孵育 30 分钟。
   5. 移除管或孔中的荧光染色液。
   6. 向管或孔中加入 200 µL 1× PBS，洗涤 5 分钟。
   7. 吸去 PBS，向管或孔中加入 200 µL 4% 多聚甲醛，在室温下固定样本 1 小时。
   8. 向管或孔中加入 200 µL 1× PBS，洗涤 5 分钟。
   9. 将鳞片转移至新的 0.2 mL 管或孔中，加入 200 µL 新鲜 1× PBS，并用铝箔覆盖管或孔以避免荧光褪色。于 4 °C 保存。
   10. 使用凹面载玻片和合适的滤光片在荧光显微镜下观察鳞片。此处使用的荧光信号激发和发射最大值为 577–590 nm。荧光染料将含有溶酶体的凋亡细胞染成红色。
   11. 计数染色细胞的数量，以确定发生凋亡的细胞数量。
       注意：染色和储存过程中使用铝箔以防止荧光褪色。样本可在避光条件下保存数小时甚至数天，具体时长取决于所用荧光染料。若需长期保存荧光样本，应采用与所用荧光染料兼容的固定和封片方案。所有荧光染色均使用荧光显微镜观察，放大倍数至少为 20×。所用滤光片如下：DAPI 为 417–477 nm；凋亡追踪为 577–590 nm。

结果

最近，该规模化培养方案被用于研究骨稳态¹¹。鳞片在培养基中至少可存活2天。通过计数标记细胞，分析了培养期间每天（最长至3天）的凋亡细胞数量。结果显示，培养第3天时凋亡细胞数量显著增加，表明使用本方法时，培养时间应限制在2天以内。

通过比较鳞片的形态和细胞分布，结果表明鳞片具有对称形状，且细胞呈规则分布，表皮部分的细胞浓度较高¹¹（图3A-C）。形态计量学分析揭示了鳞片大小与细胞数量之间存在直接关系。DAPI可用于观察细胞核，通过计数细胞可评估实验处理的效果。此外，Pasqualetti 等人¹³表明，鳞片环脊中出现的细胞核为成骨细胞，如图3F所示。

如文中所述，评估细胞核数量以及凋亡细胞数量可为细胞更...

讨论

斑马鱼鳞片是一种易于获取的 体外 用于研究多种不同生物学过程的模型，通过培养方法和培养箱模拟其自然环境，可维持长达2天¹¹鳞片具有规则且成比例分布的细胞，使研究人员能够观察、计数和标记细胞，并使用基本的实验室设备进行简单的细胞生物学实验。此外，整个鳞片在4倍物镜下即可清晰可见，便于在实验过程中对细胞进行测量和定量分析。这一简便易行的方案可用于研究细胞 体外 使得研究人员能够在多种细胞生物学研究中利用斑马鱼鳞片，并通过不同处理来评估细胞。利用野生型或荧光转基因斑马鱼观察鳞片的能力，为进一步拓展学生的细胞生物学培训提供了额外优势。

有许多应用和资源可用于支持斑马鱼研究，例如转基因品系数据库以及CRISPR²⁹等基因编辑方案，更多资源可参见斑马鱼网络网站上列出的内容²⁷。本文所述的实验方案进一步丰富了面向各级学生的教育与研究资源（例如，饲养管理⁴、发育生物学

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 离心管	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	用于pH稳定及PRS的制备
凹面载玻片	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	用于细胞核的可视化
重氮盐（Fast Blue B）	Sigma	D9805	用于AP底物溶液
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）粉末	Sigma	D5523	用于大规模培养的培养基
甲磺酸三卡因（MS222）	Sigma	E10521	用于配制0.1% MS222
胎牛血清	Sigma	F4135	用于大规模培养的培养基
荧光显微镜	n/a	n/a
冰醋酸	Fisher	A38 212	用于醋酸盐缓冲液
甘油	VWR	BDH1172-4LP	80% 甘油储存用比例尺
HEPES	赛默飞世尔科技	15630106	用于大规模培养基培养
加热板	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	PBS 的配制
溶酶体示踪剂	赛默飞世尔科技	L7528	用于溶酶体  可视化
马来酸	Sigma	M0375	Tris-马来酸缓冲液
微量移液器	n/a	n/a
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma	319937	用于AP底物溶液
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma	319937	酶底物溶液配制
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	PBS 的配制
NaCl	Sigma	S9888	PBS 的配制
NaNO2	Sigma	S-2252	对于4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	4% PFA 的配制
NaOH	Sigma	S5881	用于固定比例尺和稳定 pH 值
Napthol-AS-TR-磷酸盐	Sigma	N6125	用于AP底物溶液
Napthol-AS-TR-磷酸盐	Sigma	N6125	酶底物溶液配制
盐酸副品红	Sigma	P3750	对于 PRS
青霉素-链霉素溶液，每毫升含5000单位青霉素和5毫克链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	用于大规模培养的培养基
个人防护装备（PPE）：一次性丁腈手套、护目镜／防溅眼镜和实验服。	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	用于固定比例
乙酸钠	Sigma	S2889	用于乙酸盐缓冲液
标准复式显微镜	n/a	n/a
磁力搅拌器	n/a	n/a
酒石酸	Sigma	T6521	酒石酸盐缓冲液
Tris 碱	罗氏	03 118 142 001	Tris-马来酸缓冲液