本方案描述了用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统。该方案概述了在不同微区室中的关键步骤及代表性结果，旨在为合成细胞研究领域的各类实验室建立最佳实践，推动合成细胞研发的进展。
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摘要
摘要
无细胞蛋白合成（CFPS）系统已被广泛用于促进合成细胞的自下而上组装。该系统作为中心法则核心分子机制的载体，是整合与构建多种人工细胞模拟系统理想的底盘平台。尽管CFPS系统在合成细胞构建中应用频繁，但针对特定应用建立定制化且稳健的CFPS系统仍是一项具有挑战性的任务。在本方法学论文中，我们提供了一套全面的CFPS系统操作流程，该流程常规用于合成细胞的构建。本方案涵盖了CFPS系统制备的关键步骤，包括细胞提取物制备、模板准备，以及利用荧光报告蛋白进行常规表达优化。此外，我们展示了将CFPS系统封装于多种微区室中的代表性结果，例如单层液滴、双重乳化囊泡，以及支撑脂双层表面的微腔室。最后，我们阐明了在不同环境中成功组装这些CFPS系统所必需的关键步骤与条件。我们期望本方法能够促进不断扩大的合成细胞研究领域内各实验室建立良好的工作规范，从而加快合成细胞发展的研究进程。
引言
合成细胞或人工细胞的构建已成为一个高度突出的跨学科研究领域，吸引了来自合成生物学、化学和生物物理学领域的科学家们的广泛关注。这些科学家共同致力于构建一种最简生命细胞1,2,3。该领域的快速发展伴随着关键技术的重大进步，例如重组DNA操作技术4、仿生材料5以及用于区室化的微加工技术6，其中包括无细胞蛋白合成（CFPS）方法7。CFPS系统包含了转录和翻译所需的基本细胞机制，为多功能人工细胞的开发与集成提供了基础框架。
尽管无细胞蛋白表达（CFPS）技术常被用于合成细胞的构建，但开发一种稳定且定制化的CFPS系统以组装多种合成细胞体系仍是一项复杂的挑战。目前已有多种CFPS系统可供使用，这些系统来源于原核和真核模式生物8，各自针对合成细胞合成中的特定应用进行了专门优化。除了在转录和翻译中的核心作用外，CFPS系统在其主要组分及相关制备流程上也存在差异。这些差异包括细胞提取物、RNA聚合酶、模板制备方法以及缓冲液组成的不同，主要源于各研究团队为实现蛋白质产量最大....
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方案
1. 提取物制备
- 从甘油菌种中将 E. coli BL21 (DE3) 菌株划线接种至LB（Luria Bertani）琼脂平板，于37 °C 培养至少15小时。
- 从新鲜制备的LB平板上挑取单菌落，接种至装有50 mL LB培养基的三角瓶中，制备过夜预培养物。
- 将5 mL预培养物接种至装有500 mL 2xYTPG培养基的3 L挡板三角瓶中，在37 °C下剧烈振荡培养（转速介于220 rpm至250 rpm之间），当菌液达到对数中期（OD600 ~ 3）时收获菌体。随后将菌液置于冰水混合物中冷却10分钟，于4 °C下以8,000 × g离心15分钟。
注：在此步骤中，根据特定应用需求，2xYTPG培养基中的葡萄糖可省略9,12。 - 将所得菌体沉淀用35 mL预冷的S30缓冲液A重悬，随后于4 °C下以8,000 × g离心15分钟，弃去上清液。
- 重复步骤1.4两次。
注：若不立即使用，菌体沉淀可在-80 °C下保存。 - 将最终菌体沉淀用S30缓冲液B重悬（例如，每1 g菌体沉淀使用1.1 mL S30缓冲液B），并通过French Press在17,000 ps....
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结果
对于每一批新的细胞提取物和T7 RNA聚合酶，建议对Mg2+和K+浓度进行基础筛选，以确保CFPS系统的最佳性能。在不同条件下，超折叠GFP的荧光可作为CFPS系统总体产量的指标，如图1A、B所示。此外，图1C展示了CFPS系统在不同区室中的平行产量比较，表明封装的CFPS系统具有稳定的性能，尽管在GUVs中产量略有下降，可能受到蔗糖的影响46。此外，CFPS反应已成功封装于液滴（图2）、GUVs（图3）以及SLBs表面（图4）。
图2A 高亮显示乳液滴的形成，当油溶液变得湍急时可明显观察到。使用共聚焦激.......
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讨论
本手稿概述了一种改良的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，旨在用于合成细胞平台中的多种微区室，包括油包水液滴、大单层囊泡（GUVs）和固相支持脂双层（SLBs）。我们采用标准的大肠杆菌（E. coli）重组蛋白表达宿主菌株BL21(DE3)作为构建以蛋白质为核心的合成细胞系统的提取物来源。该方法在不同区室中实现了约0.5 mg/mL的蛋白质产量。尽管可使用其他定制的提取物来源菌株，但这些系统主要针对特定类型的蛋白质或代谢活性进行了优化，可能不适用于通用的蛋白质表达。近年来，定量质谱分析技术的进步推动了对细胞裂解液进行蛋白质组学分析的初步研究48,49，特别是在不同制备条件下。
尽管这些研究提供了重要见解，但在已鉴定的蛋白质因子与无细胞蛋白表达系统（CFPS）整体性能之间建立定量相关性仍然具有挑战性。这一空白使得如何对特定批次提取物的性能进行定量评估的问题仍未得到解答。此外，目前尚未见对不同来源菌株进行系统性平行比较的报道。在本研究中，我们采用2xY.......
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文报道工作的个人关系。
致谢
M. Y. 感谢研究生研究基金的资助 &中国江苏省研究生实践创新计划项目（项目编号：KYCX22_2803）。L.K. 感谢中国江苏省高校自然科学研究项目（项目编号：17KJB180003）、中国江苏师范大学自然科学基金（项目编号：17XLR037）、中国江苏省高校优势学科建设工程项目以及中国江苏省特聘教授项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn二油酰基-甘油-3-磷胆碱（DOPC） | Avanti | 850375P | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐）（DOPS） | Avanti | 840035P | |
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC） | Avanti | 850457P | |
| 3,5-环磷酸腺苷（cAMP） | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| 50 mL 离心管 | Eppendorf | Eppendorf离心管 BioBased | |
| 50% 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| 乙酸盐 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 琼脂粉 | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| 丙氨酸 | Sigma-Aldrich | A4349 | |
| Amicon 搅拌式超滤池 | 默克密理博 | UFSC05001 | |
| 乙酸铵（NH4OAc） | Sigma-Aldrich | A7262 | |
| 精氨酸 | Sigma-Aldrich | A4474 | |
| 天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | A0884 | |
| 天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A5474 | |
| ATP | 罗氏 | 11140965001 | |
| Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
| Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
| 带导流板的锥形瓶 | 兽牛 | 250 mL，1000 mL | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 罗氏 | 10711454001 | |
| 离心管 | Eppendorf | Eppendorf 离心管 3810X | |
| 离心管架 | Eppendorf | 0030119819 | |
| 化学发光与落射荧光成像系统 | Uvitec | Alliance Q9 Advanced | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（LSM） | ZEISS | LSM 780 | |
| Countess 细胞计数板载玻片 | 赛默飞世尔科技 | C10283 | |
| 盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
| 肌酸激酶（CK） | 罗氏 | 10127566001 | |
| 磷酸肌酸（CP） | Sigma-Aldrich | 10621714001 | |
| 培养皿 | 环球 | 90 mm | |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C5360 | |
| 胞苷5'-三磷酸二钠盐（CTP） | aladdin | C101487 | |
| 透析膜 | 光谱 | 标准RC透析管截留分子量：12-14 kD | |
| E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒 | Omega Bio-Tek | D6492-01 | |
| 电加热恒温培养箱 | Yiheng仪器 | DHP-9602 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Biosharp | 1100027 | |
| 荧光酶标仪 | BioTek | Synergy 2 | |
| 氟化油 | 苏州中芯科学仪器 | 2%HFE7500 | |
| 亚叶酸 | Sigma-Aldrich | 47612 | |
| 法国压滤器 | G.Heinemann | HTU-DIGI-Press | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G5667 | |
| 谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G5792 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| 三磷酸鸟苷钠盐水合物（GTP） | 罗氏 | 10106399001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
| 组氨酸 | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| 异亮氨酸 | Sigma-Aldrich | I5281 | |
| 异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L6914 | |
| 溶菌素 | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| 四水合乙酸镁（Mg(OAc)2 ) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 氯化镁(MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| 甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | M8439 | |
| 微型离心机 | Eppendorf | 5424 R | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 1645050 | |
| 多功能离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 核酸 &核酸与蛋白质紫外检测测量 | IMPLEN | NanoPhotometer N60 | |
| 用于转染级质粒DNA的NucleoBond Xtra Maxi试剂盒 | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
| Nunc-Immuno MicroWell 96 孔聚苯乙烯板 | Sigma-Aldrich | P8616 | |
| PCR热循环仪 | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
| 蛋白胨 | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| 苯丙氨酸 | Sigma-Aldrich | P8740 | |
| 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） | GLPBIO | GC44635 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | PMSF-RO | |
| 聚乙二醇 8000（PEG 8000） | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| 乙酸钾（KOAc） | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| 氯化钾(KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 谷氨酸钾（K-glutamate） | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 氢氧化钾（KOH） | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| 脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P8865 | |
| 丙酮酸激酶（PK） | Sigma-Aldrich | P9136 | |
| 丝氨酸 | Sigma-Aldrich | S4311 | |
| 振动器 | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
| 氯化钠(NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 氢氧化钠(NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 蔗糖 | 阿拉丁 | S112226 | |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| 注射器滤器 | Jinteng | 0.45 μm | |
| 试管 | 兽牛 | 20 mL | |
| TGX FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12% | 伯乐（Bio-Rad） | #1610175 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| 苏氨酸 | Sigma-Aldrich | T8441 | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| tRNA | 罗氏 | 10109550001 | |
| 胰蛋白胨 | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| 色氨酸 | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| 酪氨酸 | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| 三磷酸尿苷三钠盐（UTP） | 阿拉丁 | U100365 | |
| 带循环水系统的真空泵 | 郑州长城科工贸有限公司 | SHB-<图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/66626/66626eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/> | |
| 瓦林 | Sigma-Aldrich | V4638 | |
| 涡旋混合器 | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
| 水纯化系统 | 默克密理博 | 直接超纯水（1型） | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | 444203 |
参考文献
- Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like art....
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