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方法文章

无细胞蛋白质合成系统用于构建合成细胞

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⸱

DOI：

10.3791/66626

⸱

2024年4月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统。该方案概述了在不同微区室中的关键步骤及代表性结果，旨在为合成细胞研究领域的各类实验室建立最佳实践，推动合成细胞研发的进展。

摘要

无细胞蛋白合成（CFPS）系统已被广泛用于促进合成细胞的自下而上组装。该系统作为中心法则核心分子机制的载体，是整合与构建多种人工细胞模拟系统理想的底盘平台。尽管CFPS系统在合成细胞构建中应用频繁，但针对特定应用建立定制化且稳健的CFPS系统仍是一项具有挑战性的任务。在本方法学论文中，我们提供了一套全面的CFPS系统操作流程，该流程常规用于合成细胞的构建。本方案涵盖了CFPS系统制备的关键步骤，包括细胞提取物制备、模板准备，以及利用荧光报告蛋白进行常规表达优化。此外，我们展示了将CFPS系统封装于多种微区室中的代表性结果，例如单层液滴、双重乳化囊泡，以及支撑脂双层表面的微腔室。最后，我们阐明了在不同环境中成功组装这些CFPS系统所必需的关键步骤与条件。我们期望本方法能够促进不断扩大的合成细胞研究领域内各实验室建立良好的工作规范，从而加快合成细胞发展的研究进程。

引言

合成细胞或人工细胞的构建已成为一个高度突出的跨学科研究领域，吸引了来自合成生物学、化学和生物物理学领域的科学家们的广泛关注。这些科学家共同致力于构建一种最简生命细胞1,2,3。该领域的快速发展伴随着关键技术的重大进步，例如重组DNA操作技术4、仿生材料5以及用于区室化的微加工技术6，其中包括无细胞蛋白合成（CFPS）方法7。CFPS系统包含了转录和翻译所需的基本细胞机制，为多功能人工细胞的开发与集成提供了基础框架。

尽管无细胞蛋白表达（CFPS）技术常被用于合成细胞的构建，但开发一种稳定且定制化的CFPS系统以组装多种合成细胞体系仍是一项复杂的挑战。目前已有多种CFPS系统可供使用，这些系统来源于原核和真核模式生物8，各自针对合成细胞合成中的特定应用进行了专门优化。除了在转录和翻译中的核心作用外，CFPS系统在其主要组分及相关制备流程上也存在差异。这些差异包括细胞提取物、RNA聚合酶、模板制备方法以及缓冲液组成的不同，主要源于各研究团队为实现蛋白质产量最大化而采取的不同开发路径。

在无细胞蛋白表达系统（CFPS）的各个组分中，细胞提取物是转录和翻译所需的关键酶源，因而也是决定CFPS性能的关键因素9. 大肠杆菌 (E. coli)-基于大肠杆菌的CFPS系统因其作为最被深入理解的原核生物而成为最常用的体系。此外，一种完全重建的CFPS系统，由分别纯化的蛋白质和核糖体组成，称为PURE10，已由上田研究组开发，特别适用于需要清晰背景的应用。如今，甚至 E. coli基于细胞的无细胞蛋白合成系统已日趋多样化，尤其是在提取这些系统的菌株来源方面11 和制备方法12,13RNA聚合酶14,15能源16,17和缓冲系统18,19最常用的菌株包括K12和B株的衍生菌株，例如A1920JM10921，BL21（DE3）22，以及 Rossetta223，以及它们的基因改造对应物。

最初，选择RNase和蛋白酶活性降低的E. coli菌株，以增强mRNA的稳定性以及新合成重组蛋白的稳定性，从而提高最终的蛋白产量24。随后，开发了可实现特定翻译后修饰的E. coli提取物，包括糖基化25、磷酸化26和脂化修饰27，以实现上述翻译后修饰。此外，已加入多种添加剂，如分子伴侣28和化学稳定剂，以促进目标蛋白的正确折叠，推动了无细胞蛋白合成（CFPS）系统的多样化发展。转录过程主要采用具有高持续合成能力的噬菌体T7 RNA聚合酶，尽管SP629等其他聚合酶也已被使用。E. coli内源性RNA聚合酶已被改造，用于基于σ因子的遗传回路原型设计30。最后，多种能量前体31,32,33以及不同的盐类和缓冲液组分19,34,35已得到系统优化，以提高生产效率。

除了无细胞蛋白表达系统（CFPS）本身之外，封装方法以及区室化材料对于成功构建合成细胞也至关重要。目前已开发出多种能够成功包封CFPS反应体系的系统，包括表面活性剂稳定的水/油液滴、脂质/聚合物及其杂合的单层囊泡（直径范围从50 nm到数个μm），以及平面支撑的脂双层。然而，由于CFPS系统含有复杂的分子成分，其封装成功率取决于具体情形，尤其是囊泡的形成。为了提高CFPS封装的成功率和效率，已开发出多种微流控芯片以促进液滴和囊泡的形成36。尽管如此，仍需建立额外的芯片和装置。

本方案详细阐述了一种 E. coli 利用BL21(DE3)菌株的无细胞蛋白表达系统，该菌株是重组蛋白生产中常用的宿主。本方案详细阐述了细胞提取物制备、模板制备以及利用荧光报告蛋白进行标准表达优化的步骤。此外，我们展示了将该无细胞蛋白表达系统封装于多种微区室中所获得的代表性结果，包括单层液滴、双乳液囊泡以及位于支撑脂双层上的微腔室。最后，我们深入探讨了在不同环境条件下成功构建这些无细胞蛋白表达系统所必需的关键操作步骤和必要条件。

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方案

1. 提取物制备

  1. 从甘油菌种中将 E. coli BL21 (DE3) 菌株划线接种至LB（Luria Bertani）琼脂平板，于37 °C 培养至少15小时。
  2. 从新鲜制备的LB平板上挑取单菌落，接种至装有50 mL LB培养基的三角瓶中，制备过夜预培养物。
  3. 将5 mL预培养物接种至装有500 mL 2xYTPG培养基的3 L挡板三角瓶中，在37 °C下剧烈振荡培养（转速介于220 rpm至250 rpm之间），当菌液达到对数中期（OD600 ~ 3）时收获菌体。随后将菌液置于冰水混合物中冷却10分钟，于4 °C下以8,000 × g离心15分钟。
    注：在此步骤中，根据特定应用需求，2xYTPG培养基中的葡萄糖可省略9,12。
  4. 将所得菌体沉淀用35 mL预冷的S30缓冲液A重悬，随后于4 °C下以8,000 × g离心15分钟，弃去上清液。
  5. 重复步骤1.4两次。
    注：若不立即使用，菌体沉淀可在-80 °C下保存。
  6. 将最终菌体沉淀用S30缓冲液B重悬（例如，每1 g菌体沉淀使用1.1 mL S30缓冲液B），并通过French Press在17,000 psi压力下进行一次细胞破碎。
    1. 使用French Press时，请参照用户手册，将细胞悬液转移至金属破碎室，确保所有组件已正确组装，且破碎室底部阀门处于关闭状态。
    2. 将组装好的破碎室置于液压平台上，并锁紧安全装置。
    3. 开启液压泵，开始破碎过程。
    4. 调节出口阀门，使细胞悬液通过出口管逐滴流入新的50 mL离心管中。调节流速以确保高效破碎，理想情况下为逐滴流出。保持压力高于15,000 psi的下限值。
  7. 将所得裂解液于4 °C下以30,000 × g离心30分钟，收集上清液。重复离心一次，再次收集上清液。向收集的上清液中加入0.3倍体积的预孵育缓冲液，并在37 °C下轻柔振荡孵育80分钟。
    注：尽管已有报道表明，不加预孵育缓冲液的“空孵育”步骤也可提高效率37,38，但使用预孵育缓冲液通常可提高最终产率，具体效果取决于相应的菌株来源。
  8. 将所得孵育混合物在4 °C下用2 L S30缓冲液C透析2小时，更换一次透析液（2 L新鲜S30缓冲液C），继续透析过夜39。
    注：过夜透析的第二步可缩短至约3小时。
  9. 收集透析后的样品，于4 °C下以30,000 × g离心30分钟，收集上清液，分装至适当体积后立即在液氮中速冻。
    注：冷冻样品可在-80 °C下保存至少6个月至1年，且不会显著损失活性。

2. T7 RNA 聚合酶

  1. 将 pAR1219 质粒转化至 BL21(DE3) star E. coli 感受态细胞中40。
  2. 将 10 mL 过夜培养物接种至 1 L LB 培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中，于 37 °C 培养至 OD600 达到 0.6–0.8。
  3. 加入终浓度为 1 mM 的 IPTG 开始诱导，继续诱导 5 小时，随后在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 15 分钟收集菌体。细胞沉淀可于 -80 °C 保存数周。
  4. 用 30 mL T7 缓冲液 A 重悬细胞沉淀，并通过法国压菌器在 15,000 psi 条件下压碎细胞一次。在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 30 分钟去除细胞碎片。
  5. 将上一步所得上清液置于冰上，逐滴加入硫酸链霉素，使终浓度达到 4%（w/v）。短暂冰浴后，在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 30 分钟。
  6. 将上清液经 0.45 µm 滤膜过滤后，使用自动液相色谱系统加载至已用 10 倍柱体积 T7 缓冲液 B 预平衡的强阴离子交换柱（柱体积为 40 mL）中。
  7. 用 50 倍柱体积的 T7 缓冲液 B 洗脱上样后的色谱柱，并以低盐（50 mM NaCl）和高盐（500 mM NaCl）T7 缓冲液 C 的混合液进行洗脱，建立从 50 至 500 mM NaCl 的线性浓度梯度，流速约为 3 mL/min41。
  8. 收集洗脱峰组分，并通过 SDS-PAGE 分析。
    注：T7 聚合酶在 SDS-PAGE 凝胶上表现为约 100 kDa 的主条带，但仍可见大量杂质蛋白。
  9. 合并含有 T7 聚合酶的组分，并在 2 L T7 缓冲液 C 中透析过夜。
  10. 加入甘油使其终浓度达到 10%，然后通过超滤将溶液浓缩至终浓度为 3–4 mg/mL42。
    注：若在浓缩过程中出现沉淀，应立即停止操作，并通过离心去除沉淀物。
  11. 将甘油浓度调整至 50%。分装后用液氮速冻样品，并于 −80 °C 长期保存。
    注：少量分装样品也可在 -20 °C 保存至少 1 个月而不损失活性。

3. 缓冲液的配制

  1. 使用前一天按照表1所示配制缓冲液。

4. 模板设计与制备

  1. 将目的基因克隆至基于T7启动子的载体中，或扩增含有目的基因的线性PCR产物。
    注意：设计原则详见讨论部分。
  2. 使用质粒提取试剂盒从过夜培养物中提取质粒。
    建议：选择包含异丙醇沉淀步骤并随后用70%乙醇洗涤的质粒提取试剂盒。
  3. 根据微量分光光度计测定结果，将干燥的DNA溶解于少量超纯水中，浓度控制在200 µg/mL至500 µg/mL之间。
  4. 可选：直接从线性PCR产物表达蛋白。
    注意：此情况下需要进行PCR产物纯化步骤。

5. Mg2+ 和 K+ 的优化

  1. 根据表2中所示的条件配制用于 Mg2+ 浓度筛选的主混合液，或根据表3中所示的条件配制用于 K+ 浓度筛选的主混合液。
  2. 将主混合液转移至各个微量离心管或V型96孔板中。
  3. 用移液器将准确体积的 Mg2+ 或 K+ 储备溶液加入各个微量离心管或V型96孔板中，并用超纯水补足体积以完成CFPS反应。将反应体系在37 °C下孵育至少2小时。
    注意：若使用V型96孔板，需用塑料封板膜密封以防止蒸发。
  4. 取2 µL反应混合物转移至黑色96孔板中，使用酶标仪进行荧光检测。
    注意：我们使用的荧光酶标仪参数设置如下：激发/发射波长：485/528 nm，增益：50，读板高度：7.00 mm。然而，使用者需根据所用的纯化荧光蛋白建立特定的校准曲线，以优化仪器参数。

6. 包封

  1. 液滴
    1. 制备含表面活性剂的氟化油（2% PFPE-PEG 溶于 HFE7500）或通过将脂质溶解于矿物油中制备脂质-矿物油溶液（参见步骤 6.2.1）
    2. 通过混合试剂2-18，配制总体积为100 µL的CFPS反应体系 表4将CFPS反应液加入至1.5 mL离心管中已预置的500 µL油相中，用力在试管架上振荡50次，以形成细小的（水包油）液滴。于30 °C孵育该离心管以进行反应。
      注意：简单的微流控芯片也可用于生成均一的液滴43.
  2. 巨型单层囊泡（GUVs）
    1. 配制脂质-矿物油溶液
      1. 向一个4 mL玻璃小瓶中加入57 µL氯仿，然后加入18 µL浓度为25 mg/mL的1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）脂质，以制备氯仿脂质溶液，终浓度为8 mM（可使用其他脂质并保持相似的终浓度）。
        注意：此混合步骤旨在确保不同脂质的均匀混合。
      2. 在氩气流下蒸发氯仿15分钟，然后在真空条件下继续蒸发1小时。
      3. 将所得的干燥脂质溶解于1,500 µL矿物油中，终浓度为400 µM。室温下孵育过夜。
    2. 形成界面脂质层
      1. 加入500 µL外层溶液（参见 表5将250 µL脂质-矿物油溶液缓慢铺加到1.5 mL离心管中的外相溶液上方。室温孵育30分钟，以形成稳定的界面脂质层。
    3. 内溶液的配制
      1. 将所有试剂混合 表6 将T7RNAP、S30提取物和DNA模板分别作为试剂16-18（见表4）加入预内溶液中，配制成完整的内溶液，冰上保存直至使用。
        注意：将包封的蔗糖浓度提高至250 mM以上可能会抑制无细胞翻译44.
    4. GUV的形成
      1. 向含有500 µL脂质矿物油的1.5 mL新离心管中加入50 µL内相溶液，快速吹打混匀，然后剧烈涡旋振荡。
      2. 将离心管置于冰上10分钟，然后缓慢加入20 µL乳化混合物至6.2.2步骤中1.5 mL离心管油相的顶部。
      3. 800 × g 离心 g 使用100 × g至 g 至 1000 × g在 4 °C 下孵育 10 分钟，观察试管底部 GUVs 的形成。
        注意：可使用更高的特定离心速度；但需考虑离心速度可能影响所形成GUVs的大小45.
      4. 移除上层油相。
      5. 小心吸取试管底部的 30 µL GUVs。将收集的 GUVs 在 30 °C 下孵育。
        注意：不同蛋白质的最佳孵育温度有所不同。
      6. 使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM）监测荧光蛋白的表达。
  3. 支撑脂质双层（SLB）
    1. SLB腔室的制备
      1. 将七滴硫酸和两滴50%过氧化氢加入每片24 × 24 mm #1.5盖玻片中心，进行Piranha溶液清洗。反应物在盖玻片上孵育至少45分钟，随后用超纯水彻底冲洗。
      2. 使用光学胶将截短的0.5 mL微量离心管固定在清洗后的盖玻片上，并在紫外灯（365 nm）下照射10分钟使胶固化，从而组装成重建反应室。
    2. SLB的形成
      1. 将80 mol% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、19.95 mol% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂-L-丝氨酸（DOPS）和0.05 mol% Atto488-DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺 = DOPE）溶解于氯仿中，混合均匀后在温和氮气流下吹干，并于真空条件下继续干燥1小时，以彻底去除溶剂。
      2. 用SLB缓冲液A重悬干燥的脂质膜，得到终浓度为4 mg/mL的脂质溶液。
      3. 涡旋并超声处理所得样品，直至溶液变澄清。
      4. 将 SUVs 稀释至 4 mg/mL，加入 130 µL SLB 缓冲液 A，取 75 µL 悬液转移至预形成的反应腔室，于 37 °C 恒温金属块中孵育 1 分钟。向反应腔室中加入 150 µL SLB 缓冲液 A，继续孵育 2 分钟。
      5. 用 2 mL SLB 缓冲液 B（不含 MgCl 的 SLB 缓冲液 A）洗涤腔室2在进行缓冲液置换至含有0.4% (w/v) BSA的S30缓冲液C以用于CFPS反应之前，需在腔室内保留100 µL缓冲液，以防止形成的SLB干燥。
      6. 去除残留的 S30 缓冲液 C，小心地将 CFPS 反应混合物加入 SLB 室中。将室置于 30 °C 培育，并在共聚焦激光扫描显微镜下监测表达情况。

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结果

对于每一批新的细胞提取物和T7 RNA聚合酶，建议对Mg2+和K+浓度进行基础筛选，以确保CFPS系统的最佳性能。在不同条件下，超折叠GFP的荧光可作为CFPS系统总体产量的指标，如图1A、B所示。此外，图1C展示了CFPS系统在不同区室中的平行产量比较，表明封装的CFPS系统具有稳定的性能，尽管在GUVs中产量略有下降，可能受到蔗糖的影响46。此外，CFPS反应已成功封装于液滴（图2）、GUVs（图3）以及SLBs表面（图4）。

图2A 高亮显示乳液滴的形成，当油溶液变得湍急时可明显观察到。使用共聚焦激...

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讨论

本手稿概述了一种改良的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，旨在用于合成细胞平台中的多种微区室，包括油包水液滴、大单层囊泡（GUVs）和固相支持脂双层（SLBs）。我们采用标准的大肠杆菌（E. coli）重组蛋白表达宿主菌株BL21(DE3)作为构建以蛋白质为核心的合成细胞系统的提取物来源。该方法在不同区室中实现了约0.5 mg/mL的蛋白质产量。尽管可使用其他定制的提取物来源菌株，但这些系统主要针对特定类型的蛋白质或代谢活性进行了优化，可能不适用于通用的蛋白质表达。近年来，定量质谱分析技术的进步推动了对细胞裂解液进行蛋白质组学分析的初步研究48,49，特别是在不同制备条件下。

尽管这些研究提供了重要见解，但在已鉴定的蛋白质因子与无细胞蛋白表达系统（CFPS）整体性能之间建立定量相关性仍然具有挑战性。这一空白使得如何对特定批次提取物的性能进行定量评估的问题仍未得到解答。此外，目前尚未见对不同来源菌株进行系统性平行比较的报道。在本研究中，我们采用2xY...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文报道工作的个人关系。

致谢

M. Y. 感谢研究生研究基金的资助 &中国江苏省研究生实践创新计划项目（项目编号：KYCX22_2803）。L.K. 感谢中国江苏省高校自然科学研究项目（项目编号：17KJB180003）、中国江苏师范大学自然科学基金（项目编号：17XLR037）、中国江苏省高校优势学科建设工程项目以及中国江苏省特聘教授项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn二油酰基-甘油-3-磷胆碱（DOPC）Avanti850375P
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐）（DOPS）Avanti840035P
1,4-二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich1.11474
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）Avanti850457P
3,5-环磷酸腺苷（cAMP）Sigma-AldrichA9501
50 mL 离心管EppendorfEppendorf离心管 BioBased
50% 过氧化氢Sigma-Aldrich516813
乙酸盐Sigma-AldrichA6283
琼脂粉Sigma-Aldrich05040
丙氨酸Sigma-AldrichA4349
Amicon 搅拌式超滤池默克密理博UFSC05001
乙酸铵（NH4OAc）Sigma-AldrichA7262
精氨酸Sigma-AldrichA4474
天冬酰胺Sigma-AldrichA0884
天冬氨酸Sigma-AldrichA5474
ATP罗氏11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
带导流板的锥形瓶兽牛250 mL，1000 mL
牛血清白蛋白（BSA）罗氏10711454001
离心管EppendorfEppendorf 离心管 3810X
离心管架Eppendorf0030119819
化学发光与落射荧光成像系统UvitecAlliance Q9 Advanced
氯仿Sigma-Aldrich288306
共聚焦激光扫描显微镜（LSM）ZEISSLSM 780
Countess 细胞计数板载玻片赛默飞世尔科技C10283
盖玻片赛默飞世尔科技Menzel BB02400500A113MNZ0
肌酸激酶（CK）罗氏10127566001
磷酸肌酸（CP）Sigma-Aldrich10621714001
培养皿环球90 mm
半胱氨酸Sigma-AldrichC5360
胞苷5'-三磷酸二钠盐（CTP）aladdinC101487
透析膜光谱标准RC透析管截留分子量：12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒Omega Bio-TekD6492-01
电加热恒温培养箱Yiheng仪器DHP-9602
乙二胺四乙酸（EDTA）Biosharp1100027
荧光酶标仪BioTekSynergy 2
氟化油苏州中芯科学仪器2%HFE7500
亚叶酸Sigma-Aldrich47612
法国压滤器G.HeinemannHTU-DIGI-Press
葡萄糖Sigma-AldrichG7021
谷氨酸Sigma-AldrichG5667
谷氨酰胺Sigma-AldrichG5792
甘油Sigma-AldrichG5516
甘氨酸Sigma-AldrichG7126
三磷酸鸟苷钠盐水合物（GTP）罗氏10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
组氨酸Sigma-AldrichH6034
异亮氨酸Sigma-AldrichI5281
异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
亮氨酸Sigma-AldrichL6914
溶菌素Sigma-AldrichL5501
四水合乙酸镁（Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
氯化镁(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
甲硫氨酸Sigma-AldrichM8439
微型离心机Eppendorf5424 R
矿物油Sigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra 电泳系统伯乐（Bio-Rad）1645050
多功能离心机Eppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
核酸 &核酸与蛋白质紫外检测测量IMPLENNanoPhotometer N60
用于转染级质粒DNA的NucleoBond Xtra Maxi试剂盒MACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 孔聚苯乙烯板Sigma-AldrichP8616
PCR热循环仪EppendorfMastercycler nexus
蛋白胨Sigma-Aldrich83059
苯丙氨酸Sigma-AldrichP8740
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
聚乙二醇 8000（PEG 8000）Sigma-Aldrich89510
乙酸钾（KOAc）Sigma-AldrichP5708
氯化钾(KCl)Sigma-AldrichP9541
谷氨酸钾（K-glutamate）Sigma-AldrichG1501
氢氧化钾（KOH）Sigma-Aldrich221473
脯氨酸Sigma-AldrichP8865
丙酮酸激酶（PK）Sigma-AldrichP9136
丝氨酸Sigma-AldrichS4311
振动器ZhichushakersZQZY-AF8
氯化钠(NaCl)Sigma-AldrichS5886
氢氧化钠(NaOH)Sigma-AldrichS5881
蔗糖阿拉丁S112226
硫酸Sigma-Aldrich339741
注射器滤器Jinteng0.45 μm
试管兽牛20 mL
TGX FastCast 丙烯酰胺试剂盒，12%伯乐（Bio-Rad）#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
苏氨酸Sigma-AldrichT8441
Tris 碱Sigma-AldrichV900483
tRNA罗氏10109550001
胰蛋白胨Sigma-AldrichT7293
色氨酸Sigma-AldrichT8941
酪氨酸Sigma-AldrichT8566
三磷酸尿苷三钠盐（UTP）阿拉丁U100365
带循环水系统的真空泵郑州长城科工贸有限公司SHB-<图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/66626/66626eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/>
瓦林Sigma-AldrichV4638
涡旋混合器Kylin-BellVortex QL-861
水纯化系统默克密理博直接超纯水（1型）
酵母提取物Sigma-Aldrich70161
β-巯基乙醇Sigma-Aldrich444203

参考文献

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  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
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