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方法文章

幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑

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DOI：

10.3791/66629

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2024年3月1日

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1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University and Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University and Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University and Medical Center, 4Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center, 5Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University and Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们在此描述了诱导和分析触角叶突触小球在嗅觉经验依赖性重塑过程中的方法 果蝇 幼年大脑

摘要

生命早期嗅觉感官经验可诱导嗅球中突触小球发生显著重塑 果蝇 幼年大脑具有经验依赖性，其可塑性在时间上受到限制，且仅在短暂而明确的关键期内可短暂逆转。脑回路突触连接的重塑方向由作用于嗅觉感觉神经元特定受体类别的气味分子决定。通常情况下，每类神经元仅表达一种气味受体，并投射至单一的嗅觉突触小球。在 黑腹果蝇 遗传模型中，已通过气味反应性和行为输出精确绘制出嗅觉小球的完整图谱。乙酸乙酯（EB）气味分子可激活投射至VM7小球的Or42a受体神经元。在生命早期关键期，EB刺激会引发Or42a嗅觉感觉神经元中剂量依赖性的突触消除。通过精确控制EB气味分子的暴露时长与剂量，可研究幼年大脑中依赖经验的神经环路连接修剪过程。利用Or42a受体驱动的转基因标记物，可通过共聚焦显微镜对触角叶突触小球进行成像，从而定量分析突触数量与神经支配体积。该方法具有高度的 果蝇 基因工具包能够系统解析介导脑环路重塑的细胞与分子机制。

引言

在生命早期，幼年大脑神经回路的重塑代表了动物出生后最后一次大规模突触连接发生改变以适应高度可变且不可预测环境的机会。作为动物界中数量最丰富的类群，昆虫共享这一在进化上保守的基础性关键期重塑机制1。关键期随着感觉输入的开始而开启，期间神经回路发生可逆性变化以优化连接，随后当稳定化机制抵抗进一步重塑时，关键期关闭2。昆虫尤其依赖嗅觉感觉信息，并表现出明确界定的嗅觉关键期。Drosophila 是研究幼年大脑中这种依赖经验的关键期的优良遗传模型。羽化后最初几天内的气味经验会驱动在个体水平上可识别的突触小球发生显著的回路连接改变3,4。重塑的方向取决于特定的输入气味经验：某些气味在羽化后数天（dpe）内引起突触小球体积增加3,5,6,7，而其他气味则在0–2 dpe的关键期内迅速消除突触，导致神经支配体积减小8,9,10。具体而言，丁酸乙酯（EB）气味经验仅在生命早期这一关键期内引起Or42a嗅觉受体神经元的剂量依赖性突触修剪8。在关键期内通过调节EB气味输入可完全逆转突触消除，但一旦关键期关闭，该变化即变为永久性。这种依赖嗅觉经验的突触修剪为揭示幼年大脑回路重塑的时间限制机制提供了一个有价值的实验系统。

本文介绍了一种详细的实验方案，用于诱导并分析果蝇幼年关键期中，EB（经验依赖性）调控的 Or42a 受体嗅觉感觉神经元突触修剪过程。我们展示，可通过转基因手段特异性地标记触角叶 VM7 小球中的 Or42a 突触末端，方法包括：将膜锚定型 mCD8::GFP 标记物直接由 Or42a 启动子驱动表达（Or42a-mCD8::GFP）11，或利用 Gal4/UAS 双元表达系统（Or42a-Gal4 驱动 UAS-mCD8::GFP）12。单个 Or42a 神经元的突触也可通过靶向转基因表达的方式，使用与多种荧光标签融合的突触前活性区标记物（例如 Bruchpilot::RFP）8，或用于超微结构突触分析的电子致密信号标记（例如 miniSOG-mCherry）8 进行标记。Or42a 突触末端可通过激光扫描共聚焦显微镜与透射电子显微镜联合成像。我们发现，Or42a 突触小球的修剪程度与 EB 剂量相关，并随定时施加的气味刺激浓度而变化。作为溶剂的矿物油中 EB 气味剂的溶解百分比可进行调节，也可根据发育阶段定时改变动物接受气味暴露的持续时间。最后，我们展示了通过测量 VM7 支配区域的荧光强度与体积，来分析突触小球修剪程度的方法。突触数量还可通过计数标记的突触斑点以及利用透射电子显微镜测量突触超微结构参数进行定量分析8。总体而言，本文所述方案是一种强大而系统的方法，可用于解析幼年关键期内介导 Drosophila 嗅觉环路突触连接修剪的细胞与分子机制。本研究中描述的通用气味暴露装置已在先前研究中被用于其他气味刺激及其他小球的检测分析3,7。

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方案

1. 气味物质暴露

  1. 使用细毛刷将40–50只发育至预蛹期深色蛹阶段的动物（25 °C条件下化蛹后90小时以上）挑选至25 mm × 95 mm的聚苯乙烯培养皿中 果蝇 含有标准玉米粉糖蜜培养基的离心管（图1A).
  2. 将细的不锈钢丝网放置在末端 果蝇 小瓶用于盛放果蝇，同时确保良好的空气流通。用透明胶带将金属网盖固定在小瓶侧面。 黑腹果蝇 小瓶
  3. 在1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 100%矿物油（溶剂对照），或在另一管中将丁酸乙酯（EB）气味剂溶于矿物油，配制成所需浓度（例如15%（150 µL）或25%（250 µL））。
  4. 将溶剂对照或气味剂微量离心管直立放置于一个密封的3700 mL Glasslock玻璃容器内。使用胶带将管子与气味室中心处的 果蝇 小瓶（图1B).
  5. 将密封的对照载体和含有不同发育阶段的EB气味物质的容器放置 果蝇 将蛹前期小瓶置于湿度控制（70%）、温度控制（25 °C）的培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件。
  6. 在气味室暴露4小时后移除新羽化的果蝇，并迅速将20–25只果蝇转移至新鲜的 果蝇 小瓶置于含有新配制气味物质的腔室中图1A，B）。丢弃未封闭的蛹。
  7. 将果蝇置于密封的气味室中，在培养箱内孵育总共24小时。如需更长时间的气味处理，迅速将果蝇转移至新的气味室 果蝇 每24小时将小瓶转移至新配制的气味剂室中。
  8. 将处于特定发育阶段的果蝇浸入盛有70%乙醇的培养皿中1分钟，以麻醉果蝇，为立即进行脑解剖和免疫细胞化学处理做准备。

2. 脑组织解剖

  1. 将离心管标记为溶剂对照组（仅含100%矿物油）或EB暴露组（% EB），并从脑组织解剖到后续处理的整个过程中始终保持该标记。每种基因型/气味刺激条件下处理10–20只动物。
  2. 用镊子将一只麻醉后的果蝇转移至盛有新鲜配制的磷酸盐缓冲液（PBS）13的小培养皿中。将果蝇完全浸入PBS中，并在液体下完成整个脑组织的解剖操作。
  3. 双手各持一把精细（#5）尖头镊子，将果蝇腹面朝上放置，用一把镊子夹住胸部上部，另一把镊子夹住喙下方的头部区域。注意不要刺穿脑组织。
  4. 双手向相反方向轻轻拉扯，使头部与身体分离。头部应能轻松从胸部脱离；将分离出的头部分离后用于下一步解剖（图1C）。
  5. 将之前夹持胸部的镊子滑至喙的另一侧下方。开始向相反方向轻轻拉扯外骨骼角质层，使其在两眼之间裂开，从而暴露脑组织。
  6. 在拉扯过程中，脑的视叶可能随外骨骼一同被撕离。为避免此情况，在去除外骨骼角质层时应使用两把镊子缓慢而稳定地施力（图1C，中图）。
  7. 继续从头部去除全部外骨骼角质层，确保所有外骨骼碎片均被清除。同时去除附着在脑组织上的其他组织，包括脂肪体和任何延伸的气管。
  8. 为防止粘连，先用含0.2% Triton-X 100的PBS（PBST）冲洗P20移液器吸头。解剖完成后立即转移脑组织至固定液（4%多聚甲醛（PFA）+ 4%蔗糖）中，置于带盖离心管内（图1C、D）。

3. 脑免疫细胞化学

  1. 在室温（RT）下，以翻转混匀方式固定脑组织 30 分钟。保持脑组织在离心管中，用移液器吸除固定液并妥善处理危险废液。用 PBS 快速洗涤固定后的脑组织 3 次（图 1D）。
  2. 旋转后脑组织常会粘附在离心管盖上。为防止在转移过程中意外丢失脑组织（这是所有转移操作中的常见风险），移液时应使用解剖显微镜观察。
  3. 为进行抗体标记，将固定后的脑组织在含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.5% 正常山羊血清（NGS）的 PBST 中，于室温（RT）封闭 1 小时，同时持续翻转混匀（图 1D）。
  4. 吸除封闭液，加入用 PBST 配制并适当稀释的一抗溶液，使脑组织在其中孵育。于 4 °C 下持续旋转孵育过夜（14–16 小时）。
    注意：所用一抗示例：大鼠抗 CadN 抗体（稀释比例 1:50）14 用于标记突触小球，鸡抗 GFP 抗体（1:1000）8 用于标记 Or42a-mCD8::GFP（图 1D）。
  5. 吸除一抗溶液，用 PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 20 分钟。随后在含 0.2% BSA 和 0.1% NGS 的 PBST 中加入适当稀释的二抗，于室温下持续旋转孵育 2 小时。
    注意：也可选择在 4 °C 下过夜（14–16 小时）孵育。二抗稀释于含 0.2% BSA 和 0.1% NGS 的 PBST 中；本实验所用二抗为：488 标记的山羊抗鸡 IgG（1:250）和 546 标记的山羊抗大鼠 IgG（1:250）。
  6. 吸除二抗溶液，用 PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 20 分钟。最后用 PBS 洗涤脑组织 20 分钟（图 1D）。
  7. 准备玻璃载玻片（75 mm × 25 mm），在载玻片上粘贴两条双面胶带，两条胶带间距约为 25 mm。此间隔可防止压碎脑组织。
  8. 在两条胶带之间滴加约 10–15 µL 封片介质以承载脑组织。使用预先用 PBST 冲洗过的 P20 移液器吸头，将标记好的脑组织转移至载玻片上（图 1E）。
  9. 脑组织转移完成后，使用细毛刷调整其位置，确保触角叶朝上。寻找具有拱形隆起的一侧，该侧即含有触角叶。
  10. 待脑组织正确取向后，盖上盖玻片（No. 1.5H），确保盖玻片牢固地粘附在胶带上。然后在盖玻片四周补充封片介质（图 1E）。
  11. 用透明指甲油密封盖玻片边缘。让载玻片充分干燥后，置于冰箱中保存，以备后续成像使用。

4. 共聚焦成像

  1. 在成像前，对所有脑切片的基因型和实验条件进行盲法处理，通过标记编码标签以便后续解码。
  2. 使用配备63倍油镜的激光扫描共聚焦显微镜。本文所有图像均使用蔡司510 META显微镜采集（图1F）。
  3. 根据所用荧光染料选择合适的激光谱线。此处使用氩离子488 nm和氦氖543 nm激光，用于触角叶突触小球和Or42a嗅觉感觉神经元成像（图2）。
  4. 确定两个通道的最佳增益和偏移值，理想情况下两个通道的增益应<750，偏移值≈0。此设置旨在保证信噪比最优的同时限制背景信号。
  5. 将成像区域定位至脑中心。成像时，VM7小球位于解剖过程中移除食道后在脑中央留下的孔洞附近（图2A）。
    注意：VM7小球始终靠近食道开口位置。然而，其确切位置和大小会因脑组织解剖和封片操作的差异而略有不同，成像时需考虑此因素。
  6. 选择成像分辨率和光学切片厚度。此处采用1024 × 1024分辨率，Z轴堆栈切片厚度为0.37 µm。
  7. 对整个触角叶进行共聚焦Z轴堆栈投影成像，确保完整捕获Or42a神经元在VM7小球中的全部神经支配区域。

5. 突触测量

  1. 将基因型/条件设盲的图像载入 Fiji 软件（1.54f）。通过点击 图像 > 颜色 > 拆分通道，分离激光通道。
  2. 在 Or42a 嗅觉感觉通道中，通过浏览整个 Z 轴层叠图像，确定哪些切片包含 Or42a 神经支配，识别荧光信号的起始与终止位置。
  3. 仅选取包含 Or42a 神经元支配的切片，创建最大强度投影图像：点击 图像 > 图像栈 > Z 轴投影 > 求和切片，并输入所需的切片范围。
  4. 在 Fiji 中，点击顶部工具栏的 套索 工具，勾勒 VM7 小球中 Or42a 神经元支配的轮廓，对每侧大脑的小球独立处理（图 3）。
  5. 将轮廓周长乘以 Z 轴层叠图像的切片数量及每片厚度，计算 VM7 突触小球的神经支配体积。为定量突触数量，可在划定区域内使用“寻找最大值”工具，并结合“寻找最大值图像栈”宏，计数突触 puncta8,15。

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结果

图1展示了基于嗅觉经历依赖性关键期的气味暴露与脑成像方法的工作流程。图1A所示，该方案从羽化前的龄期匹配的暗蛹阶段开始。将蛹置于气味暴露室中4小时，随后将新羽化的成虫转移至对照溶剂或含EB气味剂的暴露室中的新试管中图1B。我们通常进行24小时的气味暴露，但也可根据需要调整暴露时长。气味暴露结束后，开始脑组织解剖：首先将头部从胸部分离，再用精细镊子去除角质外骨骼图1C。分离出的脑组织需清除可能干扰成像的附属组织，随后立即在含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS溶液中固定。短时间固定30分钟即可充分保持脑组织完整性。免疫细胞化学染色流程包括：1小时封闭（如BSA、NGS），随后在一抗（如抗-GFP、抗-CadN）中过夜孵育，再在二抗中短暂孵育2小时图1D。标记完成的脑组织被置于载玻片上，加盖玻片密封，脑背侧朝上，以获得最佳的触角叶成像效果

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讨论

此处介绍的气味暴露与脑成像方案可用于在生命早期关键期可靠地诱导并量化依赖经验的嗅觉感觉神经元突触小球修剪过程。早期采用该处理范式研究嗅觉环路重塑的研究从出生后第2天开始进行气味暴露nd 羽化后第一天3,4,5相比之下，我们在成虫羽化前的围蛹期开始进行气味物质暴露，发现绝大多数的神经重塑发生在羽化后的前24小时内。8,9因此，该气味暴露方案的一个关键步骤是在蛹羽化前将处于特定发育阶段的暗色蛹放入气味暴露室中。图1）。这不适用于蛹期气味暴露 本身 而是为了确保成虫羽化后立即接触气味物质。我们选择在分期后4小时选取刚羽化的幼年成虫，以在较短的时间窗口内同步个体年龄，并避免气味物质暴露时间的差异。这一较早的经历时间段与近期研究结果一致，表明EB嗅...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢Broadie实验室其他成员的宝贵意见。图示使用BioRender.com制作。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为MH084989和NS131557，授予K.B.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
气味暴露用
Drosophila 小管Genesee Scientific32-110
丁酸乙酯Sigma AldrichE15701
微量离心管 Fisher Scientific 05-408-129
矿物油Sigma AldrichM3516
气味暴露室Glasslock
画笔Winsor & NewtonSeries 233
Parafilm封口膜ThermofisherS37440
金属丝网Scienceware378460000
脑组织解剖
乙醇，190 proofDecon Labs2801稀释至70%
镊子Fine Science Tools11251-30Dumont #5
多聚甲醛 Electron Microscope Sciences157-8稀释至4%
培养皿Fisher Scientific 08-757-100B
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific70011-044稀释至1x
蔗糖Fisher Scientific BP220-1
SylgardElectron Microscope Sciences24236-10
Triton-X 100Fisher Scientific BP151-100
脑组织免疫细胞化学染色
488标记山羊抗鸡IgGInvitrogenA11039
546标记山羊抗大鼠IgGInvitrogenA11081
牛血清白蛋白 Sigma AldrichA9647
鸡抗GFP抗体Abcam13970
盖玻片Avantor48366-06725 × 25 mm
双面胶带Scotch34-8724-5228-8
Fluoromount-G封片剂 Electron Microscope Sciences17984-25
显微镜载玻片Fisher Scientific12-544-275 × 25 mm
指甲油Sally Hansen109Xtreme Wear，无色透明
正常山羊血清Sigma AldrichG9023
大鼠抗CadN抗体Developmental Studies Hybridoma BankAB_528121
共聚焦显微镜/图像分析
任意计算机/笔记本电脑
共聚焦显微镜Carl ZeissZeiss 510 META 
Fiji软件Fiji版本 2.14.0/1.54f

参考文献

  1. English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
  2. Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091(2023).
  3. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  4. Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
  5. Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
  6. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
  7. Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244(2015).
  8. Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
  9. Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
  10. Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
  11. Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080(2012).
  12. Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
  13. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128(2016).
  14. Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160(2021).
  17. Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443(2023).

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