我们在此描述了诱导和分析触角叶突触小球在嗅觉经验依赖性重塑过程中的方法 果蝇 幼年大脑
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方法文章
幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
生命早期嗅觉感官经验可诱导嗅球中突触小球发生显著重塑 果蝇 幼年大脑具有经验依赖性，其可塑性在时间上受到限制，且仅在短暂而明确的关键期内可短暂逆转。脑回路突触连接的重塑方向由作用于嗅觉感觉神经元特定受体类别的气味分子决定。通常情况下，每类神经元仅表达一种气味受体，并投射至单一的嗅觉突触小球。在 黑腹果蝇 遗传模型中，已通过气味反应性和行为输出精确绘制出嗅觉小球的完整图谱。乙酸乙酯（EB）气味分子可激活投射至VM7小球的Or42a受体神经元。在生命早期关键期，EB刺激会引发Or42a嗅觉感觉神经元中剂量依赖性的突触消除。通过精确控制EB气味分子的暴露时长与剂量，可研究幼年大脑中依赖经验的神经环路连接修剪过程。利用Or42a受体驱动的转基因标记物，可通过共聚焦显微镜对触角叶突触小球进行成像，从而定量分析突触数量与神经支配体积。该方法具有高度的 果蝇 基因工具包能够系统解析介导脑环路重塑的细胞与分子机制。
引言
在生命早期，幼年大脑神经回路的重塑代表了动物出生后最后一次大规模突触连接发生改变以适应高度可变且不可预测环境的机会。作为动物界中数量最丰富的类群，昆虫共享这一在进化上保守的基础性关键期重塑机制1。关键期随着感觉输入的开始而开启，期间神经回路发生可逆性变化以优化连接，随后当稳定化机制抵抗进一步重塑时，关键期关闭2。昆虫尤其依赖嗅觉感觉信息，并表现出明确界定的嗅觉关键期。Drosophila 是研究幼年大脑中这种依赖经验的关键期的优良遗传模型。羽化后最初几天内的气味经验会驱动在个体水平上可识别的突触小球发生显著的回路连接改变3,4。重塑的方向取决于特定的输入气味经验：某些气味在羽化后数天（dpe）内引起突触小球体积增加3,5,6,7，而其他气味则在0–2 dpe的关键期内迅速消除突触，导致神经支配体积减小8,9,
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方案
1. 气味物质暴露
- 使用细毛刷将40–50只发育至预蛹期深色蛹阶段的动物（25 °C条件下化蛹后90小时以上）挑选至25 mm × 95 mm的聚苯乙烯培养皿中 果蝇 含有标准玉米粉糖蜜培养基的离心管（图1A).
- 将细的不锈钢丝网放置在末端 果蝇 小瓶用于盛放果蝇，同时确保良好的空气流通。用透明胶带将金属网盖固定在小瓶侧面。 黑腹果蝇 小瓶
- 在1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 100%矿物油（溶剂对照），或在另一管中将丁酸乙酯（EB）气味剂溶于矿物油，配制成所需浓度（例如15%（150 µL）或25%（250 µL））。
- 将溶剂对照或气味剂微量离心管直立放置于一个密封的3700 mL Glasslock玻璃容器内。使用胶带将管子与气味室中心处的 果蝇 小瓶（图1B).
- 将密封的对照载体和含有不同发育阶段的EB气味物质的容器放置 果蝇 将蛹前期小瓶置于湿度控制（70%）、温度控制（25 °C）的培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件。
- 在气味室暴露4小时后移除新羽化的果蝇，并迅速将20–25只果蝇转移至新鲜的 果蝇 小瓶置于含有新配制气....
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结果
图1展示了基于嗅觉经历依赖性关键期的气味暴露与脑成像方法的工作流程。图1A所示，该方案从羽化前的龄期匹配的暗蛹阶段开始。将蛹置于气味暴露室中4小时，随后将新羽化的成虫转移至对照溶剂或含EB气味剂的暴露室中的新试管中图1B。我们通常进行24小时的气味暴露，但也可根据需要调整暴露时长。气味暴露结束后，开始脑组织解剖：首先将头部从胸部分离，再用精细镊子去除角质外骨骼图1C。分离出的脑组织需清除可能干扰成像的附属组织，随后立即在含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS溶液中固定。短时间固定30分钟即可充分保持脑组织完整性。免疫细胞化学染色流程包括：1小时封闭（如BSA、NGS），随后在一抗（如抗-GFP、抗-CadN）中过夜孵育，再在二抗中短暂孵育2小时图1D。标记完成的脑组织被置于载玻片上，加盖玻片密封，脑背侧朝上，以获得最佳的触角叶成像效果
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讨论
此处介绍的气味暴露与脑成像方案可用于在生命早期关键期可靠地诱导并量化依赖经验的嗅觉感觉神经元突触小球修剪过程。早期采用该处理范式研究嗅觉环路重塑的研究从出生后第2天开始进行气味暴露nd 羽化后第一天3,4,5相比之下，我们在成虫羽化前的围蛹期开始进行气味物质暴露，发现绝大多数的神经重塑发生在羽化后的前24小时内。8,9因此，该气味暴露方案的一个关键步骤是在蛹羽化前将处于特定发育阶段的暗色蛹放入气味暴露室中。图1）。这不适用于蛹期气味暴露 本身 而是为了确保成虫羽化后立即接触气味物质。我们选择在分期后4小时选取刚羽化的幼年成虫，以在较短的时间窗口内同步个体年龄，并避免气味物质暴露时间的差异。这一较早的经历时间段与近期研究结果一致，表明EB嗅.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢Broadie实验室其他成员的宝贵意见。图示使用BioRender.com制作。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为MH084989和NS131557，授予K.B.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 气味暴露用 | |||
| Drosophila 小管 | Genesee Scientific | 32-110 | |
| 丁酸乙酯 | Sigma Aldrich | E15701 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 矿物油 | Sigma Aldrich | M3516 | |
| 气味暴露室 | Glasslock | ||
| 画笔 | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm封口膜 | Thermofisher | S37440 | |
| 金属丝网 | Scienceware | 378460000 | |
| 脑组织解剖 | |||
| 乙醇，190 proof | Decon Labs | 2801 | 稀释至70% |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| 多聚甲醛 | Electron Microscope Sciences | 157-8 | 稀释至4% |
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | 稀释至1x |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| 脑组织免疫细胞化学染色 | |||
| 488标记山羊抗鸡IgG | Invitrogen | A11039 | |
| 546标记山羊抗大鼠IgG | Invitrogen | A11081 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A9647 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Abcam | 13970 | |
| 盖玻片 | Avantor | 48366-067 | 25 × 25 mm |
| 双面胶带 | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 × 25 mm |
| 指甲油 | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear，无色透明 |
| 正常山羊血清 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| 大鼠抗CadN抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| 共聚焦显微镜/图像分析 | |||
| 任意计算机/笔记本电脑 | |||
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji软件 | Fiji | 版本 2.14.0/1.54f |
参考文献
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of ....
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重印与许可
