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胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

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DOI：

10.3791/66631

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2024年3月8日

 ,  , 
1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

本文内容

摘要

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。

摘要

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。这一过程对大脑正常功能至关重要，其调控异常可导致出生后的神经发育障碍和精神疾病。事实上，许多与这些疾病相关的基因已被发现参与了该过程，因此揭示这些基因突变如何影响细胞动态变化，对于理解相关疾病的发病机制具有重要意义。本实验方案介绍了一种对小鼠胚胎脑切片中迁移的神经元和胶质前体细胞进行活体延时成像的技术。通过使用荧光蛋白对细胞进行标记，结合 在子宫内 电穿孔技术，可利用高信噪比对从脑室区迁移的单个细胞进行可视化观察。此外，该方法 体内 基因转移系统使我们能够通过共电穿孔其表达载体或敲低/敲除载体，轻松地对目标基因进行功能获得或功能缺失实验。利用本方案，可分析单个细胞的迁移行为和迁移速度，而这些信息是通过固定脑组织无法获得的。

引言

在大脑皮层发育过程中，位于侧脑室壁的脑室区（VZ）中的（顶端）放射状胶质细胞首先产生神经元，随后产生胶质前体细胞，这两个过程存在部分重叠时期1。神经元也可由紧邻VZ的室下区（SVZ）中的中间前体细胞或基底放射状胶质细胞生成，而这些细胞均起源于（顶端）放射状胶质细胞2,3。在小鼠中，放射状胶质细胞在胚胎期（E）12–14天仅产生神经元，在E15–16天同时产生神经元和胶质前体细胞，从E17开始则主要产生胶质前体细胞4。在这些胚胎阶段产生的主要胶质前体细胞群体倾向于分化为星形胶质细胞，尽管其中也有部分细胞分化为少突胶质细胞5。在这些阶段生成的神经元和星形胶质前体细胞向脑表面迁移并进入皮层板（未来的皮层灰质）。神经元从VZ向皮层板的迁移经历多个阶段。神经元首先在多极细胞聚集区（MAZ）上方转变为多极形态，在该区域（与SVZ或中间区重叠）中，神经元剧烈地伸出和回缩多个细小突起，并缓慢迁移（称为多极迁移）6,7。大约24小时后，神经元转变为双极形态，伸展出一个粗大的朝向脑表面的 leading process 和一个向后的细长 trailing process，并沿着放射状胶质细胞延伸至软脑膜表面的放射状突起作为支架，呈直线向脑表面迁移，这一模式称为运动模式（locomotion mode）2,8。由于处于运动模式的神经元总是能够到达皮层板的最外层表面，并穿过位于边缘区下方的早期出生神经元，因此神经元在皮层板中按照出生时间呈现出由内向外的顺序排列9,10,11。

相比之下，星形胶质细胞前体细胞会快速迁移至中间带和皮层板，并频繁改变迁移方向。这种迁移行为与神经元迁移完全不同，被称为“不规则迁移”5。星形胶质细胞前体细胞还会沿着血管迁移，这一过程称为“血管导向迁移”。这些前体细胞可在上述两种迁移模式之间转换，并最终到达皮层板5,12。尽管星形胶质细胞的定位并非严格由其生成时间决定，但已有研究观察到早期生成的星形胶质细胞倾向于定位于皮层板的浅层区域5。有趣的是，定位于皮层板的星形胶质细胞是在胚胎期产生的，并最终分化为原浆型星形胶质细胞；而出生后产生的星形胶质细胞则不进行主动迁移，停留在白质中，并分化为纤维状星形胶质细胞5。这种依赖发育阶段的星形胶质细胞亚型特化机制目前尚不清楚。

越来越多参与神经元迁移的基因已被发现，其中包括与神经发育障碍和精神疾病相关的基因13,14。因此，阐明这些基因突变对迁移中神经元行为的影响至关重要。如前所述，神经元迁移包含多个阶段。通过延时成像观察可直接确定受主要影响的阶段（细胞周期退出、多极-双极转换、运动迁移速度等）。然而，星形胶质细胞在命运决定、迁移及定位过程中的分子机制仍 largely unknown。鉴于星形胶质细胞在突触形成15以及脑发育过程中血脑屏障构建16中发挥关键作用，其发育缺陷可能导致神经发育障碍。对星形胶质前体细胞的延时研究有助于阐明这些分子机制及其与精神疾病的关系。

本方案提供了一种对皮层室下区来源细胞进行延时观察的方法。类似的用于观察神经元迁移的视频方案已有发表。17在此，我们描述了迁移神经元和星形胶质细胞前体的标记方法。为了用荧光蛋白（如绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，GFP 和 RFP）标记这些细胞，将含有适当组分的质粒混合物导入大脑皮层室下区（VZ） 在子宫内 在适当阶段进行电穿孔18,19,20,21在目标阶段取出经处理的胚胎，切片后利用激光扫描显微镜进行活体延时观察。该方法可用于分析细胞迁移速度、方向及其他行为特征，而这些参数无法通过固定脑组织样本进行研究。利用 在子宫内 电穿孔、表达和敲低/敲除载体可与荧光蛋白载体同时转移，使我们能够对特定基因进行功能获得和功能缺失研究。

方案

本研究经爱知发育障碍中心发育研究研究所动物护理与使用委员会（#2019-013）和庆应义塾大学（A2021-030）批准，并遵循其相关指南进行。 定时妊娠的ICR（野生型）小鼠通过商业途径获得（见材料表）。为观察迁移细胞与血管之间的关系，使用了Flt1-DsRed小鼠，其内皮细胞表达DsRed22。将雄性Flt1-DsRed小鼠与雌性ICR小鼠（均为8–24周龄）交配。所有动物在采样前均饲养和操作于特定病原体阴性（SPF）环境中。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 在子宫内 电穿孔

  1. 通过将等体积的灭菌水加入市售的2倍浓度HEPES缓冲盐溶液（2x HBS）中，配制HEPES缓冲盐溶液（HBS）。
  2. 麻醉剂有两种选择：异氟烷（吸入）和MMB（注射）。若使用MMB，按如下方法配制：在19.75 mL灭菌蒸馏水中加入0.75 mL美托咪定（1 mg/mL）、2 mL咪达唑仑（5 mg/mL）和2.5 mL布托啡诺（5 mg/mL）。23.
    注意：该麻醉溶液在2个月内活性会降低。请在4 °C避光保存。
  3. 准备阿替美唑溶液。将0.75 mL阿替美唑（5 mg/mL）用24.25 mL高压灭菌水稀释。
  4. 在灭菌蒸馏水中配制0.2%（w/v）快绿溶液，使用滤膜（孔径0.22 µm）过滤除菌。
  5. 使用基于碱裂解和柱层析纯化的常规质粒提取试剂盒制备质粒23 根据制造商的说明（参见 材料表）。将100 mL细菌培养物中提取的纯化质粒溶解于30–50 µL HBS中，制备质粒储备液（3–5 µg/µL）（补充文件 1).
    1. 将质粒储备液与HBS混合并稀释，加入1/10体积的0.2%快绿以对注射液进行染色。质粒的组分及终浓度根据其用途确定（表1).
  6. 使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成微移液管。
    注意：使用精细镊子斜向剪切移液器尖端。尖端外径约为70 µm。通过吸取2 µL水，在微移液管上以2 µL为间隔做标记。
  7. 在适当阶段，按照机构批准的方案，向怀孕小鼠腹腔注射剂量为10 μL/g体重的MMB麻醉剂。
    注意：应根据实验目的确定所需操作的胚胎时期。若要标记未来的II/III层锥体神经元，E14.5时期较为合适；若要标记胶质前体细胞，则需在E15-16时期进行电穿孔。 alternatively，也可通过吸入异氟烷（1%-2%）对小鼠进行麻醉。
  8. 小鼠深度麻醉后，将其置于38 °C的加热板上。
    注意：确保小鼠对尾部夹捏无反应。
  9. 使用脱毛膏去除手术部位周围的毛发后，先以碘伏消毒液、再用70%酒精，均以环形方式多次消毒手术区域。 沿中线从相应椎体水平开始做一长度为2 cm的皮肤切口nd 最靠后的一对乳头前方，沿腹白线做一条2厘米的正中切口图1A).
    注意：在切开腹壁的过程中，应用精细镊子轻轻提起腹壁，以免损伤内脏器官。
  10. 在皮肤上放置一张无菌塑料膜，并在其上放一张无菌滤纸图1A在中心位置开一个孔，以暴露手术区域。
    注意：切口完成后才放置无菌塑料片和无菌纸巾，因为需要较宽的视野，以便根据乳头位置确定切口位置。
  11. 用无菌 PBS 湿润滤纸，从切口处仔细观察子宫角，并通过塑料片和滤纸上的孔将子宫角轻轻拉出。
  12. 使用连接至吸管组件的微量移液器，通过子宫壁以呼气压力将1 µL质粒混合物注入左侧或右侧侧脑室图1A).
    注：也可使用显微注射仪注射质粒。
  13. 用镊子型电极夹住胚胎头部，使用电穿孔仪施加电脉冲（E14-16 为 35 V，E17 为 50 V，方波脉冲持续 50 ms，间隔 450 ms，共 5 次）图1A).
    注意：不要用力夹住胚胎的头部，以免损伤胚胎。实际电流应为 40–70 mA。
  14. 将子宫角放回腹腔内。
  15. 使用5-0丝线缝合腹壁。
  16. 按10 µL/g体重的剂量腹腔注射阿替美唑溶液。
  17. 使用5-0丝线缝合皮肤。
    注意：皮肤可用自动缝合夹闭合。
  18. 将操作后的小鼠置于加热板上至少30分钟。小鼠将在笼内开始活动。
    注意：该操作步骤的 在子宫内 电穿孔（步骤1.7至1.16）应在30分钟内完成，通常操作时间为20分钟。

2. 切片的制备

注意：切片的新鲜度是本实验成功的关键。切片必须在2小时内完成制备（从步骤2.5至2.12）。

  1. 配制含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hanks' 平衡盐溶液（HBSS(+)）。向 500 mL HBSS(-) 中加入 5 mL CaCl2（14 g/L，已高压灭菌）和 5 mL MgSO4·7H2O（20 g/L，已高压灭菌）。4 °C 保存。使用前在冰上用 95% O2 + 5% CO2 气体鼓泡 5 分钟。
  2. 配制培养基。每皿至少需要 2.5 mL。向 8 mL Neurobasal 培养基中加入 2 mL 胎牛血清、25 µL L-谷氨酰胺（200 mM）、200 µL B27（50 倍浓缩液）以及 50 µL 青霉素-链霉素溶液（10 K 单位/mL 和 10 mg/mL）。
  3. 配制 3% 低熔点琼脂糖凝胶。向 50 mL HBSS(+) 中加入 1.5 g 低熔点琼脂糖，高压灭菌。在微波炉中融化后，置于 50 °C 水浴培养箱中备用。
  4. 向玻璃底培养皿中加入 1.9 mL 培养基。小心地将细胞培养插件放置其上，避免滤膜下产生气泡，然后向滤膜上加入 500 µL 培养基（图 1B）。将装置置于冰上。
  5. 通过吸入 5% 异氟烷麻醉实验小鼠后，按照机构批准的方案在适当观察时间点实施颈椎脱位处死。
    注意：在 E14.5 电转后 2 天（48 小时）和 3 天分别适合观察多极-双极转变和迁移模式。
  6. 取出胚胎并置于含冷 PBS 的培养皿中。
  7. 在显微镜下根据 GFP 或其他荧光蛋白的表达情况筛选胚胎。
  8. 将胚胎断头后，在解剖显微镜下分离脑组织6，并将其保存在冷的 HBSS(+) 中。
  9. 将融化的 3% 低熔点琼脂糖凝胶倒入冷冻模具（见材料表），放入脑组织并轻轻滚动数次。室温放置至琼脂糖完全凝固，然后置于冰上。
  10. 使用振动切片机（见材料表）将脑组织进行冠状面切片，厚度为 350 µm。
  11. 将切片排列在滤膜上（每张滤膜最多放置 6 片）。
  12. 吸除滤杯内外侧的培养基（共 600 µL）。此步骤可使切片被压紧并固定在滤膜上。5 分钟后，向细胞培养插件内侧加入 100 µL 培养基。

3. 时间序列成像

  1. 在成像前至少30分钟，将培养室安装在倒置激光扫描显微镜的载物台上，并使用培养室的加热装置或包裹显微镜的加热罩维持37 °C，以防止Z轴漂移。向培养室供应加湿的5% CO2 + 40% O2 气体。
  2. 将上述制备好的脑片置于培养室中的培养皿内。
  3. 使用长工作距离20倍物镜（NA = 0.45），每隔15-30分钟采集约10组Z轴层扫图像，步进为5 µm，持续24小时。
    注意：强烈建议使用电动XY载物台。这使我们能够从多个物镜视野获取图像。通常，在一次延时成像实验中，我们会从不同的物镜视野获取10-20幅图像。

4. 成像分析

  1. 使用 ImageJ 或其他软件，通过 Z 轴的最大投影将 XYZT 图像转换为 XYT 图像。
    注意：如果在观察过程中切片发生滑动，请使用 ImageJ 插件 StackRed 的“刚体变换”（Rigid Body transformation）功能调整图像中细胞的位置（参见 材料表）。
  2. 通过手动或自动方式追踪表达 GFP 或其他荧光蛋白的细胞轨迹。手动和自动追踪可分别使用 MTrackJ24 和 TrackMate25,26（ImageJ 插件）完成。使用 TrackMate 进行自动追踪可高效、无偏地分析大量细胞。然而，在对单个细胞进行精确追踪时，使用 MTrackJ 的手动追踪仍然具有重要价值。

结果

大脑皮层室下区的放射状胶质细胞在E14之前仅产生神经元，在E15和E16则同时产生神经元和胶质细胞。为了同时观察神经元和胶质细胞的迁移行为，我们分别利用神经元特异性启动子T，通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（RFP）对它们进行标记。α1 启动子27以及人胶质纤维酸性蛋白（hGFAP）启动子28，该系统在星形胶质细胞中优先激活。星形胶质细胞前体在迁移过程中会重复进行细胞分裂，导致质粒在细胞中被稀释。为避免这一问题，采用了转座子载体系统，包括供体质粒（pPB）和转座酶表达载体（pCAG-hyPBase）。29,30使用的供体质粒（pPB-CAG-LNL-RFP）含有loxP-neo-loxP（LNL）表达盒，并可根据Cre重组酶的表达情况表达RFP。将指定质粒电转至ICR小鼠（野生型；WT）中 图 2A 在E15时取材，3天后制备脑片。在此期间，第一群EGFP+ 神经元到达皮质板表面（图2B），但许多EGFP+ 神经元仍在迁移。进行了持续24小时的延时观察。在此期间，具有粗大 Leading Process 的神经元以相对恒定的速度沿皮层板直线迁移至脑表面（19.54 ± 6.21 µm/h，均值±标准差，70个细胞）。迁移轨迹通过使用TrackMate软件自动追踪（图中品红色线条） 图2B）。在同一目标视野中，使用RFP对星形胶质细胞前体进行可视化观察（图 2C）。由于hGFAP启动子在胚胎晚期的放射状胶质细胞中也具有活性，因此部分由这些放射状胶质细胞衍生的神经元也表达RFP（图中蓝色箭头所示） 图2B, C）。这些神经元几乎总是转染了EGFP表达载体。因此，星形胶质细胞前体被鉴定为RFP单阳性细胞。 

与神经元不同，星形胶质细胞前体细胞在中间带和皮层板内迁移迅速且随机，方向频繁改变（不规则迁移）5。通过MTrackJ软件手动追踪星形胶质细胞前体细胞的迁移路径（图2C中的品红色线条），结果显示其具有高度运动性（88.37 ± 33.61 µm/h，5个细胞）。为了观察星形胶质细胞前体细胞与血管之间的关系，采用了Flt1-DsRed小鼠，该小鼠的内皮细胞表达DsRed（一种RFP）。在本实验中，星形胶质细胞前体细胞仅通过EGFP进行识别。为此，开发了rDIO系统5，该系统利用Dcx启动子（一种早期神经元特异性启动子）31驱动另一套DNA重组酶及其识别序列（Dre-rox），从而在神经元中消除依赖hGFAP-Cre的EGFP表达（图2D，pPB-CAG-rDIO-EGFP序列见补充文件1）32,33。通过子宫内电穿孔将rDIO系统于E15时期导入Flt1-DsRed小鼠，24小时后制备脑切片。结果观察到EGFP阳性的星形胶质细胞前体细胞沿血管主动迁移（血管导向迁移）5（图2E）。

宫内电穿孔示意图，包含细胞切片制备和延时观察的装置设置。
图1：通过宫内电穿孔标记细胞的延时观察流程。（A）将处于适当发育阶段的怀孕小鼠麻醉后，切开腹腔。手术区域用无菌塑料膜和无菌纸巾覆盖。暴露子宫角，向胚胎注射1 µL质粒混合物，并施加电脉冲。缝合腹壁和皮肤后，将操作后的小鼠放回饲养笼中。（B）将电穿孔后脑组织制备的切片置于玻璃底培养皿中的细胞培养插件滤膜上（最多6片）。将含有切片的玻璃底培养皿安装到培养腔内。该延时成像系统配有丙烯酸罩，覆盖整个显微镜，以维持37 °C的恒温环境。在罩内，培养腔内部设有显微镜载物台，并持续供给加湿的混合气体。请点击此处查看该图的放大版本。

子宫内电穿孔法示意图，用于神经元-星形胶质细胞分化及荧光示踪结果。
图 2：神经元与星形胶质前体细胞的延时观察。（A）神经元（EGFP，绿色）与星形胶质前体细胞（RFP，红色）差异标记方法，以及电穿孔后2天、延时成像开始后2小时制备的脑片代表性图像（右侧）。（B,C）在（A）右侧所示同一视野下，EGFP+（B）和 RFP+ 细胞（C）从2小时到21小时的延时图像。（B）由 TrackMate 软件自动检测的 EGFP+ 迁移细胞轨迹以品红色显示。（C）使用 MTrackJ 软件手动追踪 RFP+ 细胞的轨迹。推测为神经元的 EGFP/RFP 双阳性细胞以蓝色箭头标示。（D）在 Flt1-DsRed 小鼠胚胎中利用 rDIO 系统标记星形胶质前体细胞的策略。（E）血管引导迁移的代表性结果。一个细胞（箭头）伸出前导突起（箭头所示尖端），并沿表达 DsRed 的血管（品红色）向软脑膜表面迁移。CP；皮层板。IZ；中间带。VZ；室管膜区。比例尺：200 µm（A–C），50 µm（E）。本图改编自 Tabata H. 等人5。请点击此处查看该图的放大版本。

神经元（II/III层）星形胶质细胞前体细胞rDIO系统
（星形胶质细胞特异性标记）
pCAG-EGFP0.5 µg/µLpPB-CAG-LNL-EGFP0.5 µg/µLpPB-CAG-rDIO-EGFP0.5 µg/µL
或 Ta1-EGFP（对神经元更具特异性）0.5 µg/µLhGFAP-Cre0.75 µg/µLhGFAP-Cre0.75 µg/µL
pCAG-hyPBase0.5 µg/µLpDcx-Dre0.5 µg/µL
pCAG-hyPBase0.5 µg/µL

表1：针对每个靶点的质粒混合物的代表性组分。 EGFP载体可替换为相应的RFP或其他荧光蛋白表达载体。为标记星形胶质细胞前体细胞，采用转座子载体系统。pPB载体是用于基因组整合的PiggyBac转座子载体。pCAG-hyPBase是PiggyBac转座酶表达载体。LNL是用于Cre依赖性表达的loxP-neo-loxP盒。rDIO-EGFP是EGFP表达的Cre-loxP和Dre-roxP依赖型开关盒。为观察目的基因的功能获得或功能缺失表型，可在体系中加入1 µg/µL的表达载体或敲低载体。这些载体的浓度应根据具体情况调整。

补充文件1：质粒序列。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案介绍了一种对源自脑室带（皮层）VZ的细胞进行延时观察的方法。为了标记从VZ迁移的细胞，我们采用了 在子宫内 电穿孔，其中单个细胞的标记信噪比较高，优于病毒载体介导的标记。使用 在子宫内 电穿孔技术可将任意类型、任意组合的载体轻松导入活体胚胎中的放射状胶质细胞（神经干细胞）。利用不同的启动子可选择性地标记神经元和胶质前体细胞。由于质粒的拷贝数由电穿孔导入 在子宫内 电穿孔效率高，可通过共电穿孔GFP表达载体与多种目的基因相关载体（如过表达载体及基因敲低/敲除载体），便捷地开展功能获得性与功能缺失性研究。此外， 在子宫内 电穿孔可用于将质粒载体导入除大脑皮层室下区以外的其他脑区室下区，从而使得我们能够观察来自神经节隆起的抑制性神经元、少突胶质细胞前体等其他细胞类型的迁移过程34,35,36 海马锥体神经元37.

在延时成像研究中，可利用 TrackMate 和 MTrackJ 软件评估基因获得功能和缺失功能实验对细胞行为的影响。许多基因，包括那些与神经发育障碍和智力障碍相关的基因，均参与神经元迁移过程。延时成像研究能够直接揭示这些基因如何调控细胞行为。与神经元迁移相比，胶质细胞迁移的分子机制尚不明确。该方法不仅可能揭示胶质细胞的正常发育过程，还可能揭示影响胶质细胞发育的遗传和环境因素及其与精神疾病的关系。

该方法的局限性在于其不可避免地依赖于 体外 切片培养法。有趣的是，即使在培养的切片中，迁移的神经元也不会失去向脑表面迁移的方向性信号 体外然而，研究者必须注意可能产生的假象。靠近表面的细胞会附着在滤膜上，且脑片边缘的细胞容易发生形变，这些细胞应排除在分析之外。若条件允许，应设置对照实验。需要注意的是，脑片在制备后约24小时内可重现正常的发育过程。因此，电转后制备脑片的时间应根据所要观察的事件是否发生在此时间窗口内来确定。若要观察多极-双极转化过程，应在电转后2天制备脑片；若分析运动模式下的迁移过程，则以电转后3天制备脑片为宜。观察血管引导的迁移比其他实验更具挑战性，因为缺乏血流的情况下，脑片中的内皮细胞容易降解。为最大限度减少血管降解，脑片应尽快制备，并维持在含有20%血清和40% O₂的培养基中2 气体。其他补充实验，例如固定脑组织的组织学分析或 体内 使用双光子显微镜进行活体成像，可加强在脑片延时分析中获得的观察结果。

总之，该方法是观察细胞行为长达24小时的唯一选择。随着新型质粒载体的开发，该方法的应用范围在未来将进一步扩大。

致谢

Tα1 启动子由 P. Barker 和 F.D. Miller 惠赠。Dcx 启动子由 Q. Lu 惠赠。hGFAP-Cre 由 Albee Messing 惠赠。PiggyBac 转座子载体系统由桑格研究所提供。Flt1-DsRed 小鼠由 M. Ema（滋贺大学）提供。本工作得到日本学术振兴会科研费（JSPS KAKENHI，H. Tabata 项目编号 JP21K07309，K. Nakajima 项目编号 JP20H05688 和 JP22K19365）、武田科学振兴财团、庆应义塾藤泽纪念教育与科研振兴基金以及庆应义塾学术发展基金对 K. Nakajima 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸液管组件德拉蒙德2-040-000
阿替美唑（5 mg/mL）明治Mepatia
自动切片机Becton Dickinson4276309 mm
B27添加剂Gibco17504-044
布托啡诺（5 mg/mL）明治Vetorphale
细胞培养小室MilliporePICM ORG 50
共聚焦显微镜NikonA1RHD25配备长工作距离物镜（S Plan Fluor ELWD 20XC）
冷冻模具Tissue-Tek4566
培养室TokkenTK-NBCMP定制
电穿孔仪NEPA基因NEPA21
快绿Sigma-AldrichF7258
气体混合器托肯TK-MIGM01-02
玻璃底培养皿岩木3910-035玻璃底直径为27 mm
玻璃毛细管NarishigeGD-1
HBS（2倍浓度）Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)和光084-08345
加热单元TokkenTK-0003HU20定制款，包括罩子和加热器
hGFAP-CreAddgene#40591Albee Messing 惠赠
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-谷氨酰胺（200 mM）Gibco25030
低熔点琼脂糖Lonza50100
右美托咪定（1 mg/mL）明治Medetomin
显微注射仪NarishigeIM-300
咪达唑仑（5 mg/mL）Sandoz咪达唑仑
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
pCAG-hyPBase将来自 pCMV-hyPBase（由 Sanger 研究所惠赠）的 hyPBase cDNA 插入 pCAGGS（由 J. Miyazaki 惠赠）中 CAG 启动子的下游。
pDcx-Dre将 Dcx4kbEGFP70（Q. Lu 惠赠）中的 Dcx 启动子替换为 pCAG-NLS-HA-Dre34（Pawel Pelczar 惠赠，Addgene #51272）中的 CAG 启动子。
青霉素 + 链霉素Gibco15140122
质粒纯化试剂盒InvitrogenPureLink HiPure 质粒中量提取试剂盒 (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP将来自 pCALNL-DsRed（Connie Cepko 惠赠，Addgene #13769）的 CAG-LNL 插入片段和 TurboRFP cDNA（Evrogen，FP232）插入至 pPB-CAG.EBNXN（Sanger Institute 惠赠）的克隆位点中。
pPB-CAG-rDIO-EGFP包含合成 rox 位点、合成 DIO 磁带以及反向的 pEGFP-N1（Clontech，U55762）来源的 EGFP cDNA 的序列  被插入到 pPB-CAG.EBNXN（由桑格研究所惠赠）的克隆位点中。序列信息见补充文件。
拉力器NarishigePN-31
StackRedImageJ 的一个插件http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
缝合针纳兹梅C-24-521-R 编号11/2 圆，长度 14 mm
缝合线纳兹梅C-23-B2丝线，5-0号
ICR（野生型）孕鼠（定时交配）日本SLCICR 小鼠
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
镊子型电极BEX 或 NEPA 基因CUY650P5 
Tα1-EGFP将 pEGFP-N1（Clontech，U55762）中的 EGFP cDNA 插入到 T 的下游α质粒253中的1号启动子（由P. Barker和F.D. Miller惠赠）
振动切片机徕卡或蔡司振动切片机 VT1000S 或 Hyrax V50

参考文献

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