需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种改良的小鼠多囊卵巢综合征诱导技术

2.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/66637

⸱

2024年7月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Obstetrics and Gynecology Hospital, Institute of Reproduction and Development, Fudan University, 2Women's Hospital, Key Laboratory of Reproductive Genetics (Ministry of Education), Zhejiang University School of Medicine, 3International Institutes of Medicine, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 4Research Units of Embryo Original Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences (No. 2019RU056), 5State Key Laboratory of Cardiology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种通过微型泵控释来曲唑在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的技术。在充分麻醉条件下，将微型泵皮下植入小鼠体内，经过微型泵一定时间的释放后，成功诱导出小鼠PCOS模型。

摘要

多囊卵巢综合征（PCOS）是导致女性不孕的主要原因之一。动物模型被广泛用于研究PCOS的病因机制及相关药物开发。来曲唑诱导的小鼠模型能够复制PCOS患者的代谢和生殖表型。传统的PCOS小鼠来曲唑给药方法需要在一定时期内每日给药，操作繁琐且可能对小鼠造成显著应激。本研究描述了一种通过植入可控释以来曲唑的微型泵来诱导小鼠PCOS的简便有效方法。研究人员制备了一种可稳定、持续释放定量来曲唑的微型泵，并在麻醉条件下将其皮下植入小鼠体内。本研究表明，植入来曲唑微型泵后，小鼠模型成功模拟了PCOS的特征。本研究中所用材料与设备在大多数实验室中均易于获取，无需特殊定制。综上所述，本文提供了一种独特且易于操作的小鼠PCOS诱导方法。

引言

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性中最常见的疾病之一1。全球多达18%的女性受其影响，是全球女性不孕的主要原因2,3。PCOS 的特征是一系列相互关联的生殖异常，包括促性腺激素分泌紊乱、慢性无排卵、雄激素生成增加以及多囊卵巢形态4。除了妇科疾病外，PCOS 还会增加心血管疾病的风险5,6。尽管已有数十年的研究，PCOS 的病因仍不明确7,8。

为了更深入地了解多囊卵巢综合征（PCOS）的发病机制并开发新的治疗方法，建立能够紧密模拟人类生理状态的动物模型具有重要意义9。目前报道的PCOS啮齿类动物模型包括通过睾酮、来曲唑和戊酸雌二醇等处理诱导的模型。睾酮可引起高雄激素血症，在大鼠中更常被用作PCOS诱导剂10。脱氢表雄酮（DHEA）已被用于在啮齿类动物中诱导PCOS，可升高睾酮水平、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值，并导致动情周期紊乱11。戊酸雌二醇（EV）是一种长效雌激素，使用该方法的研究表明，性类固醇激素和促性腺激素的水平随EV给药剂量的不同而变化12,13,14。来曲唑是一种非甾体芳香化酶抑制剂15。来曲唑处理可导致大鼠出现无周期性动情期、卵巢重量和体重增加、脂肪细胞增大、卵泡发育最大化以及睾酮水平升高16,17。来曲唑处理的小鼠则表现出窦状卵泡和出血性囊肿数量增加，以及黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇和孕酮浓度升高18,19。

目前，来曲唑诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的主要方法包括口服给药和皮下注射，这两种方法均需要每日重复给药20,21,22。这些方法耗时且劳动强度大，反复给药可能对动物造成显著应激23。尽管一些研究使用来曲唑缓释丸24,25，但这类产品需要定制，成本较高。本报告介绍了一种利用微型泵在小鼠中诱导PCOS的技术。该方法操作简便、节省时间，并使用大多数实验室中常见的手术工具和设备。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中的所有动物实验方案均经批准 动物伦理委员会 复旦大学的4周龄雌性C57BL/6J小鼠被用于本研究。本研究中所用动物、试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 微量泵的准备

  1. 取原包装瓶中储存的来曲唑粉末（50 mg），将装有粉末的瓶子在室温下以 300 × g 离心 5 秒，然后打开瓶盖。
  2. 用移液器缓慢加入 625 µL 二甲基亚砜（DMSO）至来曲唑粉末中，充分混匀，得到浓度为 8 mg/100 µL 的储备液，总体积为 625 µL。
    注意：若使用不同包装规格的来曲唑粉末，请预先计算所需 DMSO 体积以配制相应储备液。 来曲唑粉末、DMSO 及其他相关化合物必须为无菌级。移液器吸头、离心管及其他相关物品在使用前应为无菌或已灭菌状态。
  3. 根据实验设计确定所需小鼠数量。
  4. 根据所需小鼠数量，用移液器吸取所需的来曲唑储备液总量，缓慢注入离心管中。
    注意：本实验选用 4 周龄小鼠进行为期 8 周的暴露处理，以建立多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型。每只小鼠总给药剂量为 8 mg，需连续植入两个缓释泵（每个泵释放 4 周），即每个泵给药 4 mg/4 周。如步骤 1.2 所述，来曲唑储备液浓度为 8 mg/100 µL。根据以下计算，每个泵需 50 µL 储备液：4 mg ÷ (8 mg/100 µL)。
  5. 用移液器吸取等体积的 PEG300，加入到来曲唑溶液中，并充分混匀（可适当涡旋混合）。
  6. 为对照组配制对照溶剂溶液（每个泵使用不含来曲唑的 50 µL DMSO + 50 µL PEG300）。
  7. 根据所需缓释泵数量，准备足量无菌离心管；每个泵需准备一个 15 mL 离心管。
  8. 用注射器吸取生理盐水，向每个离心管中加入 5 mL 生理盐水。盖上管盖，将离心管置于试管架上备用。
  9. 佩戴一副新的无菌手套，取出所需数量的微型缓释泵，放置于洁净无菌的操作台面或容器中。
  10. 用拇指和食指轻轻夹住与泵体匹配的帽盖，另一只手握住泵体。
  11. 用连接在帽盖上的细管轻轻多次穿刺泵的填充口（图 1B）。
    注意：若未疏通，填充后液体可能无法在管内自由流动。
  12. 取与泵配套的针头和一支 1 mL 无菌注射器。将针头连接至注射器并拧紧（图 1C）。
  13. 用新组装的注射器小心且缓慢地吸取上述配制好的来曲唑终溶液（图 1D）。
    注意：吸取来曲唑溶液时应缓慢且均匀。快速吸取可能产生气泡，影响后续药物溶液的注射。
  14. 将来曲唑溶液注入微型缓释泵中。
    1. 一只手小心夹住微型缓释泵使其直立，另一只手持上述 1 mL 注射器，缓慢插入泵体最底部（图 1E）。
      注意：若针头未插入泵体底部，注射过程中泵内液体易产生气泡，影响后续药物释放。
    2. 然后缓慢注入配制好的溶液；当泵口出现轻微冒泡时，表明正在注入。
    3. 当注射量接近 90 µL 时，进一步减慢注射速度。当泵完全充满（约 100 µL）后，拔出注射器。
    4. 小心将帽盖插入泵体并拧紧；此时会有少量溶液溢出，需小心擦拭干净。
  15. 将载药后的缓释泵出口朝上（即带帽盖的一端），取之前准备好的离心管，将泵完全浸入无菌生理盐水中（图 1F）。然后盖上管盖，置于试管架上。
    注意：整个操作过程中应避免污染缓释泵。
  16. 所有微型缓释泵制备完成后，将所有离心管置于 37 °C 恒温箱中孵育 48 小时。

2. 手术与麻醉的准备工作

  1. 在手术当天准备并灭菌所有所需器械，包括镊子、止血钳、手术剪、持针器和4-0可吸收手术缝线。
  2. 使用异氟烷麻醉机前（图2B），仔细检查管道连接是否正确，并确保管道完好无泄漏。
  3. 拧开麻醉机蒸发器上的加药密封盖，然后缓慢加入麻醉剂。
  4. 保持麻醉剂液面位于麻醉机标注的上下限之间。
  5. 转换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流与麻醉诱导箱相连。
  6. 打开气泵和蒸发器，调节异氟烷浓度以进行麻醉诱导（通常为3%-4%）。
  7. 等待约1分钟，待麻醉气体充满诱导箱后，将小鼠放入诱导箱内，直至完全麻醉（此过程约需2-3分钟）。
  8. 通过轻轻倾斜 诱导箱检查小鼠是否充分麻醉。若小鼠翻转后无恢复俯卧姿势的迹象，则表明麻醉已生效。

3. 来曲唑微型泵的植入

  1. 戴上外科口罩和无菌手套。
  2. 将预先麻醉的小鼠从诱导箱中取出，在小鼠背部涂抹脱毛膏，静置1分钟。用湿纱布轻轻擦去脱毛膏及毛发。
  3. 同时，切换三通阀开关，确保麻醉机蒸发器的气流连接至麻醉面罩，并调节维持浓度（通常为2%）。
  4. 脱毛后，用优势手握住小鼠，将其头部/鼻部放入麻醉面罩中。
  5. 通过测试足底回缩反射检查麻醉深度。
    注意：所有涉及麻醉的操作必须使用装有活性炭片的气体过滤器，并在通风橱内进行。
  6. 将小鼠俯卧位固定于手术板上，并在双眼涂抹眼用润滑剂。
  7. 用聚维酮碘棉签对暴露的皮肤擦拭三次（图2C）。然后，皮下注射美洛昔康，剂量为2 mg/kg。 
  8. 再次通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。随后，在颈背部正中线处，偏向无毛侧皮肤，用镊子提起皮肤，用手术刀或手术剪横向切开约0.5 cm（图2D）。
  9. 然后打开切口下方的表皮，使用止血钳或持针器分离皮下组织，为微型泵预留空间（距离切口约2 cm处）（图2E）。
  10. 用无菌镊子从离心管的生理盐水中取出泵，使泵的开口端朝下，准备将泵植入小鼠皮下（图2F）。
  11. 用镊子夹住一侧皮肤切口，将泵推入皮下腔隙。植入时应无明显阻力。进入皮下后，用手指轻微而轻柔地将泵向内挤压至尽可能深的位置（图1G）。
  12. 使用4-0外科缝线仔细缝合切口部位（图2H）。
    注意：缝合时注意避免损伤皮下泵体。
  13. 缝合后，用碘伏棉签对手术部位皮肤消毒两次。

4. 动物恢复

  1. 手术后，将小鼠从麻醉期间使用的垫子上轻轻转移到干燥、清洁的垫子上。确保小鼠处于温暖且安静的环境中。
  2. 密切监测小鼠的状况，例如呼吸的深度和频率。
  3. 观察小鼠活动能力恢复过程中的行为表现。最终确保它们能够站立并行走，且无明显异常行为，如头晕或运动不协调。
  4. 小鼠恢复后，将其轻轻转移至预先准备好的笼子中。在笼底放置无菌果冻和食物供其摄食。 
    注意：手术部位的拉伸可能影响小鼠在术后早期饮水和进食，因此需将果冻和食物放置于笼底。
  5. 皮下注射美洛昔康，剂量为 2 mg/kg（术后前 3 天每 24 小时一次）。在来曲唑治疗 8 周后（即连续两次微型泵植入），对小鼠模型进行检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

实验方案及部分关键步骤见图1和图2。血清睾酮水平显示在图3A中。来曲唑微型泵处理的小鼠（以下简称LTZ小鼠）血清睾酮水平显著高于雌性对照小鼠。同时，卵巢组织学分析显示，LTZ小鼠出现多囊卵巢，并且黄体数量显著减少（图3B、C），提示无排卵。此外，与雌性对照小鼠相比，LTZ小鼠表现出显著的动情周期紊乱（图3D）。体重评估结果显示，LTZ小鼠体重高于对照小鼠（图3E）。葡萄糖耐量试验结果及AUC计算表明，与对照小鼠相比，LTZ小鼠出现葡萄糖耐受不良（图3F、G）。血清脂质检测显示，LTZ小鼠的血清脂质谱较对照小鼠发生改变（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本报告展示了一种使用易得材料在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）的简单方案。小鼠PCOS模型对于探索PCOS的发病机制及药物筛选至关重要26。在现有的多种小鼠PCOS建模方法中，来曲唑诱导法是最常用的方法之一。来曲唑可通过抑制睾酮向雌二醇的转化或促进睾酮合成，从而建立并维持高雄激素状态27。来曲唑诱导的小鼠模型在代谢和生殖特征方面与PCOS患者具有相似性28。然而，传统的小鼠来曲唑处理方法需要连续21天或更长时间每日口服给药或注射29,30。长期、定时的给药过程耗时且劳动密集，反复给药对小鼠造成显著应激，可能引入影响模型结果的非实验性干扰因素23,31。尽管部分大鼠和小鼠PCOS研究已采用可植入的来曲唑缓释丸28<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得以下基金资助：中国国家重点研发计划（项目号 2021YFC2700701）、国家自然科学基金（项目号 82088102、82071731、82171613、8227034、81601238）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（项目号 2019-I2M-5-064）、上海市科学技术委员会（项目号 21Y11907600）、上海市卫生健康委员会和计划生育委员会（项目号 20215Y0216）、上海市卫生健康委员会协同创新项目（项目号 2020CXJQ01）、上海医院发展中心临床研究计划（项目号 SHDC2020CR1008A）、上海市妇科疾病临床研究中心（项目号 22MC1940200）、上海市泌尿系统疾病研究中⼼（项目号 2022ZZ01012）、上海市生殖与发育前沿科学研究基地、衢州市科学技术局（项目号 2022K54）、浙江大学教育部生殖遗传重点实验室开放基金项目（项目号 KY2022035）以及广东省医学科学院开放基金项目（项目号 YKY-KF202202）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
注射器Bofeng BiotechBD3008411ML（无菌）
离心管Biological Hope1850-K15ML（无菌）
移液器Eppendorf3123000268-A100μL-1000μL（无菌）
移液器TopPette701010100810μL-100μL（无菌）
来曲唑粉末SigmaL6545-50MG主要作用药物（无菌）
PEG（聚乙二醇）SolarbioP8250用于溶解（无菌）
无菌生理盐水溶液BiosharpBL158A微型泵储存
渗透泵ALZET1004来曲唑储存与缓释（无菌）
二甲基亚砜BiosharpBS087用于溶解（无菌）
小动物麻醉机RWD R500IP用于麻醉
异氟烷 RWD20071302用于麻醉
止血钳BiosharpBS-HF-S-125手术器械
剪刀BiosharpBS-SOR-S-100P手术器械
持针器ShangHaiJZJ32010手术器械
镊子RWD F12028手术器械
缝合针与4-0可吸收缝线JINGHUANCR413手术器械
聚维酮碘棉签SingleLadyGB26368-2010皮肤消毒
脱毛膏ZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701 实验动物脱毛剂
丁腈手套BiosharpBC040-L用于无菌操作
无菌纱布ZHENDEBA69087用于擦拭液体
C57BL/6J 小鼠上海模型生物中心N/A年龄：4周
宠物眼润滑剂BAITESHF021153用于小鼠眼部润滑
美洛昔康注射液MEIDAJIAR21064-21用于小鼠镇痛（无菌）

参考文献

  1. Dapas, M., Dunaif, A. Deconstructing a syndrome: Genomic insights into PCOS causal mechanisms and classification. Endocr Rev. 43 (6), 927-965 (2022).
  2. Teede, H., et al. Anti-müllerian hormone in PCOS: A review informing international guidelines. Trends Endocrinol Metab. 30 (7), 467-478 (2019).
  3. Joham, A. E., et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (9), 668-680 (2022).
  4. Pan, J. X., et al. Aberrant expression and DNA methylation of lipid metabolism genes in PCOS: A new insight into its pathogenesis. Clin Epigenetics. 10, 6(2018).
  5. Gao, L., et al. Calcitriol attenuates cardiac remodeling and dysfunction in a murine model of polycystic ovary syndrome. Endocrine. 52 (2), 363-373 (2016).
  6. Gao, L., et al. Polycystic ovary syndrome fuels cardiovascular inflammation and aggravates ischemic cardiac injury. Circulation. 148 (24), 1958-1973 (2023).
  7. Rosenfield, R. L., Ehrmann, D. A. The pathogenesis of polycystic ovary syndrome (PCOS): The hypothesis of PCOS as functional ovarian hyperandrogenism revisited. Endocr Rev. 37 (5), 467-520 (2016).
  8. Wang, F., et al. Alternative splicing of the androgen receptor in polycystic ovary syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (15), 4743-4748 (2015).
  9. Noroozzadeh, M., Behboudi-Gandevani, S., Zadeh-Vakili, A., Ramezani Tehrani, F. Hormone-induced rat model of polycystic ovary syndrome: A systematic review. Life Sci. 191, 259-272 (2017).
  10. Tyndall, V., et al. Effect of androgen treatment during foetal and/or neonatal life on ovarian function in prepubertal and adult rats. Reproduction. 143 (1), 21-33 (2012).
  11. Jang, M., et al. Oriental medicine Kyung-ok-ko prevents and alleviates dehydroepiandrosterone-induced polycystic ovarian syndrome in rats. PLoS One. 9 (2), e87623(2014).
  12. Brawer, J. R., Munoz, M., Farookhi, R. Development of the polycystic ovarian condition (PCO) in the estradiol valerate-treated rat. Biol Reprod. 35 (3), 647-655 (1986).
  13. Mirabolghasemi, G., Kamyab, Z. Changes of the uterine tissue in rats with polycystic ovary syndrome induced by estradiol valerate. Int J Fertil Steril. 11 (1), 47-55 (2017).
  14. Li, X., et al. Amitriptyline plays important roles in modifying the ovarian morphology and improving its functions in rats with estradiol valerate-induced polycystic ovary. Arch Pharm Res. 42 (4), 344-358 (2019).
  15. Mamounas, E. P., et al. Use of letrozole after aromatase inhibitor-based therapy in postmenopausal breast cancer (NRG oncology/NSABP B-42): A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 88-99 (2019).
  16. Deveci, H. S., et al. Histological evaluation of rat larynx in experimental polycystic ovary syndrome model. Eur Arch Otorhinolaryngol. 269 (8), 1945-1950 (2012).
  17. Du, D. F., Li, X. L., Fang, F., Du, M. R. Expression of anti-müllerian hormone in letrozole rat model of polycystic ovary syndrome. Gynecol Endocrinol. 30 (12), 885-889 (2014).
  18. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The gut microbiome is altered in a letrozole-induced mouse model of polycystic ovary syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509(2016).
  19. Arroyo, P., Ho, B. S., Sau, L., Kelley, S. T., Thackray, V. G. Letrozole treatment of pubertal female mice results in activational effects on reproduction, metabolism and the gut microbiome. PLoS One. 14 (9), e0223274(2019).
  20. Pyun, B. J., et al. Tetragonia tetragonioides (pall.) Kuntze regulates androgen production in a letrozole-induced polycystic ovary syndrome model. Molecules. 23 (5), 1173(2018).
  21. Patel, R., Shah, G. Insulin sensitizers modulate GNRH receptor expression in PCOS rats. Arch Med Res. 49 (3), 154-163 (2018).
  22. Chaudhari, N., Dawalbhakta, M., Nampoothiri, L. GNRH dysregulation in polycystic ovarian syndrome (PCOS) is a manifestation of an altered neurotransmitter profile. Reprod Biol Endocrinol. 16 (1), 37(2018).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Lee, Y. H., et al. Welsh onion root (Allium fistulosum) restores ovarian functions from letrozole induced-polycystic ovary syndrome. Nutrients. 10 (10), 1430(2018).
  25. Yang, H., et al. Traditional medicine (mahuang-tang) improves ovarian dysfunction and the regulation of steroidogenic genes in letrozole-induced PCOS rats. J Ethnopharmacol. 248, 112300(2020).
  26. Corrie, L., et al. Recent updates on animal models for understanding the etiopathogenesis of polycystic ovarian syndrome. Life Sci. 280, 119753(2021).
  27. Corbin, C. J., Trant, J. M., Walters, K. W., Conley, A. J. Changes in testosterone metabolism associated with the evolution of placental and gonadal isozymes of porcine aromatase cytochrome p450. Endocrinology. 140 (11), 5202-5210 (1999).
  28. Ryan, G. E., Malik, S., Mellon, P. L. Antiandrogen treatment ameliorates reproductive and metabolic phenotypes in the letrozole-induced mouse model of PCOS. Endocrinology. 159 (4), 1734-1747 (2018).
  29. Bhattarai, P., Rijal, S., Bhattarai, J. P., Cho, D. H., Han, S. K. Suppression of neurotransmission on gonadotropin-releasing hormone neurons in letrozole-induced polycystic ovary syndrome: A mouse model. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1059255(2022).
  30. Annie, L., Gurusubramanian, G., Roy, V. K. Inhibition of visfatin by fk866 mitigates pathogenesis of cystic ovary in letrozole-induced hyperandrogenised mice. Life Sci. 276, 119409(2021).
  31. Mcdonald, L. T., et al. Early blood profile of C57BL/6 mice exposed to chronic unpredictable stress. Front Psychiatry. 10, 230(2019).
  32. Torres, P. J., et al. Exposure to a healthy gut microbiome protects against reproductive and metabolic dysregulation in a PCOS mouse model. Endocrinology. 160 (5), 1193-1204 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

多囊卵巢综合征小鼠模型来曲唑微型泵可控药物释放皮下植入血清睾酮葡萄糖耐受不良卵巢组织学代谢紊乱心血管疾病
一种改良的小鼠多囊卵巢综合征诱导技术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。