轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

摘要

通过在不同时间点向小鼠注射两种荧光染料，建立了一种可视化血脑屏障（BBB）破坏所致染料外渗的方法。使用甘油作为冷冻保护剂，有助于在同一组织样本上进行免疫组织化学染色。

摘要

荧光染料用于评估血脑屏障（BBB）破坏所导致的染料外渗程度。使用这些染料进行标记是一个受多种因素影响的复杂过程，包括血液中染料的浓度、脑血管的通透性、染料外渗的持续时间，以及由于降解和扩散导致组织中染料浓度降低等。在轻度创伤性脑损伤模型中，暴露于爆炸诱导的冲击波（BSWs）会在有限的时间窗口内引发血脑屏障的破坏。为了确定血脑屏障破坏的精确时序，研究人员在不同时间点将伊文思蓝和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖通过血管内和心脏注射的方式注入小鼠体内。随后记录脑切片中染料荧光的分布情况。两种染料在分布模式和强度上的差异揭示了血脑屏障破坏的时空序列。对脑切片进行免疫染色显示，星形胶质细胞和小胶质细胞的反应与血脑屏障破坏部位相吻合。该方案在涉及不同血脑屏障破坏模型的研究中具有广泛的应用潜力。

引言

血脑屏障（BBB）的破坏和功能障碍可由全身性炎症、感染、自身免疫性疾病、损伤以及神经退行性疾病引起¹。在因暴露于爆炸诱导的冲击波（BSWs）所致的轻度创伤性脑损伤（mTBI）中，BSWs强度与血脑屏障破坏引起的荧光染料渗漏量之间存在显著相关性^2,3,4。mTBI中血脑屏障破坏的一个显著特征是，其在暴露于BSWs后立即或数小时内即开始发生，通常为一过性过程，持续约一周，随后出现迟发性慢性神经系统疾病^3,5,6,7。尽管其具体机制尚不明确，血脑屏障破坏是长期病理级联反应的一部分，并可能在mTBI中作为预后因素发挥作用⁶。因此，了解血脑屏障破坏在脑内的空间和时间分布具有重要意义。

荧光染料可用于评估血脑屏障（BBB）破坏的程度^3,8。由于染料在血液中的浓度以及血脑屏障破坏的幅度和范围会随时间变化，因此在解读染料外渗图像时需格外谨慎。例如，未观察到染料外渗并不一定意味着不存在血脑屏障破坏。在染料血液浓度升高之前或之后，可能无法检测到血脑屏障的破坏。即使染料已在血脑屏障受损部位成功聚集，但在屏障功能恢复后，染料可能随时间逐渐流失。通常情况下，水溶性且生物学惰性的物质会迅速通过尿液排出⁹。因此，为了确定在特定时间点是否发生血脑屏障破坏，最可靠的方法是在动物固定前短时间内将荧光染料注入血液循环。应采用 commercially available 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖，并选择特定分子量的产品进行此类实验。

伊文思蓝是一种广泛认可的蓝色偶氮染料，对血清白蛋白具有强亲和力。在生物系统中，该染料在绿光激发下会发出红色荧光²。由于其惰性特性，伊文思蓝-血清白蛋白复合物可在血液中存留长达2小时，因此可作为69 kDa的示踪剂，在至少该时间段内标记血脑屏障（BBB）受损的区域^10,11。因此，有必要考虑伊文思蓝在药代动力学和毒性方面可能存在的不确定性⁹。然而，最近一项研究表明，伊文思蓝会在血脑屏障缺失或受损的区域持续积累⁷。这一特性使得伊文思蓝能够记录血脑屏障破坏的历史过程，而异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）则用于记录暴露于BSW后特定时间点的血脑屏障破坏情况。尽管伊文思蓝可通过静脉或腹腔注射给药¹⁰，但在对时间敏感的实验中，首选静脉注射途径。本研究旨在展示利用伊文思蓝和FITC-dextran检测暴露于BSW后血脑屏障破坏时空分布的方法。

其次，该研究提出了一种在观察血脑屏障（BBB）破坏的荧光信号后，对脑组织切片进行冷冻并制备适用于免疫组织化学检测的较薄切片的技术。使用甘油作为封片介质和冷冻保护剂，可简化免疫组织化学操作流程。通过将血脑屏障破坏的图像与免疫组织化学结果进行比较，可将同一组织样本中血脑屏障破坏的时间-空间分布与其组织学反应相关联。

方案

所有实验均按照日本国家防卫医科大学校（Tokorozawa，日本）制定的动物实验伦理准则进行。研究方案已获国家防卫医科大学校动物研究委员会批准（批准号：23011-1）。本研究使用8周龄、体重19–23 g的雄性C57BL/6J小鼠。如图1所示，在单次BSW暴露前后的不同时间点进行单次伊文思蓝注射和FITC-葡聚糖灌注。所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 麻醉

注意：此为改良方案，与原始方案相比，右美托咪定的用量增加了2.5倍¹²。盐酸右美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺的剂量分别为0.75 mg/kg、4 mg/kg和5 mg/kg。

1. 在生理盐水中配制盐酸美托咪啶（75 µg/mL）、咪达唑仑（400 µg/mL）和布托啡诺（500 µg/mL）的混合溶液。
2. 通过腹腔注射给予该混合溶液以麻醉小鼠（10 µL/g）¹³。
3. 约5–10分钟后，通过观察尾部夹捏和足底回缩反射的消失来确认麻醉是否充分。
4. 在小鼠从麻醉作用中恢复期间，保持其体温温暖。

2. BSW 暴露

注意：本研究使用了自制的激波管¹⁴。

1. 按照步骤1所述方法对小鼠进行麻醉。
2. 将小鼠置于冲击管出口端5 cm处，确保其身体轴线与冲击管轴线平行但不重叠。
3. 对头部施加一次峰值超压为25 kPa的BSW暴露。
   注意：在小鼠从麻醉中恢复期间应保持其体温。定期监测处理后小鼠的状态。若观察到痛苦迹象，例如进食或饮水困难、弓背、持续异常外观且无恢复迹象，应实施安乐死并提前终止实验。避免使用镇痛药，因其可能影响胶质细胞反应。

3. 尾静脉注射伊文思蓝

注意：伊文思蓝溶液应静脉注射给药，且无需麻醉。在麻醉状态下，染料通常无法充分渗透至全身，这可能是由于血压和体温降低所致¹³。伊文思蓝的给药剂量为 100 mg/kg。

1. 在微量离心管中配制伊文思蓝溶液（4% w/v，生理盐水溶解），涡旋混匀后避光保存备用。
2. 将溶液经尾静脉注射（2.5 µL/g）¹³。

4. 使用FITC-葡聚糖溶液进行心脏灌注及固定

1. 将肝素加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，使其浓度达到 1 U/mL，然后向含肝素的 PBS 中加入 FITC-葡聚糖，使其浓度达到 3 mg/mL。
2. 使用前需确保 FITC-葡聚糖粉末完全溶解。为此，轻轻振荡溶液至少 30 分钟。使用前仔细检查是否存在未溶解的 FITC-葡聚糖粉末。如有残留，继续振荡直至完全溶解。
3. 按照步骤 1 所述方法对小鼠进行麻醉。
4. 使用蠕动泵按照标准灌注固定程序进行操作^15,16。首先以 4.0 mL/min 的流速灌注含 FITC-葡聚糖的肝素化 PBS 溶液 2 分钟；随后以 4.0 mL/min 的流速灌注 10% 中性缓冲福尔马林溶液或 4% 多聚甲醛-PBS 溶液 2 分钟，接着以 3.5 mL/min 的流速继续灌注 8 分钟。
5. 使用手术剪刀和镊子小心取出脑组织^15,16。解剖后，将脑组织在相同的固定液（即 10% 中性缓冲福尔马林溶液或 4% 多聚甲醛-PBS）中于 4 °C 下后固定过夜。
6. 次日，将固定液更换为 PBS。

5. 脑组织处理

注意：即使灌注固定已完成，伊文思蓝和荧光素异硫氰酸盐-葡聚糖仍可能扩散到缓冲液中。因此，从开始到步骤6.8的实验操作应在灌注固定后一周内完成。此外，应避免将样品暴露于光照下。

1. 在24孔板的每个孔中加入500 µL含20%甘油的磷酸缓冲液（PB；pH 7.4）。
2. 使用脑组织切片器将脑组织冠状切为12片，每片厚度为1 mm。
3. 将每一片脑组织转移至24孔板中对应的孔内，于4 °C下保存至少2小时。
4. 将溶液更换为50%甘油-PB，于4 °C下继续保存至少2小时。
5. 最后，将溶液更换为100%甘油。若需立即进行显微观察，将脑片在室温下静置至少2小时，或继续在4 °C下保存。此时脑片已呈半透明状态，可进行显微观察。

6. 荧光法测定染料外渗

注意：荧光标记效率因小鼠而异。因此，需要对荧光强度进行归一化处理。荧光值以巨细胞网状核（GRN）内的荧光强度为参照进行相对表达，因为该区域受 BSW 处理的影响最小。

1. 在35 mm玻璃底培养皿底部加入500 µL甘油。
2. 将切片转移至甘油溶液中，并用盖玻片覆盖其表面。
3. 去除盖玻片边缘多余的甘油。
4. 在荧光显微镜下测量切片的荧光强度。
5. 显微测量完成后，将切片放回孔中。
6. 对全部12个切片重复测量。
7. 向每个孔中加入500 µL磷酸盐缓冲液（PB），并将24孔板在4 °C下过夜保存；次日，切片将被50%甘油-PB溶液充分浸润。
8. 将溶液更换为30%甘油-PB，并在4 °C下保存至少2小时。
9. 在接下来的几周内完成第7步中的操作。

7. 冷冻切片与免疫组织化学

1. 在24孔板的第1孔中加入1000 µL组织冷冻介质与30%甘油-PB等体积混合液，然后在第2孔中加入1000 µL组织冷冻介质。
2. 将组织切片转移至第1孔，在4 °C条件下振荡孵育1小时。
3. 将组织切片转移至第2孔，在4 °C条件下振荡孵育1小时。
4. 使用干冰预冷的异戊烷快速冷冻切片，注意避免切片弯曲。将切片于-80 °C保存，直至进行冷冻切片。
5. 将切片进行冷冻切片，厚度为6 µm。在载玻片上干燥后，于-80 °C保存切片。
6. 抗原修复¹⁷：将切片浸入10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，加热至100 °C一次，随后在98 °C维持1小时。
7. 用蒸馏水充分洗涤切片。此时切片已准备好进行免疫组织化学染色。

结果

图1A 显示了染料注射的时间进程与BSW起始的关系，其中峰值超压为25 kPa。在“Post”方案中，伊文思蓝溶液在FITC-葡聚糖灌注前2小时通过血管内给药，而FITC-葡聚糖灌注分别在BSW暴露后6小时、1天、3天和7天进行。在“Pre”方案中，伊文思蓝溶液在BSW暴露前立即注射。在“Post”方案中，预计伊文思蓝的浓度在灌注固定前约2小时达到峰值；而在“Pre”方案中，其浓度预计在BSW暴露时达到峰值（图1B）。在灌注期间，脑血管中FITC-葡聚糖的浓度在2分钟内保持恒定。

伊文思蓝标记显示，血脑屏障破坏在BSW暴露后6小时内开始，并持续至7天后（图2A）。值得注意的是，血脑屏障破坏并未在BSW暴露后立即发生，因为在“Pre”方案中，3小时时未见伊文思蓝染料外渗（图2B）。令人意外的是，长期伊文思蓝标记表明其在“Pre”方案中具有累积性（图2B）⁷。

使用两种不同的染料，每种染料间隔2小时或更长时间引入，可通过比较它们的分布来检测血脑屏障完整性的时序变化。图3展示了脑组织切片的荧光图像，显示出伊文思蓝与异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖在分布上存在显著差异。

观察到多个大小不一的荧光热点。尽管某些热点的亮度足以进入像素强度最高的0.1%之列，但许多热点仅比周围组织略亮。两种染料之间的差异表明，在此时间间隔内发生了变化。仅显示伊文思蓝荧光的热点表明，在注射伊文思蓝时血脑屏障（BBB）正处于破裂状态，随后在注射FITC-葡聚糖时已得到修复。相反，仅显示FITC-葡聚糖荧光的热点提示，血脑屏障的破坏发生在两次染料注射之间。最后，同时显示两种染料荧光的热点表明，在整个注射期间血脑屏障持续处于破裂状态。

图4A展示了伊文思蓝阳性热点数量（包括仅伊文思蓝阳性以及伊文思蓝/FITC-葡聚糖双阳性热点）、FITC-葡聚糖阳性热点数量（包括仅FITC-葡聚糖阳性以及伊文思蓝/FITC-葡聚糖双阳性热点），或同时对两种染料阳性热点数量（仅伊文思蓝/FITC-葡聚糖双阳性热点）。在“Pre”方案的3小时时间点，观察到大量仅FITC-葡聚糖阳性的热点。在“Post”方案的6小时和1天时间点，检测到仅伊文思蓝阳性和仅FITC-葡聚糖阳性的热点。然而，在“Post”方案的3天和7天时间点，热点主要表现为对两种染料均呈阳性。这些结果表明，血脑屏障（BBB）在暴露于BSW后3小时发生破坏，至1天时开始重塑，并持续至7天后（图4B）。重要的是，如前所述，BBB破坏的程度在7天时呈下降趋势。

在完成染料外渗实验后，对脑组织切片进行了免疫组织化学染色⁷。免疫组织化学图像扫描结果始终与染料外渗图像进行对比，证实荧光物质的残留效应实际上可忽略不计⁷。如图5所示，反应性星形胶质细胞簇与血脑屏障（BBB）破坏部位密切相关。进一步观察发现，在BSW暴露后3天，活化的变形虫样小胶质细胞与反应性星形胶质细胞共存。

图1：实验设计。（A）实验的时间进程。在暴露于冲击波（BSW）之后（“Post”方案）或立即之前（“Pre”方案）静脉注射伊文思蓝溶液，而FITC-葡聚糖在固定前经心脏灌注2分钟。（B）在“Post”和“Pre”方案中，血管内伊文思蓝和FITC-葡聚糖的预期浓度。BSW，爆炸诱导冲击波；FITC，异硫氰酸荧光素。该图改编自Nishii等人的研究⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：脑切片中荧光强度的比较。 对全部12个脑切片中亮度最高的0.1%像素的荧光强度进行评估，并比较“给药后”（A）与“给药前”（B）条件下的差异。图中显示了差异的变异性及显著性。xxx 表示 p < 0.001；xxxx 表示 p < 0.0001（p 值来源于 F检验）。*p < 0.05；****p < 0.0001（采用Dunnett多重比较事后检验的方差分析）。本图改编自Nishii等人的研究⁷。 请点击此处查看本图的高清版本。

图3：通过伊文思蓝和FITC-葡聚糖双标记法在不同时间点观察到的血脑屏障破坏情况。 显示伊文思蓝（品红色）、FITC-葡聚糖（绿色）以及合并图像。左侧展示了染料注射方案。某些热点区域主要显示伊文思蓝荧光（箭头）或FITC-葡聚糖荧光（箭头头）。星号标记脉络丛及相关血管。BBB，血脑屏障；FITC，异硫氰酸荧光素；CVO，第三脑室周围的室周器官。比例尺：1 mm。本图改编自Nishii等人的研究⁷。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：荧光热点的定量分析。（A）伊文思蓝（品红色）、FITC-葡聚糖（绿色）以及两种染料均阳性（灰色）的热点数量。数据来源于“Pre”方案中3小时获取的图像，以及“Post”方案中6小时、1天、3天和7天获取的图像。从3小时到1天，有相当一部分荧光热点表现出染料间的不匹配现象；而从3天到7天，这种不匹配几乎不再出现。（B）血脑屏障破坏时间进程的示意图。纵轴概念上表示由于血脑屏障破坏导致的染料渗漏强度。从3小时到1天的锯齿状模式表明在此期间染料渗漏的位置和强度不稳定。FITC，异硫氰酸荧光素；BBB，血脑屏障；BSW，爆炸诱导冲击波。本图改编自Nishii等人的研究⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

图5：GFAP 和 Iba1 分别作为星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物表达情况。 本图每列均包含伊文思蓝或 FITC-葡聚糖渗漏染料的荧光图像，以及 GFAP 或 Iba1 的免疫组织化学图像。颜色条表示使用颗粒网状核（GRN）内信号归一化的伊文思蓝和 FITC-葡聚糖的荧光强度。染料注射方案显示在左侧。“Pre”方案中1天的切片显示伊文思蓝和 FITC-葡聚糖均有荧光，而“Pre”方案中3天的切片仅显示伊文思蓝的荧光（箭头）。染料渗漏图像中标记箭头所指区域与免疫组织化学图像中的区域相对应。箭头指示反应性星形胶质细胞的聚集。多克隆 GFAP 抗体标记了白质内部及周围区域以及软脑膜邻近神经组织中的星形胶质细胞。因此，本图中标记了深部脑白质（dcw）内部及附近的星形胶质细胞。Iba1 列中标记框或箭头所指示区域的放大图像显示在插图中。比例尺：染料渗漏图像为 1 mm，免疫组织化学图像为 200 µm。GFAP，胶质纤维酸性蛋白；Iba1，离子化钙结合接头分子1；FITC，异硫氰酸荧光素；BSW，爆炸诱导冲击波；dcw，深部脑白质。本图改编自 Nishii 等人⁷。请点击此处查看本图的放大版本。

讨论

采用伊文思蓝和荧光素异硫氰酸盐-葡聚糖双标记新技术，可精确可视化单个大脑中血脑屏障破坏的时空分布。在低强度冲击波模型中，所检测的大脑在染料外渗的范围、位置和程度上均表现出明显差异（图2 和 图3）。染料之间的不匹配显示，血脑屏障破坏始于冲击波暴露后约3小时，第1天开始出现显著的结构重塑，并持续至第7天（图4）。在严重情况下，活化的小胶质细胞被募集至血脑屏障破坏部位，且反应性星形胶质细胞簇与这些区域密切相关（图5）。通过对用于染料外渗分析的同一脑切片进行免疫组织化学染色，建立了胶质细胞反应与染料外渗之间的精确对应关系。更多详细数据与分析请参见Nishii等人的研究⁷。

由于FITC-葡聚糖在灌注固定前以恒定浓度、相同持续时间进行灌注，因此染料的分布和强度很可能准确反映了灌注固定时血脑屏障（BBB）破坏的程度。然而，先前已有报道表明，在低强度BSW模型中，FITC-葡聚糖的荧光信号往往较弱⁷。使用伊文思蓝进行更长时间的标记具有优势，因其能够检测到更细微的血脑屏障破坏变化（图2）。然而，由于标记时间较长，在解读伊文思蓝的荧光图像时需谨慎。伊文思蓝的血液浓度在注射后立即达到最高，并在数小时内逐渐下降（图1）¹¹。推测标记强度与血脑屏障破坏的严重程度和持续时间以及血液中伊文思蓝的浓度相关；但一旦血脑屏障开始修复，标记强度将呈指数级下降。所有这些因素在不同时间点及不同实验之间均存在差异。因此，不应仅依据单张染料外渗图像得出结论，必须进行统计学分析。

根据实验目的，改变染料的分子量及其组合可能是有意义的。本研究中使用了伊文思蓝（Evans Blue）与FITC-葡聚糖的组合。伊文思蓝与血清白蛋白结合后，其行为类似于69-kDa的示踪剂，而本研究中使用的40-kDa FITC-葡聚糖在显示血脑屏障（BBB）破坏程度方面与伊文思蓝相似。通过使用发射不同荧光的染料组合，系统地研究了血脑屏障破坏的空间和时间分布⁷。在之前一项使用伊文思蓝与荧光素钠（376 Da）组合的研究中，由于荧光素钠分子量较小，在爆震波（BSW）暴露后能够标记更广泛的血脑屏障破坏区域³。在其他研究中，使用了伊文思蓝与更高分子量的FITC-葡聚糖组合，以比较血脑屏障破坏的程度^18,19。以往所有报道均几乎同时给予伊文思蓝和FITC-葡聚糖。本方案的独特之处在于，两种染料在不同时间点引入，从而能够考察血脑屏障破坏的时间进程。

伊文思蓝的累积特性可能在不同的血脑屏障破坏模型中具有优势。由于其能够记录血脑屏障破坏的历史，因此有助于理解疾病的发生与发展过程。研究人员应充分了解染料的优缺点，并最大限度地加以利用⁹。本实验方案适用于多种血脑屏障破坏模型，具有广泛的应用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林溶液	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
抗 GFAP 抗体，兔源	DAKO-Agilent	IR524
抗 Iba1 抗体，兔源	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
鸡抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	组织冷冻介质
Domitor	Orion Corporation		美托咪啶
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记	Thermo Fisher Scientific	A10040
伊文思蓝	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24 孔聚苯乙烯透明平底未处理细胞培养板，带盖，独立包装，无菌，50 个/箱	CORNING	351147
异硫氰酸荧光素–葡聚糖，平均分子量 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-葡聚糖
玻璃底培养皿 27 mm（1 号玻璃）	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm 玻璃底培养皿
IX83 倒置显微镜	OLYMPUS
MAS 亲水性粘附载玻片	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami 盖玻片（1 号） 18 x 18 mm	Matsunami Glass	C018181
咪达唑仑注射液 10 mg [SANDOZ]	Sandoz
对苯二甲醛 EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
蠕动泵	ATTO	SJ-1211 II-H
啮齿类脑切片模具 成年小鼠，30 g，冠状面	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	脑切片器
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	丁丙诺啡