轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

摘要

通过在不同时间点向小鼠注射两种荧光染料，建立了一种可视化血脑屏障（BBB）破坏所致染料外渗的方法。使用甘油作为冷冻保护剂，有助于在同一组织样本上进行免疫组织化学染色。

摘要

荧光染料用于评估血脑屏障（BBB）破坏所导致的染料外渗程度。使用这些染料进行标记是一个受多种因素影响的复杂过程，包括血液中染料的浓度、脑血管的通透性、染料外渗的持续时间，以及由于降解和扩散导致组织中染料浓度降低等。在轻度创伤性脑损伤模型中，暴露于爆炸诱导的冲击波（BSWs）会在有限的时间窗口内引发血脑屏障的破坏。为了确定血脑屏障破坏的精确时序，研究人员在不同时间点将伊文思蓝和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖通过血管内和心脏注射的方式注入小鼠体内。随后记录脑切片中染料荧光的分布情况。两种染料在分布模式和强度上的差异揭示了血脑屏障破坏的时空序列。对脑切片进行免疫染色显示，星形胶质细胞和小胶质细胞的反应与血脑屏障破坏部位相吻合。该方案在涉及不同血脑屏障破坏模型的研究中具有广泛的应用潜力。

引言

血脑屏障（BBB）的破坏和功能障碍可由全身性炎症、感染、自身免疫性疾病、损伤以及神经退行性疾病引起¹。在因暴露于爆炸诱导的冲击波（BSWs）所致的轻度创伤性脑损伤（mTBI）中，BSWs强度与血脑屏障破坏引起的荧光染料渗漏量之间存在显著相关性^2,3,4。mTBI中血脑屏障破坏的一个显著特征是，其在暴露于BSWs后立即或数小时内即开始发生，通常为一过性过程，持续约一周，随后出现迟发性慢性神经系统疾病^3,5,6,7。尽管其具体机制尚不明确，血脑屏障破坏是长期病理级联反应的一部分，并可能在mTBI中作为预后因素发挥作用⁶。因此，了解血脑屏障破坏在脑内的空间和时间分布具有重要意义。

荧光染料可用于评估血脑屏障（BBB）破坏的程度^3,

方案

所有实验均按照日本国家防卫医科大学校（Tokorozawa，日本）制定的动物实验伦理准则进行。研究方案已获国家防卫医科大学校动物研究委员会批准（批准号：23011-1）。本研究使用8周龄、体重19–23 g的雄性C57BL/6J小鼠。如图1所示，在单次BSW暴露前后的不同时间点进行单次伊文思蓝注射和FITC-葡聚糖灌注。所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 麻醉

注意：此为改良方案，与原始方案相比，右美托咪定的用量增加了2.5倍¹²。盐酸右美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺的剂量分别为0.75 mg/kg、4 mg/kg和5 mg/kg。

1. 在生理盐水中配制盐酸美托咪啶（75 µg/mL）、咪达唑仑（400 µg/mL）和布托啡诺（500 µg/mL）的混合溶液。
2. 通过腹腔注射给予该混合溶液以麻醉小鼠（10 µL/g）¹³。
3. 约5–10分钟后，通过观察尾部夹捏和足底回缩反射的消失来确认麻醉是否充分。
4. 在小鼠从麻醉作用中恢复期间，保持其体温温暖。

结果

图1A 显示了染料注射的时间进程与爆震伤（BSW）发生时间的关系，其中峰值超压为 25 kPa。在“注射后”方案中，伊文思蓝溶液在荧光素异硫氰酸-葡聚糖（FITC-dextran）灌注前 2 小时经血管内给药，而 FITC-dextran 灌注分别在 BSW 暴露后 6 小时、1 天、3 天和 7 天进行。在“注射前”方案中，伊文思蓝溶液在 BSW 暴露前立即注射。在“注射后”方案中，伊文思蓝的浓度预计在灌注固定前约 2 小时达到峰值；而在“注射前”方案中，其浓度预计在 BSW 暴露时达到峰值（图1B）。灌注期间，脑血管内的 FITC-dextran 浓度在 2 分钟内保持恒定。

伊文思蓝标记显示，血脑屏障破坏在BSW暴露后6小时内开始，并持续至7天后（图2A）。值得注意的是，血脑屏障破坏并未在BSW暴露后立即发生，因为在“Pre”方案中，3小时时未观察到伊文思蓝染料外渗（

讨论

采用伊文思蓝和荧光素异硫氰酸盐-葡聚糖双标记新技术，可精确可视化单个大脑中血脑屏障破坏的时空分布。在低强度冲击波模型中，所检测的大脑在染料外渗的范围、位置和程度上均表现出明显差异（图2 和 图3）。染料之间的不匹配显示，血脑屏障破坏始于冲击波暴露后约3小时，第1天开始出现显著的结构重塑，并持续至第7天（图4）。在严重情况下，活化的小胶质细胞被募集至血脑屏障破坏部位，且反应性星形胶质细胞簇与这些区域密切相关（图5）。通过对用于染料外渗分析的同一脑切片进行免疫组织化学染色，建立了胶质细胞反应与染料外渗之间的精确对应关系。更多详细数据与分析请参见Nishii等人的研究⁷。

由于FITC-葡聚糖在灌注固定前以恒定浓度、相同持续时间进行灌注，因此染料的分布和强度很可能准确反映了灌注固定时血脑屏障（BBB）破坏.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林溶液	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
抗 GFAP 抗体，兔源	DAKO-Agilent	IR524
抗 Iba1 抗体，兔源	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
鸡抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	组织冷冻介质
Domitor	Orion Corporation		美托咪啶
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记	Thermo Fisher Scientific	A10040
伊文思蓝	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24 孔聚苯乙烯透明平底未处理细胞培养板，带盖，独立包装，无菌，50 个/箱	CORNING	351147
异硫氰酸荧光素–葡聚糖，平均分子量 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-葡聚糖
玻璃底培养皿 27 mm（1 号玻璃）	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm 玻璃底培养皿
IX83 倒置显微镜	OLYMPUS
MAS 亲水性粘附载玻片	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami 盖玻片（1 号） 18 x 18 mm	Matsunami Glass	C018181
咪达唑仑注射液 10 mg [SANDOZ]	Sandoz
对苯二甲醛 EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
蠕动泵	ATTO	SJ-1211 II-H
啮齿类脑切片模具 成年小鼠，30 g，冠状面	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	脑切片器
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	丁丙诺啡