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制备与分析大鼠和小鼠眼球组织学切片以评估视网膜

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DOI：

10.3791/66663

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2024年8月23日

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1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文提供了一种用于制备啮齿类动物眼球组织切片的组织学实验方案。采用该方法，可在光学显微镜下清晰观察和评估内层视网膜。本方案适用于小鼠和大鼠的眼球组织处理。

摘要

啮齿类动物的眼球是研究多种眼科疾病发病机制的有力工具，例如青光眼、高血压性视网膜病变等。临床前实验使研究人员能够评估新型药物的疗效、开发新的治疗方法，或探索与疾病发生及进展相关的新的发病机制。组织学检查可提供大量必要信息，用于评估实验干预的效果，能够揭示组织变性、重塑、浸润以及其他多种病理改变。在临床研究中，几乎很少有机会获得适合进行组织学检查的眼部组织，因此研究人员应充分利用啮齿类动物眼球检查所提供的机会。本文介绍了一种啮齿类动物眼球切片的组织学制备方案。该方法适用于小鼠和大鼠的眼球，包括以下步骤：（i）眼球摘除，（ii）保存眼球以供后续分析，（iii）石蜡包埋处理组织，（iv）制备切片，（v）苏木精-伊红染色，（vi）在光学显微镜下评估组织。通过该方法，可清晰地观察并详细评估视网膜结构。

引言

眼球是一个类似球体的结构，构成视觉器官。眼球内部可分为两个部分：前段和后段。前段包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、前房和后房；后段包括玻璃体、视网膜、脉络膜、巩膜和视神经乳头。前房位于角膜与虹膜之间1,2。虹膜是一个中央有开口的环形结构，该开口称为瞳孔。在角膜与虹膜交界处存在房角，此处具有一套特化的小梁网系统，负责将眼内的房水引流至静脉系统。后房由虹膜、睫状体、晶状体以及固定晶状体位置的悬韧带所围成。在晶状体后方是玻璃体，为眼球内体积最大的结构。玻璃体附着于视网膜，有助于稳定其位置。视网膜则被脉络膜和巩膜所包绕1。眼球的解剖结构总结于图1中。

眼球壁由三层结构组成。最外层为巩膜，可保护眼球免受损伤并维持其形状。在眼球的前极，巩膜转变为透明的角膜。巩膜下方为一血管结构，称为葡萄膜，其主要功能是为眼部结构提供营养。葡萄膜形成脉络膜，在前极部位则形成睫状体和虹膜1。最内层为视网膜，是眼部高度特化的结构，由神经元、胶质细胞和色素上皮细胞构成。视网膜神经元包括感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、水平细胞、双极细胞、无长突细胞以及视网膜神经节细胞（RGCs）。这些细胞以复杂的层次结构排列，其功能是接收和处理光刺激2,3。视网膜胶质细胞包括穆勒细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，分布于视网膜的各层中。胶质细胞具有多种功能，包括为神经元提供营养、维持血-视网膜屏障、为神经元提供结构支持以保持视网膜的层状结构、调节神经元的代谢、分泌调控神经元功能、生长和存活的生物活性蛋白，以及调节视网膜内的免疫过程4。色素上皮细胞构成视网膜的最外层，在脉络膜与感光细胞之间形成屏障。这些细胞调控代谢废物和营养物质的双向转运，并通过吸收光能及中和光诱导产生的活性氧物质，保护视网膜免受过度光照造成的损伤5。

视网膜可分为十层：（i）视网膜色素上皮层，（ii）光感受器节段层（视杆细胞和视锥细胞），（iii）外界膜（ELM），（iv）外核层（ONL），（v）外丛状层（OPL），（vi）内核层（INL），（vii）内丛状层（IPL），（viii）节细胞层（GCL），（ix）视网膜神经纤维层（RNFL），以及（x）内界膜（ILM）2。视网膜的有核细胞层包括ONL、INL和GCL，而具有细胞间突触连接的层则包括OPL和IPL6。视杆细胞和视锥细胞的细胞核构成ONL，其轴突延伸至OPL，并在此与双极细胞和水平细胞的树突相连接。INL内含有水平细胞、双极细胞和无长突细胞的细胞核。在IPL中，双极细胞和无长突细胞的轴突终末与视网膜神经节细胞（RGCs）的树突形成突触。GCL主要由RGCs的胞体构成，但也可见少量异位的无长突细胞。RGCs的轴突构成RNFL，并进一步形成视神经7,8,9。

许多眼科疾病，例如视网膜的神经退行性疾病，会导致不可逆且无法治愈的失明10。视觉被认为是最重要的一种感觉11，而永久性失明会显著降低患者的生活质量。为了进一步理解多种疾病的发病机制，目前广泛开展使用细胞培养或动物模型的临床前研究。利用实验动物进行的临床前研究，为探讨眼病的潜在发病机制以及开发新的治疗策略提供了机会。眼病可在大型动物（如猴子、牛、狗和猫）和小型动物（如兔子、大鼠、小鼠和斑马鱼）中建模。由于眼睛尺寸较大，使用大型动物可更方便地进行眼部操作。而啮齿类动物由于繁殖速度相对较快，可用于培育近交品系，这些品系具有对特定疾病的易感性12,13。

在动物模型中，可以进行去眼球术，从而对眼球进行详细的组织病理学检查，评估疾病发展过程中眼部特定结构出现的微小病变——这种检查在人类中极少能够实施。组织病理学评估是研究眼病发病机制时极为有价值的工具。在已发表的文献中，关于眼球组织学检查方法的描述非常有限，且缺乏逐步操作指南，这使得初学者难以重复实验。本研究旨在提供一种简单而简洁的方法，用于制备大鼠和小鼠视网膜的组织学切片并对其进行评估。

方案

本研究严格遵守机构指导原则进行。本研究所用眼球来自实验动物，该实验依据由第2nd 波兰华沙生命科学大学当地伦理委员会。本方案通过检测11周龄和44周龄的小鼠，以及6、12和16周龄的大鼠而制定。

1. 小鼠眼球的制备

注意：本方案介绍了以下方法 制备小鼠眼球切片并进行 使用从眼球中采集的样本制备： 11周龄雌性C57Bl/6小鼠（平均 体重21 g，44周龄雌性C57Bl/6小鼠 周龄（平均体重25 g），雌性DBA/2 11周龄小鼠（平均体重21.5 g） 44周龄的雌性DBA/2小鼠 青光眼（平均体重25 g）。

  1. 去核
    1. 使用小镊子打开眼睑。按压眼睑使眼球突出。
    2. 用小型锐利剪刀剪断眼球后方的组织，将眼球从眼窝中分离。一旦眼球被移出眼眶，剪除突出的结缔组织和眼周肌肉。
      1. 为便于定位，可对眼球进行标记，例如，在眼球外直肌肌腱残端系上一小段缝线，以标记眼球的颞侧。
  2. 组织固定
    1. 将去核后的眼球放入1.5 mL微量离心管中，置于含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中，在4 °C下固定24小时。
    2. 随后，将眼球在10%蔗糖溶液中处理24小时，取出后转入20%蔗糖溶液中再处理24小时，最后取出并置于30%蔗糖溶液中继续处理24小时。
      注意：整个过程中应保持组织处于4 °C的低温环境。应避免用针头穿刺以促进蔗糖渗透，以减少对眼球的损伤风险。
  3. 组织冷冻与保存
    1. 将眼球从蔗糖溶液中取出，用纸巾轻轻吸干表面液体。
    2. 将眼球放入洁净的1.5 mL微量离心管中，置于-80 °C下冷冻，以备后续处理。
      注意：若在-80 °C条件下保存，眼球可保持活性长达12个月，直至后续使用。
  4. 切片制备
    1. 在室温下解冻眼球。将其从微量离心管中转移至包埋盒中，并用流水冲洗20分钟，以去除残留蔗糖。
    2. 在通风橱内依次将眼球浸入以下溶液并取出，进行脱水处理：70%乙醇（EtOH）10分钟，80% EtOH 10分钟，96% EtOH 10分钟，99.9% EtOH 10分钟，丙酮5分钟。
    3. 在通风橱内将眼球置于二甲苯中5分钟，进行透明处理。
    4. 将固体石蜡放入烧杯中，置于实验室培养箱中加热至高于石蜡制造商指定的熔点温度（石蜡熔点范围为46 °C至68 °C），使其完全熔化（所需时间取决于石蜡用量）。待石蜡完全熔化后，将眼球转移至含熔化石蜡的烧杯中，在培养箱中保温1小时。在石蜡浸润组织的1小时内，每隔10–15分钟搅拌一次石蜡。
      注意：可使用具备搅拌功能的组织处理仪完成此步骤。
    5. 按以下步骤将眼球包埋于石蜡块中。
      1. 打开包埋盒并取下顶盖。选择一个金属模具，在其底部倒入少量石蜡以覆盖底部。用镊子将眼球从包埋盒中取出，放置于模具内的石蜡上。将眼球侧放，以确保后续可在矢状面进行切片。
        注意：将眼球侧放（前极与后极分别位于两侧）可实现矢状面切片，从而获得穿过角膜、虹膜、睫状体、瞳孔、周边及中央视网膜的组织切片。
      2. 将模具短暂置于设定为-15 °C的冷却板上，使石蜡轻微凝固，以固定组织位置。小心地用石蜡覆盖组织，并加盖包埋盒底部形成蜡块。将蜡块放回冷却板上，使其完全凝固。随后将蜡块从金属模具中取出，并重新放回冷却板至少15分钟，冷却后再进行切片。
    6. 将石蜡块固定于切片机上。设置切片机参数以修除多余石蜡（我们设定为切15 µm），修片至眼球中心位置。更换切片机设置以切取更薄的切片（我们设定为3.5 µm），并将切片转移至载玻片上。若使用配有邻近水浴的切片机，可用湿润的纸巾去除载玻片上的多余水分。
      注意：目标是至少获得3张通过瞳孔平面的横截面切片。对于经验较少的研究人员，应多切取切片以确保获得通过瞳孔层面的组织。每张载玻片上可放置数张切片。此外，对于经验较少的研究人员，建议切取较厚的组织切片，例如4 µm或5 µm厚。使用配有水浴的切片机可显著简化将组织切片转移至载玻片的过程，优于无水浴装置的切片机。还需注意，晶状体较难切片。为降低坚硬晶状体对组织造成损伤的风险，应仅使用专为硬组织设计的锋利切片刀。建议使用一把刀片用于修片，另一把用于正式切片，以减少刀片钝化。
    7. 将载玻片放入设定为56 °C的实验室培养箱中，烘烤30分钟。
    8. 从培养箱中取出载玻片，开始手动进行苏木精-伊红（H&E）染色，依次将载玻片浸入并取出以下溶液：先用二甲苯处理7分钟，再用另一洁净烧杯中的二甲苯处理5分钟，接着再用另一洁净烧杯中的二甲苯处理5分钟。随后用96% EtOH处理2分钟，再用另一洁净烧杯中的96% EtOH处理1分钟，接着再用另一洁净烧杯中的96% EtOH处理1分钟。
    9. 用流水冲洗5分钟，然后用Mayer苏木精染色2分钟，再用另一洁净烧杯中的Mayer苏木精染色2分钟，接着用流水冲洗5分钟，再用另一洁净烧杯中的流水冲洗5分钟。
    10. 加入1%伊红染色2分钟，随后用96% EtOH处理1分钟，再用另一洁净烧杯中的96% EtOH处理30秒，接着再用另一洁净烧杯中的96% EtOH处理30秒，然后用二甲苯处理2分钟，再用另一洁净烧杯中的二甲苯处理1分钟，最后用另一洁净烧杯中的二甲苯处理2分钟。
      注意：也可使用自动切片染色仪进行染色。
    11. 使用自动封片机对载玻片进行封片。制备完成的切片即可用于储存，并可在光学显微镜下进行观察。
      注意：也可手动封片，即在染色后的组织上滴加一层薄薄的聚苯乙烯封固剂，再覆盖盖玻片。
      警告：涉及PFA、EtOH、丙酮和二甲苯的操作均应在实验室通风橱内进行。

2. 大鼠眼球切片的制备与载玻片封片

注意：本方案介绍了该方法 制备大鼠眼球切片并进行 使用从眼球中采集的样本制备： 6周龄雄性SHR大鼠（平均体重 115.5 克）、12 周龄雄性 SHR 大鼠 动脉性高血压（平均体重 262.5 g） 6周龄雄性WKY大鼠（平均体重 143.5 克）、12 周龄雄性 WKY 大鼠 （平均体重265 g），12周龄雄性Lewis大鼠 周龄（平均体重310 g）的雄性Lewis大鼠 16周龄诱导糖尿病大鼠 糖尿病（平均体重259 g）。

  1. 去眼球术
    1. 使用小镊子打开眼睑。按压眼睑使眼球突出。
    2. 用小型锋利剪刀剪断眼球后方的组织，将眼球从眼窝中分离出来。
      注：为便于定位，可对标记眼球，例如，在眼球外直肌肌腱残端系上一小段缝线，以标记眼球的颞侧。
  2. 组织固定
    1. 将摘除的眼球放入1.5 mL微量离心管中，置于含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定24小时。
    2. 随后，将眼球在10%蔗糖溶液中处理24小时，取出后转入20%蔗糖溶液中再处理24小时，最后取出并置于30%蔗糖溶液中处理24小时。
      注：整个过程中应将眼球保存在4 °C的低温环境中。应避免用针穿刺以促进蔗糖渗透，以减少眼球损伤的风险。
  3. 组织冷冻与保存
    1. 从蔗糖溶液中取出眼球，用纸巾轻轻蘸干表面液体。
    2. 将眼球放入洁净的1.5 mL微量离心管中，于-80 °C冷冻，以备后续处理。
      注：若在-80 °C条件下保存，眼球可保持活性长达12个月，直至后续处理。
  4. 切片制备
    1. 从冰箱中取出眼球及其微量离心管。用锋利的手术刀沿矢状面将眼球切成两半。取出并弃去晶状体。
      注：此步骤在刚从冰箱取出的冷冻眼球上操作最为简便。切割眼球时，晶状体可能损伤周围组织。为降低损伤风险，应使用非常锋利的手术刀，并谨慎操作。
    2. 在室温下使眼球解冻。将两半眼球转移至包埋盒中，在流动水中冲洗20分钟，以洗去蔗糖。
    3. 在通风橱内，依次将眼球浸入并取出以下溶液进行脱水：70%乙醇（EtOH）15分钟，80% EtOH 15分钟，96% EtOH 15分钟，99.9% EtOH 15分钟，丙酮7分钟。
    4. 在通风橱内，将眼球置于二甲苯中透明7分钟。
    5. 将固体石蜡放入烧杯中，置于实验室培养箱中加热至高于石蜡制造商指定的熔点温度（石蜡熔点范围为46 °C至68 °C），使其完全熔化（熔化时间取决于所用石蜡量）。待石蜡完全熔化后，将眼球移入含石蜡的烧杯中，在培养箱中保温1小时。在石蜡浸润组织的1小时内，每隔10–15分钟搅拌一次石蜡。
      注：可使用具备搅拌功能的组织处理仪完成此步骤。
    6. 按以下方法将眼球包埋于石蜡块中。
      1. 打开包埋盒，取下顶盖。选择一个金属模具，在其底部倒入少量石蜡以覆盖底部。用镊子将眼球从包埋盒中取出，放置于模具内的石蜡上。将一个眼球半片杯底朝上放置，另一个杯底朝下放置。
        注：将两个眼球半片分别以杯底朝上和朝下方式放置，可实现矢状面切片。如此可获得穿过角膜、虹膜、睫状体、瞳孔、周边及中央视网膜的组织切片。
      2. 将模具短暂置于设定为-15 °C的冷却板上，使石蜡轻微凝固，从而固定眼球位置。小心地用石蜡覆盖眼球，并加盖包埋盒底部形成蜡块。将蜡块放回冷却板上使其完全凝固。随后，将蜡块从金属模具中取出，并将石蜡块重新放回冷却板至少15分钟，冷却后再进行切片。
    7. 将石蜡块固定于切片机上。设置切片机以修除蜡块多余石蜡（我们设定为切15 µm），修片至接近眼球中心。更换切片机设置以切取更薄的切片（我们设定为3.5 µm），并将切片转移至载玻片上。若使用配有邻近水浴锅的切片机，可用湿润的纸巾去除载玻片上的多余水分。
      注：目标是至少获得3张通过瞳孔的横截面切片。研究者经验越少，应切取越多切片，以确保获得通过瞳孔层面的切片。每张载玻片上可放置数张切片。对于经验较少的研究者，建议切取较厚的组织，例如4 µm或5 µm厚的切片。使用配有水浴锅的切片机可显著简化将组织切片转移至载玻片的过程，相较于无水浴锅的切片机更为便捷。
    8. 取下载玻片，开始手动进行苏木精-伊红（H&E）染色，依次将载玻片浸入并取出以下溶液：先用二甲苯7分钟，再用二甲苯5分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），再用二甲苯5分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液）。随后依次使用96% EtOH 2分钟，96% EtOH 1分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），96% EtOH 1分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液）。
    9. 在流动水中冲洗5分钟，然后用Mayer苏木精染色2分钟，再用Mayer苏木精染色2分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），再在流动水中冲洗5分钟，再在另一洁净烧杯的流动水中冲洗5分钟。
    10. 加入1%伊红染色2分钟，随后依次使用96% EtOH 1分钟，96% EtOH 30秒（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），96% EtOH 30秒（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），二甲苯2分钟，二甲苯1分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液），二甲苯2分钟（另一洁净烧杯中的新鲜溶液）。
      注：也可使用自动切片染色仪进行染色。
    11. 使用自动封片机对载玻片进行封片。制备完成的切片可用于储存，并可在光学显微镜下进行观察。
      注：也可手动封片，即在染色后的组织上滴加一层薄薄的聚苯乙烯封固剂，再加盖盖玻片。
      注意：涉及PFA、EtOH、丙酮和二甲苯的操作步骤必须在实验室通风橱内进行。

3. 评估眼球切片

  1. 切片扫描
    1. 将切片放入组织病理学切片扫描仪中，使用40x扫描模式对切片进行扫描。将图像保存为高分辨率的数字文件。
  2. 切片分析
    1. 使用图像查看软件打开扫描文件。找到瞳孔横截面，并分析连续的三个切片。
    2. 找到视网膜最厚的部分，通过点击右上角的放大框并选择 20x 将图像放大至20倍。将鼠标移至视网膜最厚部分的外界膜（ELM）水平，按下鼠标右键，选择 注释 和 标尺。
    3. 将鼠标移向内界膜（ILM）并点击鼠标左键。将该测量命名为RT，并勾选显示标题和显示长度的选项框。这样即可测量视网膜厚度（RT），测量结果将以µm为单位显示。代表性结果见 图2 和 图3。
    4. 使用标尺测量各视网膜层的厚度，包括外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内丛状层（IPL），并进行标注。代表性结果见 图4 和 图5。
    5. 为计数神经节细胞层（GCL）内的细胞数量，需确定一段预设长度的视网膜。例如，对于小鼠视网膜，使用一段500 µm的区域；对于大鼠视网膜，使用五段各100 µm的区域。
    6. 使用标尺沿GCL测量选定的距离。按下鼠标右键，选择 注释 > 已保存 > 1x RBC。在GCL沿预设长度范围内，对每一个识别为圆形、苏木精染色的细胞体进行点击标记。统计被圈出的细胞数量。代表性结果见 图6 和 图7。
    7. 完成三个连续切片的分析后，计算所有测量值的平均值。

结果

通过使用本方案，可详细评估眼球特定结构的解剖学特征和形态学表现。我们的团队致力于研究视网膜疾病（如青光眼、糖尿病视网膜病变和高血压视网膜病变）中神经退行性变的病理机制。为评估视网膜神经退行性变的特征，我们检测了视网膜厚度（小鼠眼球 -图2，大鼠眼球 -图3）、外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内丛状层（IPL）（小鼠眼球 -图4，大鼠眼球 -图5），以及节细胞层（GCL）的细胞数量（小鼠眼球 -图6，大鼠眼球 -图7）。视网膜厚度和GCL细胞数量在中央视网膜区域应最高，在周边区域最低。通过在瞳孔水平切开眼球，可在同一张切片上获得穿过中央视网膜（眼球后极部）和周边视网膜（靠近睫状体）的横截面。

尽管计数GCL细胞可被视为相当客观，但切片方向的偏差可能导致视网膜特定层次测量结果出现偏差。为避免偏差，可将测量值表示为各层厚度与视网膜总厚度（RT）的比值：ONL/RT、OPL/RT、INL/RT 和 IPL/RT。

人眼解剖结构，标注了视网膜、晶状体、视神经、角膜的示意图；用于教育用途。
图1：眼球的解剖结构。 眼球的矢状切面，标注了其中最大的结构。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠视网膜组织学横切面示意图；厚度125 µm；细胞层结构；显微镜分析。
图2：小鼠视网膜厚度。 视网膜厚度（RT）的测量范围从外限制膜至内限制膜，在最宽处以绿色标线标记。小鼠眼球（品系：C57Bl/6，年龄：44周）。左下角的比例尺表示100 µm的长度。请点击此处查看该图的高清版本。

组织学切片，视网膜结构，显微镜图像，细胞层，厚度测量，显微成像。
图3：大鼠视网膜厚度。 从外限界膜至内限界膜测量最宽处的视网膜厚度（RT），绿色标线所示。大鼠眼球（品系：Lewis，年龄：16周）。左下角的比例尺表示100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

带有标注层的视网膜横截面图；组织学，显微分析，OPL，ONL，INL。
图 4：小鼠的视网膜层。 各视网膜层厚度的测量：外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内丛状层（IPL），以绿色条带标示。小鼠眼球（品系：C57Bl/6，年龄：44周）。左下角的比例尺表示100 µm的长度。请点击此处查看该图的放大版本。

视网膜组织切片显微图像，显示外丛状层（OPL）、内丛状层（IPL）、外核层（ONL）和内核层（INL），并标注各层厚度测量值。
图 5：大鼠的视网膜层次结构。 各视网膜层厚度的测量结果：外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内丛状层（IPL），以绿色标尺标记。大鼠眼球（品系：Lewis，年龄：16 周）。左下角的比例尺表示 100 µm 的长度。请点击此处查看该图的高清版本。

显示分层结构的视网膜横截面显微图像，标有表示尺寸的比例尺。
图6：小鼠节细胞层中细胞的计数。 沿视网膜长度为500 µm的节细胞层（GCL）进行细胞计数的方法。单个细胞核被识别为位于节细胞层内的圆形、苏木精染色的细胞体。细胞以黑色圆圈标记。小鼠眼球（品系：DBA/2，年龄：44周）。左下角的比例尺表示100 µm的长度。请点击此处查看该图的放大版本。

组织切片，光学显微镜图像；组织层，100 µm 比例尺，用于教学目的。
图7：大鼠节细胞层细胞计数。沿视网膜长度为100 µm的节细胞层（GCL）进行细胞计数的方法。单个细胞体被识别为位于节细胞层内的圆形、苏木精染色的细胞结构。细胞以黑色圆圈标记。大鼠眼球（品系：Lewis，年龄：16周）。左下角的比例尺表示长度为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

对小鼠和大鼠眼球进行组织学检查是实验眼科学领域的一项有力工具。该方法能够提供与眼科疾病过程中眼部结构变化相关的新信息，而这些信息在临床环境中通常无法观察到。本文所述的实验方案介绍了一种对视网膜进行组织学分析的简便方法。本方法未涉及角膜等眼前段组织处理过程中所需的具体操作细节。

在本研究中，动物安乐死后进行去眼球术，因为除眼球外，还需采集其他组织（如血液、肾脏）用于研究。然而，去眼球术也可在麻醉下的活体动物中进行。Wilding 等人已对该操作步骤进行了描述14，我们建议读者参考该文献以查看去眼球术过程的相关图片。

尽管小鼠和大鼠眼球切片制备的实验方案相似，但在制备切片时需要考虑两者眼球的主要差异在于其大小。大鼠眼球的体积比小鼠大8至10倍，小鼠眼球的平均轴向长度约为3.2 mm，而大鼠眼球的轴向长度通常在6.91 mm左右15,16。因此，在组织处理过程中，为促进试剂更好地渗透，通常需要将大鼠眼球切成两半。此外，试剂渗透进入大鼠组织所需的时间也比小鼠眼球更长。在将大鼠眼球切成两半时，应使用锋利的刀片，因为坚硬且已冻结的晶状体可能构成切割障碍。

另一个值得讨论的问题是动物组织取材后的固定。在本方案中，眼球摘除后使用多聚甲醛（PFA）进行固定，并浸入蔗糖溶液中。蔗糖作为冷冻保护剂，可防止大块组织在冷冻过程中因冰晶形成而造成细胞损伤17。冷冻组织可使研究人员更长期地保存组织，并可用于未来的多种检测，包括使用切片机（如本文所示）进行组织病理学分析、使用冷冻切片机进行组织病理学分析，以及通过共聚焦显微镜评估的免疫标记。例如，在将大鼠眼球切成两半（步骤2.4.1）时，如果切割操作高效且迅速（在5–10秒内完成），且眼球未有时间解冻，则其中一半可用于组织病理学分析，另一半可重新放回冷冻保存，以备将来进行免疫标记。我们不建议对先前经石蜡浸润的组织进行免疫标记，因为石蜡固定可能导致蛋白表位构象发生改变。然而，如果研究团队仅计划使用切片机进行组织病理学分析，则可采用更简单、标准的组织固定与石蜡包埋方法——例如，不再执行小鼠的步骤1.2.1–1.4.1或大鼠的步骤2.2.1–2.4.2，而是将组织置于10% PFA溶液中固定24小时，随后在4 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存直至处理。此时无需使用蔗糖作为冷冻保护剂，因为组织不会被冷冻。采用此替代方法可避免冷冻过程，可能带来优势并获得质量更高的切片。尽管冷冻眼球为研究人员提供了更灵活的组织病理学检查时间选择，但该步骤可能降低样本质量，并导致视网膜脱离。然而，应注意的是，若将组织保存在4 °C条件下，其生物稳定性较短，应在4周内完成分析。此外，在处理大鼠眼球时，若眼球未冷冻，步骤2.4.1（将眼球切成两半）的操作将更加困难。

本研究所采用的方法基于Chai等18、Igarashi等19、Zhang等20以及Dorfman等21所描述的方法，并结合了个人经验及试错法而建立。视网膜及其各层厚度的测量方法依据Chai等16和Barber等18,22提出的方法进行描述。视网膜RGC计数方法则是在综述Chai等16、Zhang等18、Steinle等19以及Dorfman等18,20,21,23研究工作的基础上发展而来。总体而言，眼球组织病理切片的制备与常规的福尔马林固定石蜡包埋组织切片制备方法有所不同，因为眼球呈球形，因此在操作、切割和切片过程中更为困难。此外，巩膜会阻碍试剂向组织内的渗透。在制备眼球组织学切片时，必须更加精细和准确地操作，注意避免损伤眼球内部精细的结构。本方案的改进方法可能包括使用甲基丙烯酸甲酯包埋技术替代石蜡包埋，据报道该方法可提供更佳的形态学结果。然而，目前极少有研究人员将此方法用于视网膜的评估24,25。

该实验方案并非完全无偏倚。我们团队遇到的最大问题是视网膜撕裂和视网膜脱离。尤其是大鼠眼球的视网膜更容易发生撕裂，因为在载玻片制备前需将眼球切成两半，因此视网膜更易受损。由于存在视网膜脱离的情况，本方案不能用于脉络膜、视网膜色素上皮或光感受器节段层的评估。然而，我们团队认为该方案可用于评估内层视网膜（从内界膜 ILM 到外界膜 ELM）。为尽量减少视网膜撕裂和脱离的程度，应谨慎、缓慢且精准地执行方案中的每一步操作。

视网膜组织病理学分析并非临床常规诊断的一部分，但在临床前研究中是一种广泛应用的方法。在临床前研究中对视网膜进行组织病理学评估的结果可与光学相干断层扫描（OCT）的结果相关联并进行比较讨论。26，这是一种在检查过程中显示视网膜横截面的检测方法 体内 可在临床环境中对参与临床试验的人类受试者进行的一种检查。然而，OCT 检查的细节程度较低。因此，在临床前研究中开展的组织学研究所得信息具有不可替代性，对于医学知识的发展至关重要。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

涉及大鼠的研究工作是作为“TIME 2 MUW——教学卓越作为华沙医科大学发展机遇”项目的一部分获得资助的，该项目由欧洲社会基金通过2014-2020年知识教育发展运营计划共同资助，共同资助协议编号：POWR.03.05.00-00-Z040/18-00。涉及小鼠的研究工作是2020年至2022年期间实施的一个项目的一部分，由华沙医科大学获得的科学补贴资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮 Chempur 111024800
Dumont 镊子 #5，11 cm，0.05 × 0.01 mm 尖端World Precision Instruments14095小型显微外科镊子
伊红Mar-Four4P.05.2001/L水溶液
96% 乙醇Chempur CH.ET.AL.96%CZDA.CH
99.9% 乙醇Chempur CH.ETYL.ALK.99,9%BW用于配制 70% 和 80% 的乙醇溶液
Glacier - 86 °C 超低温冰箱 NU-9483ENuAire13027D0034冷冻温度 -80 °C
载玻片Mar-FourMI.15.01673磨砂双面载玻片，带哑光区域用于标记
Leica CV5030 全自动封片机Leica Biosystems 14,04,78,80,101自动封片设备 
Mayer 苏木精染液Chempur 124687402
金属底模 15 mm  × 15 mmLeica Biosystems 3803081
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0切片机
切片机刀片Mar-FourHI.N.35切割角度 35°
Micro-Twin 活检盒Mar-FourLN.13874550
微波组织处理仪Milestone
Leica ST5020 多功能染色机Leica Biosystems 自动玻片染色仪 
NanoZoomer 2.0-HT 玻片扫描仪HamamatsuC9600组织病理学玻片扫描仪
NDP.view2 图像浏览软件HamamatsuU12388-01图像浏览软件
石蜡 Pathowax PlusMar-Four4P.PWP.010熔点 56 °C 至 58 °C
多聚甲醛Sigma - Aldrich441244-1KG用 PBS 配制 4% 溶液
PBS 片剂Merck Millipore524650-1EA按照生产商说明配制磷酸盐缓冲液
Pierce 微量离心管，1.5 mLThermo Scientific69715
冰箱-冰柜 EN14000AWElectrolux925032562-00冷藏温度 4 °C
手术刀片Swann-MortonT.OST.SKAL00.024
蔗糖Chempur 427720906
SuperCut 弹簧剪，12.5 cm，弯头World Precision Instruments501925弯头小型显微外科剪
自动封片机用胶带Mar-FourKP-3020/SMRH001
二甲苯Chempur CH.KSYL.5l.METAL.OP 

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制备与分析大鼠和小鼠眼球组织学切片以评估视网膜
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