制备与分析大鼠和小鼠眼球组织学切片以评估视网膜

摘要

本文提供了一种用于制备啮齿类动物眼球组织切片的组织学实验方案。采用该方法，可在光学显微镜下清晰观察和评估内层视网膜。本方案适用于小鼠和大鼠的眼球组织处理。

摘要

啮齿类动物的眼球是研究多种眼科疾病发病机制的有力工具，例如青光眼、高血压性视网膜病变等。临床前实验使研究人员能够评估新型药物的疗效、开发新的治疗方法，或探索与疾病发生及进展相关的新的发病机制。组织学检查可提供大量必要信息，用于评估实验干预的效果，能够揭示组织变性、重塑、浸润以及其他多种病理改变。在临床研究中，几乎很少有机会获得适合进行组织学检查的眼部组织，因此研究人员应充分利用啮齿类动物眼球检查所提供的机会。本文介绍了一种啮齿类动物眼球切片的组织学制备方案。该方法适用于小鼠和大鼠的眼球，包括以下步骤：（i）眼球摘除，（ii）保存眼球以供后续分析，（iii）石蜡包埋处理组织，（iv）制备切片，（v）苏木精-伊红染色，（vi）在光学显微镜下评估组织。通过该方法，可清晰地观察并详细评估视网膜结构。

引言

眼球是一个类似球体的结构，构成视觉器官。眼球内部可分为两个部分：前段和后段。前段包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、前房和后房；后段包括玻璃体、视网膜、脉络膜、巩膜和视神经乳头。前房位于角膜与虹膜之间^1,2。虹膜是一个中央有开口的环形结构，该开口称为瞳孔。在角膜与虹膜交界处存在房角，此处具有一套特化的小梁网系统，负责将眼内的房水引流至静脉系统。后房由虹膜、睫状体、晶状体以及固定晶状体位置的悬韧带所围成。在晶状体后方是玻璃体，为眼球内体积最大的结构。玻璃体附着于视网膜，有助于稳定其位置。视网膜则被脉络膜和巩膜所包绕¹。眼球的解剖结构总结于图1中。

眼球壁由三层结构组成。最外层为巩膜，可保护眼球免受损伤并维持其形状。在眼球的前极，巩膜转变为透明的角膜。巩膜下方为一血管结构，称为葡萄膜，其主要功能是为眼部结构提供营养。葡萄膜形成脉络膜，在前极部位则形成睫状体和虹膜¹。最内层为视网膜，是眼部高度特化的结构，由神经元、胶质细胞和色素上皮细胞构成。视网膜神经元包括感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、水平细胞、双极细胞、无长突细胞以及视网膜神经节细胞（RGCs）。这些细胞以复杂的层次结构排列，其功能是接收和处理光刺激

方案

本研究严格遵守机构指导原则进行。本研究所用眼球来自实验动物，该实验依据由第2^nd 波兰华沙生命科学大学当地伦理委员会。本方案通过检测11周龄和44周龄的小鼠，以及6、12和16周龄的大鼠而制定。

1. 小鼠眼球的制备

注意：本方案介绍了以下方法 制备小鼠眼球切片并进行 使用从眼球中采集的样本制备： 11周龄雌性C57Bl/6小鼠（平均 体重21 g，44周龄雌性C57Bl/6小鼠 周龄（平均体重25 g），雌性DBA/2 11周龄小鼠（平均体重21.5 g） 44周龄的雌性DBA/2小鼠 青光眼（平均体重25 g）。

1. 去核
   1. 使用小镊子打开眼睑。按压眼睑使眼球突出。
   2. 用小型锐利剪刀剪断眼球后方的组织，将眼球从眼窝中分离。一旦眼球被移出眼眶，剪除突出的结缔组织和眼周肌肉。
      1. 为便于定位，可对眼球进行标记，例如，在眼球外直肌肌腱残端系上一小段缝线，以标记眼球的颞侧。
2. 组织固定
   1. 将去核后的眼球放入1.5 mL微量离心管中，置于含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中，在4 °C下固定2....

结果

通过使用本方案，可详细评估眼球特定结构的解剖学特征和形态学表现。我们的团队致力于研究视网膜疾病（如青光眼、糖尿病视网膜病变和高血压视网膜病变）中神经退行性变的病理机制。为评估视网膜神经退行性变的特征，我们检测了视网膜厚度（小鼠眼球 -图2，大鼠眼球 -图3）、外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内丛状层（IPL）（小鼠眼球 -图4，大鼠眼球 -图5），以及节细胞层（GCL）的细胞数量（小鼠眼球 -图6，大鼠眼球 -图7）。视网膜厚度和GCL细胞数量在中央视网膜区域应最高，在周边区域最低。通过在瞳孔水平切开眼球，可在同一张切片上获得穿过中央视网膜（眼球后极部）和周边视网膜（靠近睫状体）的横截面。

尽管计数GCL.......

讨论

对小鼠和大鼠眼球进行组织学检查是实验眼科学领域的一项有力工具。该方法能够提供与眼科疾病过程中眼部结构变化相关的新信息，而这些信息在临床环境中通常无法观察到。本文所述的实验方案介绍了一种对视网膜进行组织学分析的简便方法。本方法未涉及角膜等眼前段组织处理过程中所需的具体操作细节。

在本研究中，动物安乐死后进行去眼球术，因为除眼球外，还需采集其他组织（如血液、肾脏）用于研究。然而，去眼球术也可在麻醉下的活体动物中进行。Wilding 等人已对该操作步骤进行了描述¹⁴，我们建议读者参考该文献以查看去眼球术过程的相关图片。

尽管小鼠和大鼠眼球切片制备的实验方案相似，但在制备切片时需要考虑两者眼球的主要差异在于其大小。大鼠眼球的体积比小鼠大8至10倍，小鼠眼球的平均轴向长度约为3.2 mm，而大鼠眼球的轴向长度通常在6.91 mm左右^15,16。因此，在组织处理过程中，为促进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Chempur	111024800
Dumont 镊子 #5，11 cm，0.05 × 0.01 mm 尖端	World Precision Instruments	14095	小型显微外科镊子
伊红	Mar-Four	4P.05.2001/L	水溶液
96% 乙醇	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
99.9% 乙醇	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	用于配制 70% 和 80% 的乙醇溶液
Glacier - 86 °C 超低温冰箱 NU-9483E	NuAire	13027D0034	冷冻温度 -80 °C
载玻片	Mar-Four	MI.15.01673	磨砂双面载玻片，带哑光区域用于标记
Leica CV5030 全自动封片机	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	自动封片设备
Mayer 苏木精染液	Chempur	124687402
金属底模 15 mm  × 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	切片机
切片机刀片	Mar-Four	HI.N.35	切割角度 35°
Micro-Twin 活检盒	Mar-Four	LN.13874550
微波组织处理仪	Milestone
Leica ST5020 多功能染色机	Leica Biosystems		自动玻片染色仪
NanoZoomer 2.0-HT 玻片扫描仪	Hamamatsu	C9600	组织病理学玻片扫描仪
NDP.view2 图像浏览软件	Hamamatsu	U12388-01	图像浏览软件
石蜡 Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	熔点 56 °C 至 58 °C
多聚甲醛	Sigma - Aldrich	441244-1KG	用 PBS 配制 4% 溶液
PBS 片剂	Merck Millipore	524650-1EA	按照生产商说明配制磷酸盐缓冲液
Pierce 微量离心管，1.5 mL	Thermo Scientific	69715
冰箱-冰柜 EN14000AW	Electrolux	925032562-00	冷藏温度 4 °C
手术刀片	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
蔗糖	Chempur	427720906
SuperCut 弹簧剪，12.5 cm，弯头	World Precision Instruments	501925	弯头小型显微外科剪
自动封片机用胶带	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
二甲苯	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP