方法文章

高通量生物打印方法，用于模拟具有尺寸和图案灵活性的标准六孔板中的血管通透性

DOI：

10.3791/66676

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2024年8月16日

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1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一种使用 3D 生物打印技术在标准六孔板上高通量生产具有灵活尺寸和所需模式的血管通道的方案，称为板上血管 （VOP）。该平台有可能推动与内皮受损相关的疾病的治疗开发。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管通透性是开发与内皮受损相关的疾病疗法的关键因素，例如冠状动脉内皮功能障碍和血脑屏障功能受损。现有的制造技术不能充分复制人体血管网络的几何变化，这会严重影响疾病进展;此外，这些技术通常涉及多步骤制造程序，阻碍了药理学测试所需的高通量生产。本文提出了一种生物打印方案，用于直接在标准六孔板上创建具有所需图案和大小的多个血管组织，克服了生物打印技术中现有的分辨率和生产率挑战。建立了一种简化的制造方法，在水凝胶内构建六个中空的可灌注通道，随后与人脐静脉内皮细胞衬里，形成功能性和成熟的内皮细胞。3D 生物打印的计算机控制特性确保了高重现性，并且比传统方法需要更少的手动制造步骤。这凸显了 VOP 作为建模血管通透性和推进药物发现的高效高通量平台的潜力。

引言

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贯穿人体的血管网络通过动态调节血液与周围组织之间的分子和细胞交换，起到重要的运输屏障的作用。这种调节对于防止组织水肿和实现选择性营养物质和细胞交换至关重要，从而支持组织代谢和体内平衡1。内皮通透性改变是许多健康状况的一个因素，它会影响疾病的严重程度和治疗效果2。血管内皮起到选择性屏障的作用，促进血管、组织和器官之间的转移。这种调节涉及多种机制，例如溶质和小分子的基本过滤、血管屏障的有意破坏以及前列腺素和生长因子等分子对通透性水平的影响3。

这种调节的关键因素包括内皮细胞连接、白细胞迁移和血脑屏障的功能4。鉴于其复杂性，该过程在不同的环境中有所不同，涉及不同的血管类型并利用不同的解剖途径。理解血管通透性的生物学基础对于设计治疗方法来治疗与异常血管通透性相关的疾病至关重要。维持血管通透性对于血管系统和周围组织的健康至关重要;因此，该功能的损害会导致内皮功能障碍，即内皮失去正常功能的状态。

内皮功能障碍是几种常见人类疾病的前兆，包括高血压、冠状动脉疾病、糖尿病和癌症 5,6,7。这种情况可以以多种方式出现，包括血管舒张减少、血管通透性增加和倾向于促炎状态。这种病理状态是几个关键心血管问题的早期阶段，例如冠状动脉疾病、中风和外周动脉疾病8，这些问题仍然是美国死亡的主要原因1。内皮功能障碍影响心血管健康以及血脑屏障 （BBB），并在各种神经系统疾病的进展中起主要作用。功能障碍会增加 BBB 通透性，从而使毒素、病原体和免疫细胞渗透到中枢神经系统中，并导致神经系统疾病，如中风、阿尔茨海默病、多发性硬化症和脑部感染9。

糖尿病患者的内皮功能障碍的特点是内皮调节血管张力和产生血管扩张介质（如一氧化氮）的能力受损，导致血管舒张受损10。高血糖诱导的途径（如蛋白激酶 C 激活和氧化应激）会加剧这种情况，显着导致糖尿病血管疾病的进展11。此外，已发现炎症环境可增强肿瘤细胞与脑微血管内皮细胞的粘附，而据报道渗漏的内皮是癌症转移的主要因素12,13。已发现血管的几何形状直接影响脑癌转移。肿瘤细胞优先附着在血管弯曲度较大的区域7。这一发现强调了血管几何形状在癌症转移中的重要性。更重要的是，在纤维化和癌症等情况下，被破坏的内皮屏障功能不仅在疾病发展中发挥作用，而且还会通过阻碍充分的药物输送来阻碍治疗效果14。血管通透性研究对于推进心血管疾病治疗和为管理涉及血管功能受损的其他疾病提供见解至关重要。

鉴于血管通透性在健康和疾病中的关键作用，大量研究集中在通过使用动物模型以及传统的 2D 和 3D 体外测试平台来检查内皮屏障对治疗开发的选择性。然而，由于物种特异性的差异和伦理问题，以及高成本，动物模型存在局限性15,16。例如，辉瑞在 2004 年表示，在过去 10 年中，它花费了超过 20 亿美元用于药物开发，这些药物在动物模型中显示出有希望的效果，但最终在高级人体测试阶段失败17。此外，传统的 2D 模型无法准确模拟三维 （3D） 架构和血管通道的复杂几何结构。

随着生物制造技术的进步，人们开始做出广泛的努力，旨在制造血管通道，同时概括 3D 建筑。通过使用软光刻技术，可以在微流体芯片内有效地制造微尺度血管通道，从而提供实时分析的优势18,19。替代方法，例如水凝胶铸造或将细胞片包裹在模具或心轴上，可用于创建所需直径为20,21 的独立管状结构。但是，这些方法有局限性;例如，微流体芯片仅限于微通道配置，而模具周围的水凝胶铸造无法有效地复制多个几何形状。

随着 3D 生物打印技术的出现22，通过精确沉积各种基于细胞外基质 （ECM） 的水凝胶材料来复制复杂的几何形状已成为可能23,24。一些生物打印方法，例如使用同心排列的喷嘴的方法，例如同轴和三轴25,26，不能产生分叉管;然而，复杂的结构可以通过牺牲图案化方法来实现27。这些生物打印方法都没有被证明能够实现高通量体外建模——这是药物发现中药理学研究的关键要求。在此，我们提出了一种有效制造内皮化血管通道的方法，可有效控制尺寸。

我们建立了一种简单的方法，使用市售的六孔板，结合牺牲图案化方法，其中生物打印机在 ECM 水凝胶内制造所需尺寸和图案的血管通道。接种人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 以内皮化这些通道并通过通透性测定评估内皮的功能。这种设计通过在通道的两侧创建培养基储液器来实现无泵灌流，并在常用的 2D 摇杆的帮助下使用重力驱动流来模拟动态培养。这种方法消除了对蠕动泵的需求，并有助于该平台在高通量应用中的可扩展性。3D 生物打印技术的计算机控制特性还简化了制造过程，从而降低了制造过程中出错的可能性。VOP 模型有望成为药物发现中药理学测试的宝贵工具。

方案

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1. 生成生物打印机的 G 代码

  1. 要生成和可视化打印路径，请访问在线 G 代码模拟工具（例如 NCviewer）。
  2. 点击 新文件 界面上的图标以创建新的 G 代码文件。
  3. 通过手动编写牺牲通道和硅腔的 G 代码命令来生成打印路径。使用标准 6 孔板的尺寸作为创建几何的参考。
    注意:此处使用的 G 代码基于计算机数控 （CNC） 代码。 补充表 S1 中提供了每个命令的功能。之所以选择六孔板规格，是因为它与市售微孔板读板机和显微镜装置兼容，并且能够容纳足够体积的培养基以支持内皮成熟，从而最大限度地减少频繁更换培养基的需要。该制备方案也适用于其他标准孔板。
  4. G 代码完成后，单击 保存文件 界面上的图标以下载扩展名为 .nc 的文件。
    注意:任何其他可用的 G 代码生成算法都可用于生成打印路径。血管通道的几何形状可以在此 G 代码中进行操作。

2. 牺牲和硅室油墨的制备

注意:本协议中使用的所有材料的来源均列在 材料表中。

  1. 将 SE1700 和聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 两种有机硅聚合物以 10:2 的比例混合使用。按10:1的比例添加每种聚合物的固化剂，聚合物与固化剂。
  2. 使用行星式混合器以 2,000 rpm 的速度彻底混合和脱气聚合物混合物。
  3. 用抹刀将混合的有机硅聚合物转移到 10 mL 一次性注射器中。将加载的注射器在 5 °C 下以 400 × g 离心 3 分钟，以确保均匀的一致性并避免打印过程中出现气泡。
    注意:腔室墨水应在添加固化剂后 2 小时内使用，以确保最佳打印质量。在准备打印时将注射器储存在 5 °C 下。此过程有助于减缓油墨固化，否则可能会改变打印参数。
  4. 称取 Pluronic F-127 （PF127） 以制备 PF127 的 40% （w/v） 蒸馏水储备液。
  5. 将 PF127 溶液在行星式混合器中以 400 × g 混合 3 分钟，以实现均匀性。将匀浆混合物保持在 4 °C 以使 PF127 完全溶解。
  6. 在 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中制备 1,000 单位/mL 的凝血酶储备液。
    注:以 100 μL 等分试样储存凝血酶原液，以避免重复冻融循环。等分试样应在 -20 °C 下储存不超过 6 个月。
  7. 打印前，通过将凝血酶与 PF127 以 1:10 稀释度混合至最终工作浓度为 36% （w/v）（PF127）和 100 单位/mL（凝血酶）来制备牺牲墨水。要制备 1 mL 牺牲墨水，请将 100 μL 凝血酶原液与 900 μL PF127 原液混合。
    注:在制备用于打印单板的牺牲墨水时，1 mL 的总体积绰绰有余。

3. 制造过程

  1. 在开始制造过程之前，用 100 瓦强度的氧 （O2） 等离子体处理六孔板 1 分钟。
  2. 按照第 2 节中概述的程序准备牺牲油墨和硅油墨，确保油墨没有气泡并均匀混合以实现一致的印刷。小心地将墨水装入生物打印机的打印头中。将生物打印机头部的温度设置为 37 °C（牺牲墨水）和 5 °C（硅墨水）。
  3. 将 22 G 双螺纹锥形喷嘴连接到硅胶注射器上。对于牺牲墨水，请根据所需的通道直径选择喷嘴尺寸。
    注意:在这里，我们展示了三种尺寸的喷嘴:18 G、20 G 和 22 G。 表 1 概述了包括打印压力和打印头速度在内的最佳打印参数。
  4. 加载所需的 G 代码并按下生物打印机软件界面上的 伺服就绪 功能 3 秒。将印版放在载物台上 G 代码的起点处，然后单击 start（ 开始 ）以启动打印过程。
    注意:通常，制造一个包含六个腔室的板大约需要 1 小时 10 分钟。步骤 3.4，涉及 G 代码的加载和执行，根据所使用的特定生物打印机，可能会有所不同。确保在使用生物打印机时保持无菌条件，以避免污染。
  5. 盖上板盖，将板转移到 37 °C 的加湿 CO2 培养箱中 72 小时以固化硅室。
    注意:尽管培养箱内的硅固化速度可能较慢，但不得将板放置在干燥的烘箱内。

4. 水凝胶制备和通道包埋

  1. 准备一个含有 20 mL 1x PBS 的 50 mL 锥形管。将 0.01 g 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂 （LAP） 放入锥形管中，制成 0.05% （w/v） LAP 溶液。涡旋直到粉末完全溶解。
    注意:用箔纸包裹锥形管以防止暴露在光线下。将 LAP 储备溶液储存在 4 °C。
  2. 将 3 g 甲基丙烯酸明胶 （GelMA） 和 0.2 g 纤维蛋白原添加到 20 mL LAP 溶液中，以达到 15% GelMA 和 1% 纤维蛋白原（称为 GelFib）的最终浓度。将混合物置于 37 °C 水浴中，定期涡旋混合，直至溶液完全溶解。
  3. 按照第 3 节所述进行制备后，将 300 μL 预热的 GelFib 加入每个水凝胶腔室中，以嵌入牺牲模式。将 GelMA 与波长为 405 nm、强度为 85 mW/cm2 的紫外线 （UV） 快速交联 120 秒。对所有其他孔重复此过程。
    注意:纤维蛋白原在与含有凝血酶的牺牲模式接触时迅速交联。我们建议为每个孔添加水凝胶并单独进行 UV 交联，以避免 GelMA 在室温下发生不必要的凝胶化。此外，应保持无菌条件，以防止 UV 固化过程中的污染。
  4. 在每个孔的血管通道的每一侧加入 1 mL 的 DPBS，并将板在 4 °C 下保持 15 分钟以液化 PF127。
  5. 15 分钟后，吸出 DPBS，然后重复步骤 4.5 3 次以完全洗涤 PF127。
  6. 在将细胞引入通道之前，通过通道灌注含有 1% 基质胶的 DMEM F12 30 分钟以增强细胞附着。

5. HUVEC 培养

  1. 将内皮细胞生长培养基 （ECGM） 在 37 °C 水浴中预热 30 分钟。
  2. 同时，从氮气罐中取出一小瓶冷冻保存的 HUVEC，轻轻松开小瓶的盖子，然后重新拧紧以从螺纹中释放氮气。将样品瓶浸入 37 °C 水浴中 2 分钟，确保样品瓶内残留少量冰，立即解冻细胞。用 70% 乙醇冲洗样品瓶以防止污染。
    注意: 从氮气罐中取出电池时，请佩戴护目镜。在此过程中，样品瓶的盖子必须保持在水位以上。
  3. 准备一根 15 mL 锥形管，其中包含 5 mL 预热的 ECGM。用微量移液器小心地将解冻的细胞从小瓶转移到锥形管中。为确保没有细胞残留，向冻存管中加入 1 mL 新鲜的预热培养基，冲洗内部，然后将剩余的细胞转移到锥形管中。
  4. 将锥形管以 200 × g 离心 3 分钟以获得细胞沉淀。弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL 新鲜培养基中，将细胞转移至 T75 培养瓶中，然后将培养瓶置于 37 °C 加湿的 CO2 培养箱中。
    注:此步骤对于通过离心去除冷冻管中冷冻培养基中存在的二甲基亚砜非常重要。
  5. 每隔一天刷新一次培养基，直到细胞达到 80-90% 汇合。

6. 通道内皮化

  1. 在 37 °C 水浴中预热 ECGM、DPBS、胰蛋白酶中和胰蛋白酶乙二胺四乙酸 （TE） 30 分钟。
  2. 在 90% 汇合度时，用 10 mL DPBS 冲洗 T75 培养瓶中的细胞，向培养瓶中加入 1 mL 0.25% TE，并孵育 3 分钟。
  3. 轻轻敲击培养瓶的侧面，加入 5 mL 胰蛋白酶中和溶液以中和 TE。将细胞转移至 15 mL 锥形管中。使用 5 mL 新鲜 ECGM 收集剩余细胞并将它们添加到锥形管中。
  4. 将锥形管以 250 × g 离心 3 分钟以收集细胞沉淀。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 ECGM 中。用血细胞计数器计数细胞，然后重复步骤 6.4 以获得细胞沉淀。在 90 μL 新鲜 ECGM 中重悬 300 万个细胞。
  6. 在将细胞悬液引入通道之前，短暂地真空吸取通道以清除管腔。
    注意: 避免长时间吸入通道，以免破坏其完整性。
  7. 以每孔 50 万个细胞的接种密度轻轻加载细胞悬液。使用微量移液器添加 ~15 μL 这种悬浮液以填充通道。
    注意:种子密度可能因通道的大小而异。该密度针对使用 20 G 喷嘴打印且内径约为 900 μm 的通道进行了优化。
  8. 将板平放在培养箱内 2 小时。随后，将板倒置至 180°，在接下来的 2 小时内将其保持在平坦位置。
  9. 4 小时后，用 DPBS 洗涤通道以去除非粘附和死细胞。向每个孔中加入 2 mL 新鲜 ECGM（通道每侧 1 mL）。将板放在摇杆上，使通道平行于摇摆方向，以 10° 倾斜角和 5 rpm 的速度在摇杆上开始动态培养。每隔一天刷新一次生长培养基。
    注:动态培养可增强储液槽和通道之间的培养基交换，并帮助细胞在夜间增殖。

7. 内皮成熟评估

  1. 将 ECGM 和 DPBS 在 37 °C 水浴中预热 30 分钟，并在室温下使用细胞计数试剂盒 8 （CCK8） 试剂。
  2. 将 100 μL CCK8 试剂与 1 mL 新鲜 ECGM 混合，制备 CCK8 的工作溶液。在使用 plate/6 通道时，将 600 μL CCK8 试剂与 6 mL 新鲜 ECGM 混合，制备 CCK8 试剂。
  3. 通过抽吸去除生长培养基，并用 DPBS 冲洗通道。向每个孔中加入 1 mL CCK8 工作溶液，让板在培养箱内保持平整 30 分钟。之后，如步骤 6.9 所述在摇杆上开始动态培养，并在接下来的 3 小时内继续此过程。
  4. 3 小时后，通过将板向一侧倾斜从每个孔中取出内容物，然后将它们转移到新的六孔板中。用 DPBS 冲洗通道并加入新鲜培养基。
    注意:用铝箔盖住板，直到测量吸光度。在所有孔中保持一致的试剂体积，以确保读数均匀。移液时，请小心避免引入气泡，否则会影响光密度读数的准确性。
  5. 轻轻摇动板 15 秒以确保颜色均匀混合后，使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。
  6. 按预定义的时间间隔重复此过程。计算每个时间点的平均光密度，并在绘图软件中绘制生长曲线。该曲线表示内皮随时间的相对成熟度。

8. 渗透性测定

  1. 从一个感兴趣的孔中取出培养基。
    注:对于通透性测定，建议分别处理每个孔，以防止其他通道变干，这可能会改变其血管通透性。
  2. 通过将 70 kDa FITC 葡聚糖溶解在 DPBS 中，制备 6 mL 0.1 mg/mL FITC 偶联葡聚糖溶液。
    注:通过将 100 mg FITC 葡聚糖溶解在 5 mL DPBS 中，制备 20 mg/mL FITC 葡聚糖储备液。轻轻涡旋溶液后，将 500 μL 分装到 1.5 mL 试管中，以避免重复冻融循环。这些等分试样可在 -20 °C 下储存最长 6 个月。在进行测定之前，将储备溶液稀释至 0.1 mg/mL 的工作浓度。
  3. 将板牢固地放置在显微镜载物台上，并在相差模式下调整物镜的放大倍率，以确保在视野内感兴趣区域的通道壁以及附近的凝胶清晰可见。
    注意:为了进行有效的渗透性评估，请尝试在视野中最大化感兴趣区域周围的凝胶面积;这方面是准确监测葡聚糖运输的关键。
  4. 聚焦到所需区域后，从相差模式变为荧光模式。在 图像采集 选项卡下，将 FITC 添加到 宽场通道中，并在添加葡聚糖溶液之前采集图像，以计算背景荧光强度。然后，在通道的一侧加入 1 mL FITC 葡聚糖工作溶液，让溶液在静水压差的驱动向井的另一侧。
  5. 以预定的时间间隔采集图像 - 对于高渗透率的通道，频率较高，而对于渗透率较低的通道，频率较低。

9. ImageJ 中的荧光强度测量

  1. 在 ImageJ 图像分析软件中，测量初始时间点 （It1） 的强度、 在后期时间点观察到的平均强度 （It2） 以及背景噪声引起的强度 （Ib），如下所述。使用公式 （1） 计算磁导率系数 （Pd）。T1 和 T2 是指图像采集的初始时间点和后期时间点。
    figure-protocol-1（1）
    1. 启动 ImageJ，并打开在初始时间点采集的图像。
    2. 在 ImageJ 中设置比例。导航到 Analyze |设置 Scale。输入已知的比例和度量单位。
    3. 选择 矩形工具 ，并在需要测量荧光强度的凝胶区域上绘制一个矩形。
    4. 导航到 Analyze |设置 Measurements 并确保选中 Mean gray 值 。
      注:此选项测量所选区域内的平均强度。可以根据给定分析的需要选择其他参数。
    5. 在该区域仍处于选中状态的情况下，导航到 Analyze |测量 或直接按 M。等待 结果 窗口打开，显示平均荧光强度和所选的任何其他参数。
    6. 进行 3 次测量，并在电子表格中计算平均荧光强度值。
    7. 对在随后的时间点 t2 捕获的图像以及添加葡聚糖溶液之前拍摄的图像重复此过程，以计算稍后时间点的荧光强度，以确定背景荧光。

结果

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VOP 平台在尺寸和图案方面具有灵活性，采用多头生物打印系统制造。用 HUVEC 接种空心且能够灌注的通道以促进内皮化，随后通过通透性测定进行评估（图 1A）。为了证明这种方法的多尺度制造能力，我们打印了三种不同的配置:直线、分叉和波纹（图 1B）。通过一种简单的制造方法，可以在标准的六孔板内产生嵌入水凝胶基质中的六个中空、可灌注的血管通道。然后可以用 HUVEC 将这些通道内皮化（图 2A）。细胞迅速附着和增殖以覆盖血管通道的管腔表面（图 2B）。粘附在下腔和上腔表面的细胞在腔内表现出均匀的分布（补充图 S1）。

将板置于加湿培养箱中 3 天，让硅墨水固化，同时确保牺牲图案保持干燥（图 3A）。为了评估通过这些通道的流速，引入了绿色微珠，证明这些通道是有效的可灌注的（补充视频 S1）。在牺牲图案打印过程中，通过将喷嘴尺寸从 22 G 更改为 18 G，通道直径从 558 ± 38 μm 变为 1094 ± 45 μm。此外，通过修改生物打印机的 G 代码 （补充文件 1） 来操纵通道的几何配置，以便能够打印卷积和分叉图案（图 3B）。

与 UV 的交联持续时间优化为 120 秒，支持有效的细胞增殖（补充图 S2）。这种交联持续时间导致了一个更具生理相关性的环境，促进了内皮细胞增殖，这可能是由于水凝胶的平衡机械性能和孔隙率，促进了更好的细胞粘附和随后的增殖。HUVECs 在管腔表面有效增殖，并在接种后第 5 天表现出鹅卵石样形态。在第 1 天、第 3 天和第 5 天进行 CCK8 测定评估内皮的成熟度（图 4A、B）。细胞接种后 5 天通过 CD31 免疫染色验证内皮的成熟，这表明 CD31 位于紧密连接处（图 4D）。

为了评估内皮的屏障功能，我们在成熟第 5 天通过通道灌注 70 kDa 葡聚糖溶液。为了进行比较，选择了没有内皮 （裸露） 的对照通道。随着时间的推移，内皮化通道在血管周围凝胶区域内的荧光变化很小，从而表明内皮有效地维持了其屏障功能。然而，裸通道在血管周围凝胶区域表现出荧光增加，因此表明由于没有内皮，通透性更高（图 4C 和 图 4E）。

figure-results-1
图 1:打印的血管通道的制备及其配置。 （A） 打印的血管通道的制造、内皮化和通透性测定示意图。（B） 该方法中演示的三种配置的示意图:直型、分叉型和波纹型。缩写:VOPs = 板上的容器。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-2
图 2:打印牺牲模型和硅室以及血管通道内皮化的制造时间表。（A） 该图代表孔板的单个孔，AA' 是指沿横截面的视图。（B） 制造过程中涉及的步骤的代表性图像。比例尺 = 5 毫米 （B1），200 微米 （B2-4）。缩写:GelFib = 15% 甲基丙烯酸明胶和 1% 纤维蛋白原，溶于 0.05% w/v 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂溶液中;HUVECs = 人脐静脉内皮细胞。请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-3
图 3:板上的容器。 （A） 打印牺牲模型和硅室后板上容器的粗略图像。（B） 演示具有各种配置和尺寸的血管通道的多尺度制造，并灌注绿色微珠。比例尺 = 200 μm（直通道），1,000 μm（波纹和分叉通道）。缩写:ID = 内径。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-4
图 4:维管通道及其内皮成熟和通透性。 （A） 用绿色荧光蛋白标记的 HUVEC 接种后第 1 天、第 3 天和第 5 天血管通道的荧光显微镜图像，显示第 5 天 HUVEC 的增殖和鹅卵石形态。（B） 在细胞接种后第 1 天、第 3 天和第 5 天用 CCK-8 测定评估内皮成熟。（C） 内皮化 （endothelium +） 和裸露 （endothelium -） 血管通道的通透性测定。（D） CD31 染色的代表性图像说明了 CD31 在第 5 天紧密连接处的定位。（E） 扩散渗透率的量化。比例尺 = 200 μm （A， C， D）。缩写:HUVECs = 人脐静脉内皮细胞;GFP = 绿色荧光蛋白;GFP HUVEC = GFP 标记的 HUVEC;CCK-8 = 细胞计数试剂盒 8;DAPI = 4'6-二脒基-2-苯基吲哚。 请单击此处查看此图的较大版本。

油墨打印参数
喷嘴量规温度 （°C）气压 （kPa）打印头速度 （mm/min）
牺牲墨水183740-48200
20
22
硅油墨225100

表 1:牺牲油墨和硅油墨的打印参数。

补充文件 1:G 代码脚本，其中包含用于 3D 打印六孔板内牺牲模型和硅室的命令。请点击此处下载此文件。

补充图 S1:细胞接种后上下腔表面的代表性图像，显示 GFP-HUVEC 附着在下焦平面和上焦平面。 比例尺 = 200 μm。缩写:UU' = 上焦平面;LL' = 下焦平面。 请点击此处下载此文件。

补充图 S2:GFP-HUVEC 在与 UV （405 nm） 交联的不同持续时间下的增殖。 比例尺 = 200 μm。缩写:HUVECs = 人脐静脉内皮细胞;GFP = 绿色荧光蛋白;GFP HUVEC = GFP 标记的 HUVEC。 请点击此处下载此文件。

补充视频 S1:绿色微珠灌注，显示通过直通道、波纹通道和分叉通道的有效灌注。请点击此处下载此文件。

补充表 S1:G 代码和 M 代码命令的功能。 注意: 在 G 代码中，X、Y 和 Z 分别表示沿 X 轴、Y 轴和 Z 轴移动的坐标。 请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用 3D 生物打印技术的精度、自动化和计算机控制特性，我们建立了一种在标准六孔板中制造血管通道的简化方法，选择该方法是因为它们与商用酶标仪和显微镜成像装置兼容。该板的设计可以容纳多尺寸通道和足够体积的介质，以适应更大通道的增长，同时减少介质更换的必要频率。这种设计的未来改编可以适应其他市售的标准孔板，从而提高实验通量并减少材料的使用。

微流体平台通常使用一种称为 PDMS 的有机硅聚合物，因为它无毒、透气且透明度高28。然而，PDMS 的低形状保真度限制了其在基于微挤出的生物打印中的使用，用于具有高形状保真度的芯片制造。SE170029 是另一种有机硅聚合物，在构建生活用纸制造腔室时具有更高的精度，但其高粘度需要更大的喷嘴和较大的气动压力。我们配制了 SE1700 和 PDMS 的混合物，可与较小的喷嘴一起使用，从而能够在狭窄区域内以高精度和形状保真度进行制造。其他类型的聚合物，如聚己内酯 （PCL） 或聚乙烯醋酸乙烯酯 （PEVA），考虑到它们的高形状保真度30，也可用于腔室打印。

GelMA 的光学透明度也至关重要31。与其他基于 ECM 的水凝胶（例如胶原蛋白）相比，胶原蛋白在交联后变得不透明，GelMA 保持透明度，因此即使在通道大小增加的情况下，也可以进行通道内的实时细胞分析。当结构的大小增加时，与需要薄片进行观察的方法相比，这方面提供了主要优势32。GelMA 的生物降解性有助于在崩解时用新的功能性组织替换 ECM 支架，从而为新形成的功能组织的生长提供必要的空间33,34。此外，其经验证的低细胞毒性使其非常适合组织工程应用35,36。GelMA 出色的机械特性使其成为血管组织工程应用的良好候选者37。它在促进 HUVEC 血管内皮化方面的有效性已得到充分证明38。

本研究中用于内皮化的细胞 HUVEC 表现出很高的分离成功率，是检查各种心血管和代谢疾病的特殊模型39。然而，这种方法可以定制以适应不同类型的内皮细胞，包括来自动脉或直接来自患者的内皮细胞。这种适应性能够创建患者特异性血管组织模型，从而有助于评估个体对特定药物的反应。

该协议有一些关键步骤供读者牢记。首先，等离子体处理对于改变板的表面特性至关重要，特别是为了增强亲水性，因为大多数商业孔板都是疏水性的。等离子体处理在表面引入极性官能团，从而提高了与硅室和水凝胶的粘合能力。其次，温度控制至关重要，因为牺牲油墨在较低温度下会液化，而硅油墨需要较低的温度以防止过早固化，这会阻碍油墨通过喷嘴挤出。第三，彻底去除所有痕迹的 PF127 至关重要，因为任何残留的 PF127 都会对细胞过程产生不利影响，例如干扰细胞粘附40。第四，在细胞培养过程中，如果细胞生长到超过 90% 的汇合度，它们会因为争夺空间和营养物质而承受压力。这种压力会导致细胞行为改变、细胞活力降低和细胞微环境改变。为了维持细胞健康和正常增殖，建议将培养物的汇合度保持在 90% 以下。第五，重要的是在倒置前后保持板在培养箱内平整，以实现通道内均匀的细胞粘附并最终均匀的内皮化。最后，在图像采集过程中保持一致的曝光时间、激发激光强度和显微镜聚焦至关重要，因为这些参数的变化可能会改变发射信号的强度，从而可能影响结果的准确性。

我们的方法允许创建多种配置的通道，例如此处演示的 straight 、 bifurcated 和 convoluted 模式。这种适应性对于复制人体中不同的血管网络几何形状至关重要，并且超越了传统方法的能力，例如围绕模具铸造水凝胶或用于管状结构的基于同心喷嘴的生物打印技术 30,41,42。然而，这种方法的一个局限性是它不能确保通道的圆度，因为牺牲图案是布置在平坦的表面上的。

构建多种尺寸通道的优势是克服微流体平台局限性的关键，微流体平台通常仅限于微通道。这种限制可能是传统生化分析的一个缺点。例如，为了获得足够的材料进行标准蛋白质表达测定（如 western blotting），必须将几种微流控设备的输出相结合。此外，当形成空心通道时，水凝胶必须保持足够的刚度以承受针头移除过程。我们的方法使用热可逆牺牲材料，当温度降低时，该材料会变成液体，从而促进这一过程而不会破坏凝胶的完整性。此外，其他热可逆胶凝材料，如明胶43，也可以用作该方法中的牺牲材料。

这种方法可以轻松定制板上的组织结构，从而为药物发现中的药理学测试提供有前途的工具。该方法可以通过评估药物对血管通透性的影响来促进药物的筛选，血管通透性是开发与血管功能障碍相关的疾病疗法的关键因素。我们的模型可用于研究特定条件下（如炎症）下的血管通透性，并开发血管正常化策略，这与治疗涉及异常血管通透性的各种疾病有关44，促进对这一过程的理解，并开发潜在的临床应用45。

为了评估血管通透性，我们通过血管通道灌注了 70 kDa 葡聚糖。通常，健康的血管内皮是该分子量46 的葡聚糖分子的有效屏障。然而，在存在炎症的情况下，紧密连接会发生破坏，使这些分子泄漏，从而增加血管通透性30。此外，荧光标记的葡聚糖用于评估药物在工程组织内的分布47。尽管通道内的双向流动和有限的控制溢流动力学是该模型的局限性，但我们认为最终用户将能够通过使用定制的摇臂来控制通道内的流动动力学，从而根据他们的要求调整系统。这种适应可能包括无泵单向流48 的实施。

将来，这种制造方法可以扩大规模以构建复杂的组织。通过将其他类型的细胞精确定位在血管通道附近，可以创建可灌注的血管化组织，从而克服生物打印体积组织的主要挑战。我们还相信，这种方法可以适用于以高通量方式模拟其他类型的中空、可灌注组织，例如淋巴管和肠道，用于各种生物医学应用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有竞争性的经济利益。

致谢

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这项工作得到了韩国政府（科学和信息通信技术部，MSIT）资助的韩国国家研究基金会 （NRF） 资助的支持 [No.NRF-2019R1C1C1009606;编号 2020R1A5A8018367;和否。RS-2024-00423107]。这项研究得到了 MSIT 资助的 NRF 赠款的生物和医疗技术开发计划的支持 [No.NRF-2022M3A9E4017151 和编号。NRF-2022M3A9E4082654]。这项工作得到了由贸易、工业和能源部（韩国 MOTIE）资助的技术创新计划 [第 20015148 号] 和炼金术士项目 [第 20012378 号]的支持。这项工作还得到了韩国食品、农业和林业技术规划与评估研究所 （IPET） 通过农业和食品融合技术计划的支持，该计划由农业、食品和农村事务部 （MAFRA） 资助，用于研究人力开发 [No.RS-2024-00397026]。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液器SPL SPL91010
10 mL 注射器 Shinchang Medical
15 mL 锥形管SPL50015
3D 生物打印机 T&R Biofab3DX 打印机
6 孔板 SPL37206
生物安全柜CHC LABPCHC-777A2-04， 
明场倒置显微镜徕卡DMi1
细胞计数试剂盒 （CCK8）GlpBioGK10001
细胞计数试剂盒 （CCK8）GlpBioGK10001
细胞培养瓶 75TSPL70075
康宁基质胶生长因子还原 （GFR） 基底膜基质，不含 LDEV，10 mL康宁354230
蒸馏水
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO，细胞培养级Sigma aldrichD2438
Dow-Corning，PDMS-Sylgard 184a 试剂盒DOWDC-184
DOWSIL SE 1700 透明 W/C 1.1 KG 试剂盒 陶氏2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
内皮细胞生长培养基 MV 2（即用型）PromocellC-22022
Eppendorf 微量移液器（1000,200,100,20,10）eppendorf
99.9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
来自牛血浆的纤维蛋白原Sigma AldrichF8630-1G
FITC 葡聚糖 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
荧光珠（1.0 &μ;m， green）Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-powder （甲基丙烯酸明胶） 50 g3D 材料 20JT29
Gibco，回收细胞培养冻存培养基，50 mLGibco
HUVEC（人脐静脉内皮细胞）Promocell
ImageJ 软件NIH
培养箱Thermo SCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 培养箱
Invitrogen，活/死活力/细胞毒性试剂盒（用于哺乳动物细胞）Thermo FisherL3224
苯基锂（2,4,6-三甲基苯甲酰基）磷酸盐粉末 Tokoyo Chemical Industry CO. 东阳化学工业公司85073-19-4 
Marienfeld Superior， 计数室盖Marienfeld Superior
Marienfeld Superior， 血球计数器， 细胞计数室Marienfeld SuperiorHSU-0650030
微量离心机eppendorf离心机 5920 R
NCViewer.com
氮气罐WORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Omnicure 紫外激光器EXCELITAS系列 1500
封口膜 MamcorPM-996
青霉素-链霉素溶液 （100x）GenDEPOTCA005-010
行星式混合器THINKY CORPORATION， japanARE-310
等离子处理机FEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
预制缓冲液，（P2007-1） 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
储存柜ZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
实时活细胞成像显微镜Carl ZEISS
冰箱SAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D 数字IKA4003000
勺刮刀缓存由SL-SCO7001-EA
sigma，胰蛋白酶-EDTA 分离，0.25%Sigma aldrichT4049-100ML
十二烷基硫酸钠 （SDS）Thermo Fisher scientific151-21-3
注射器桶尖盖FISNAR3051806
Tally 计数器控制公司 C23-147-050
锥形喷嘴 （18 G）MushashiTPND-18G-U
锥形喷嘴 （22 G）MushashiTPND-22G-U
锥形喷嘴 20 GMusashiTPND-20G-U
来自牛血浆的凝血酶Sigma AldrichT7326-1KU
定时器，4 通道ETLSL。Tim3005
台盼蓝溶液 0.4%Gibco15250061
胰蛋白酶中和液PromocellC-41120
UG 24 mL UG 软膏罐YamayuNo. 3-53
UG 58 mL UG 软膏罐YamayuNo. 3-55
水浴DAIHAN ScientificWB-11
举重机赛多利斯bce2241-1skr
乙醇 试剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
  2. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends Mol Med. 27 (4), 314-331 (2021).
  3. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Ups J Med Sci. 120 (3), (2015).
  4. Wautier, J. -L., Wautier, M. -P. Vascular Permeability in Diseases. Int. J. Mol. Sci. 23 (7), (2022).
  5. Higashi, Y., Kihara, Y., Noma, K. Endothelial dysfunction and hypertension in aging. Hypertens Res. 35 (11), (2012).
  6. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med (Lausanne). 8, 798958(2022).
  7. Park, W., Lee, J. -S., Gao, G., Kim, B. S., Cho, D. -W. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 14 (1), 7696(2023).
  8. Sun, H. -J., Wu, Z. -Y., Nie, X. -W., Bian, J. -S. Role of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the link between inflammation and hydrogen sulfide. Front Pharmacol. 10, 1568(2020).
  9. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier.". Front Neurosci. 17, 1047778(2023).
  10. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  11. De Vriese, A. S., Verbeuren, T. J., Van de Voorde, J., Lameire, N. H., Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction in diabetes. Br J Pharmacol. 130 (5), 963-974 (2000).
  12. Wang, K., et al. Inflammatory environment promotes the adhesion of tumor cells to brain microvascular endothelial cells. Front Oncol. 11, 691771(2021).
  13. Tiwary, S., et al. Metastatic brain tumors disrupt the blood-brain barrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of the endothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a. Sci Rep. 8 (1), 8267(2018).
  14. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2 (1), 281-298 (2011).
  15. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC Basic Transl Sci. 4 (7), 845-854 (2019).
  16. Morgan, S. J., et al. Use of animal models of human disease for nonclinical safety assessment of novel pharmaceuticals. Toxicol Pathol. 41 (3), 508-518 (2013).
  17. Rotman, D. Can Pfizer deliver. MIT Technology Review. , Available from: https://www.technologyreview.com/2004/02/01/233321/can-pfizer-deliver/ (2004).
  18. Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
  19. Xu, Z., et al. Design and construction of a multi-organ microfluidic chip mimicking the in vivo microenvironment of lung cancer metastasis. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (39), 25840-25847 (2016).
  20. Strobel, H. A., et al. Assembly of tissue-engineered blood vessels with spatially controlled heterogeneities. Tissue Eng Part A. 24 (19-20), 1492-1503 (2018).
  21. Atchison, L., Zhang, H., Cao, K., Truskey, G. A. A Tissue engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome using human iPSC-derived smooth muscle sells. Sci Rep. 7 (1), 8168(2017).
  22. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  23. Gold, K. A., et al. 3D bioprinted multicellular vascular models. Adv Healthc Mater. 10 (21), 2101141(2021).
  24. Tabriz, A. G., Hermida, M. A., Leslie, N. R., Shu, W. Three-dimensional bioprinting of complex cell laden alginate hydrogel structures. Biofabrication. 7 (4), 045012(2015).
  25. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Adv. Funct. Mater. 27 (33), 1700798(2017).
  26. Cho, W. -W., Ahn, M., Kim, B. S., Cho, D. -W. Blood-lymphatic integrated system with heterogeneous melanoma spheroids via in-bath three-dimensional bioprinting for modelling of combinational targeted therapy. Adv Sci (Weinh). 9 (29), 2202093(2022).
  27. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  28. Polacheck, W. J., Kutys, M. L., Tefft, J. B., Chen, C. S. Microfabricated blood vessels for modeling the vascular transport barrier. Nat Protoc. 14 (5), 1425-1454 (2019).
  29. Li, H., et al. Expanding sacrificially printed microfluidic channel-embedded paper devices for construction of volumetric tissue models in vitro. Biofabrication. 12 (4), 045027(2020).
  30. Gao, G., Park, J. Y., Kim, B. S., Jang, J., Cho, D. Coaxial cell printing of freestanding, perfusable, and functional in vitro vascular models for recapitulation of native vascular endothelium pathophysiology. Adv Healthc Mater. 7 (23), 1801102(2018).
  31. Farasatkia, A., Kharaziha, M., Ashrafizadeh, F., Salehi, S. Transparent silk/gelatin methacrylate (GelMA) fibrillar film for corneal regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 120, 111744(2021).
  32. Duong, V. T., et al. Double-layered blood vessels over 3 mm in diameter extruded by the inverse-gravity technique. Biofabrication. 15 (4), 045022(2023).
  33. Luo, L., et al. Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries. Bioact Mater. 6 (3), 638-654 (2021).
  34. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  35. Wang, Y., et al. Development of a photo-crosslinking, biodegradable GelMA/PEGDA hydrogel for guided bone regeneration materials. Materials. 11 (8), 1345(2018).
  36. Han, Y., et al. Biomimetic injectable hydrogel microspheres with enhanced lubrication and controllable drug release for the treatment of osteoarthritis. Bioact Mater. 6 (10), 3596-3607 (2021).
  37. Bupphathong, S., et al. Gelatin methacrylate hydrogel for tissue engineering applications-a review on material modifications. Pharmaceuticals. 15 (2), 171(2022).
  38. Wu, Z., et al. Microfluidic printing of tunable hollow microfibers for vascular tissue engineering. Adv Mater Technol. 6 (8), 2000683(2021).
  39. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., Jacobo-Albavera, L. Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review. Appl. Sci. 10 (3), 938(2020).
  40. Khattak, S. F., Bhatia, S. R., Roberts, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Eng. 11 (5-6), 974-983 (2005).
  41. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  42. Kim, S. -J., et al. Bioprinting methods for fabricating in vitro tubular blood vessel models. Cyborg Bionic Syst. 4, 0043(2023).
  43. Maji, S., Lee, M., Lee, J., Lee, J., Lee, H. Development of lumen-based perfusable 3D liver in vitro model using single-step bioprinting with composite bioinks. Mater Today Bio. 21, 100723(2023).
  44. Pauty, J., et al. A vascular permeability assay using an in vitro human microvessel model mimicking the inflammatory condition. Nanotheranostics. 1 (1), 103-113 (2017).
  45. van Duinen, V., et al. 96 perfusable blood vessels to study vascular permeability in vitro. Sci Rep. 7 (1), 18071(2017).
  46. Pink, D. B. S., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS ONE. 7 (3), e33760(2012).
  47. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. AAdv Healthc Mater. 12 (18), 2300151(2023).
  48. Zhang, F., Lin, D. S. Y., Rajasekar, S., Sotra, A., Zhang, B. Pump-less platform enables long-term recirculating perfusion of 3D printed tubular tissues. Adv Healthc Mater. 12 (27), 2300423(2023).

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