量化小鼠不同肺小叶中的肺微血管密度

摘要

本文介绍一种简单且经济的实验方案，利用Isolectin B₄单染色法对整只小鼠肺组织中的肺微血管密度进行无偏定量分析。

摘要

肺血管生成的异常交替与肺微血管功能障碍相关，并与血管壁完整性、血流调节及气体交换密切相关。在小鼠模型中，肺叶在大小、形状、位置和血管化程度方面存在显著差异，但现有方法在量化微血管密度时往往未考虑这些差异。这一局限性阻碍了对肺微血管功能障碍以及不同肺小叶间微血管循环潜在重塑的全面研究。本方案通过采用两种切片方法，结合小鼠不同肺叶气道分支的大小、形状和分布特征，来量化肺微血管密度的变化，从而弥补这一不足。随后，我们利用凝集素Isolectin B₄（IB₄）染色标记不同切片上的肺微血管内皮细胞，并使用免费开源软件ImageJ进行无偏倚的微血管密度分析。本文展示的结果揭示了在衰老过程中，不同肺小叶微血管密度变化程度的差异，比较了年轻与老年小鼠之间的变化。该方案提供了一种简便且经济的方法，用于无偏倚地量化肺微血管密度，有助于推动肺微血管在生理与病理状态下的研究。

引言

内皮细胞（ECs）是一类特殊的细胞，位于血管内壁，覆盖整个动脉和静脉系统，在维持血管和器官稳定性方面发挥着关键作用¹。肺是高度血管化的器官，内皮细胞在肺中具有重要的生理和病理功能，例如构成血管壁、调节血流、促进气体交换、调控炎症反应、控制血小板活性、分泌参与血管生长与修复的调节物质，以及维持凝血平衡。

肺微血管内皮细胞（LMECs）是肺组织特有的内皮细胞，主要分布于肺部的微血管系统（毛细血管），从而区别于肺内更为普遍的动脉和静脉内皮细胞。这些细胞具有多种功能，包括调节血管张力、控制血管通透性、参与炎症反应的调控以及调节血栓形成。它们在肺循环中发挥关键作用，调控气体交换和营养物质的运输，并参与多种与肺相关的生理和病理过程，可能也涉及衰老过程²。此外，肺血管生成的异常改变与肺微血管功能障碍相关³。Larissa L. 等人利用传统的内皮细胞标志物CD31及空间定位（特指肺的外周区域）发现，与年轻小鼠（4月龄）相比，老年小鼠（18月龄）的微血管内皮细胞密度显著降低⁴。在哮喘相关肺部病理背景下，Makoto H. 等人通过使用抗胶原蛋白IV染色的支气管活检标本，发现哮喘患者较对照组出现明显的血管诱导增加^5<....

方案

所有实验均遵循四川大学动物研究委员会伦理指南（编号 K2023023）进行。

1. 小鼠肺叶石蜡切片的制备

1. 获取小鼠肺组织。
   1. 选择6周龄和16月龄的雄性C57Bl/6小鼠，以评估不同年龄组小鼠肺组织中的微血管密度。
   2. 通过腹腔注射给予小鼠100 mg/kg戊巴比妥钠。麻醉后通过颈椎脱臼法处死小鼠，打开胸腔并获取肺组织。
2. 制备石蜡切片。
   1. 将组织置于体积为其10倍的4%多聚甲醛溶液中固定，以保存其形态结构并防止降解。
      注：近期开发了一种新的方法，在小鼠肺血管灌注固定过程中同时进行气道充气。据报道，该方法能更好地保存气道、肺泡细胞和间质的形态与位置，更适合肺组织学研究。建议具备相应设备、耗材及自制工具的实验室采用此方法⁸。
   2. 切割肺叶以确定包埋方向（图1）。
      1. 固定3小时后，在肉眼直视下分离五个肺叶，并分别包埋右肺的前叶、中叶和副叶，切片方向沿肺叶与支气管连接的垂直方向。
      2. 将右肺后叶沿垂直于肺叶-支气管连接的方向从左至右切成两段，每段约4 mm厚，并将切面朝上包埋于石蜡块中。
      3. 对左肺叶进行三次切割....

结果

为了区分主支气管与小气道分支中的病灶，关键在于观察这两类气道中病灶的连续结构。这可通过遵循图1中所示的切片与包埋步骤来实现。由于小鼠肺叶数量较多，方向各异，且具有网状结构，相较于其他实体组织更易发生塌陷。为实现对目标区域病灶的清晰直观观察，建议在切片前将组织样本固定数小时。

图1：小鼠肺叶的代表性照片显示共有5个不同的肺叶。 左肺为单个肺叶，而右肺分为四个肺叶（从上到下依次为：尖叶、中叶、副叶和后叶）。下方箭头指示了每个肺叶的切面方向和包.......

讨论

肺微血管密度的研究对于理解肺部生理过程以及确定呼吸系统疾病的生物标志物具有重要意义。肺循环拥有广阔的毛细血管表面积，其表面被一层纤细的内皮细胞包裹。这些内皮细胞与肺泡上皮细胞协调排列，形成脆弱的肺泡-毛细血管膜，专门用于促进复杂的气体交换过程³。此类细胞间的通讯在调节多种肺部生理过程中发挥关键作用，凸显了这种紧密关联在维持呼吸功能精细平衡中的重要性。因此，研究肺微血管的变化对于评估肺部气体交换这一基本功能至关重要。此外，微血管密度的变化与血流调节直接相关。微血管密度的改变可能影响血液灌注，进而导致低氧血症或肺部及其他组织氧输送受损等状况。内皮细胞被认为是信号传导的核心，可协调组织再生，并有助于防止失控的、促进疾病的病理过程^9,10。对异常肺微血管密度进行可靠评估，对于判断肺部微环境中血管稳态具有重要意义。

本方案通过IB₄染色法提供了一种简单且经济的小鼠肺微血管密度无偏定量方法。必须认识到，小鼠肺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL539A	组织固定剂
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	MCE	HY-D0814	核酸染料
Alexa-647 荧光标记异凝集素 B4	Thermo	I32450	微血管结合剂
抗荧光封片剂	Abcam	AB104135	样本固定
抗原修复液	Biosharp	BL151A	抗原位点修复
活检盒	ActivFlo	39LC-500-1	组织样本的固定与定位
牛血清白蛋白	Sigma	B2064-50G	封闭液
冷冻板	Leica	HistoCore Arcadia H	样本冷冻
恒温电热干燥箱	Taisite	101-0AB	高温修复
一次性切片刀	Leica	14035838383	切割组织样本以制备切片
包埋模具	Shitai	26155166627	组织样本固定
乙醇	Kelong	CAS 64-17-5	组织脱水液
加热式石蜡包埋工作站	Leica	EG1150	将组织样本包埋于石蜡中
HistoCore 水浴锅	Leica	HI1220	展平并固定组织切片
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	定量分析工具
免疫组化笔	Biosharp	BC004	防水隔离剂
医用镊子	上海医疗器械	N/A	夹取、操作或移动组织样本
显微镜	Nikon	Ts2	成像设备
封片介质	江源	Tasteless	固定和保存组织切片
石蜡	SCHLEDEN	80200-0014	固定组织结构
PBS	Beyotime	C0221A	洗涤缓冲液
戊巴比妥钠	北京化学试剂公司	Q/H82-F158-2002	麻醉剂
旋转式切片机	Biobase	Bk-2258	切片制备
无菌剪刀	上海医疗器械	N/A	分割组织样本
手术刀	上海医疗器械	N/A	切割组织样本
Triton	Solarbio	T8200	通透液
免洗载玻片	PLATINUM PRO	PRO-04	染色用样本固定
二甲苯	SUM	XK13-011-00031	组织脱蜡液