量化小鼠不同肺小叶中的肺微血管密度

摘要

本文介绍一种简单且经济的实验方案，利用Isolectin B₄单染色法对整只小鼠肺组织中的肺微血管密度进行无偏定量分析。

摘要

肺血管生成的异常交替与肺微血管功能障碍相关，并与血管壁完整性、血流调节及气体交换密切相关。在小鼠模型中，肺叶在大小、形状、位置和血管化程度方面存在显著差异，但现有方法在量化微血管密度时往往未考虑这些差异。这一局限性阻碍了对肺微血管功能障碍以及不同肺小叶间微血管循环潜在重塑的全面研究。本方案通过采用两种切片方法，结合小鼠不同肺叶气道分支的大小、形状和分布特征，来量化肺微血管密度的变化，从而弥补这一不足。随后，我们利用凝集素Isolectin B₄（IB₄）染色标记不同切片上的肺微血管内皮细胞，并使用免费开源软件ImageJ进行无偏倚的微血管密度分析。本文展示的结果揭示了在衰老过程中，不同肺小叶微血管密度变化程度的差异，比较了年轻与老年小鼠之间的变化。该方案提供了一种简便且经济的方法，用于无偏倚地量化肺微血管密度，有助于推动肺微血管在生理与病理状态下的研究。

引言

内皮细胞（ECs）是一类特殊的细胞，位于血管内壁，覆盖整个动脉和静脉系统，在维持血管和器官稳定性方面发挥着关键作用¹。肺是高度血管化的器官，内皮细胞在肺中具有重要的生理和病理功能，例如构成血管壁、调节血流、促进气体交换、调控炎症反应、控制血小板活性、分泌参与血管生长与修复的调节物质，以及维持凝血平衡。

肺微血管内皮细胞（LMECs）是肺组织特有的内皮细胞，主要分布于肺部的微血管系统（毛细血管），从而区别于肺内更为普遍的动脉和静脉内皮细胞。这些细胞具有多种功能，包括调节血管张力、控制血管通透性、参与炎症反应的调控以及调节血栓形成。它们在肺循环中发挥关键作用，调控气体交换和营养物质的运输，并参与多种与肺相关的生理和病理过程，可能也涉及衰老过程²。此外，肺血管生成的异常改变与肺微血管功能障碍相关³。Larissa L. 等人利用传统的内皮细胞标志物CD31及空间定位（特指肺的外周区域）发现，与年轻小鼠（4月龄）相比，老年小鼠（18月龄）的微血管内皮细胞密度显著降低⁴。在哮喘相关肺部病理背景下，Makoto H. 等人通过使用抗胶原蛋白IV染色的支气管活检标本，发现哮喘患者较对照组出现明显的血管诱导增加⁵。最近，Maximilian A. 等人通过引入透射和扫描电子显微镜技术，报道了因Covid-19或甲型流感（H1N1）死亡的患者中，与套入式和出芽性血管生成相关的结构数量密度显著升高⁶。显然，微血管生成的异常与肺功能障碍密切相关。然而，目前尚无简单且经济的方法可用于量化微血管密度的变化。

在小鼠模型中，肺通常被分为五个不同的叶：右前叶、右中叶、右后叶、左前叶和左后叶。每个肺叶在大小、形状、位置以及可能的血管化方面均表现出独特的特征，有助于高效的气体交换，并可能协同调节肺循环。然而，据我们所知，目前尚无研究方法在探讨肺微血管变化时考虑了这些肺叶之间的差异。

本研究介绍了一种利用IB对小鼠小叶进行切片的新方法₄肺微血管内皮细胞的明确标志物⁷，用于对肺部微血管密度进行无偏定量评估。这种创新方法通过考虑小鼠各肺叶的独特特性，满足了更全面理解小鼠肺部微血管变化的需求。作为示例，在衰老过程中 小鼠肺部出现显著减少
微血管密度被特异性地观察到 在尾状叶和左叶内。 该方案强调了将肺叶特异性分析整合到小鼠肺部微血管结构变化研究中的重要性。值得注意的是，该方法为研究人员提供了宝贵的技术参考，有助于全面理解肺部发育及病变的生理与病理进展过程，其应用范围超越了血管生成研究。

方案

所有实验均遵循四川大学动物研究委员会伦理指南（编号 K2023023）进行。

1. 小鼠肺叶石蜡切片的制备

1. 获取小鼠肺组织。
   1. 选择6周龄和16月龄的雄性C57Bl/6小鼠，以评估不同年龄组小鼠肺组织中的微血管密度。
   2. 通过腹腔注射给予小鼠100 mg/kg戊巴比妥钠。麻醉后通过颈椎脱臼法处死小鼠，打开胸腔并获取肺组织。
2. 制备石蜡切片。
   1. 将组织置于体积为其10倍的4%多聚甲醛溶液中固定，以保存其形态结构并防止降解。
      注：近期开发了一种新的方法，在小鼠肺血管灌注固定过程中同时进行气道充气。据报道，该方法能更好地保存气道、肺泡细胞和间质的形态与位置，更适合肺组织学研究。建议具备相应设备、耗材及自制工具的实验室采用此方法⁸。
   2. 切割肺叶以确定包埋方向（图1）。
      1. 固定3小时后，在肉眼直视下分离五个肺叶，并分别包埋右肺的前叶、中叶和副叶，切片方向沿肺叶与支气管连接的垂直方向。
      2. 将右肺后叶沿垂直于肺叶-支气管连接的方向从左至右切成两段，每段约4 mm厚，并将切面朝上包埋于石蜡块中。
      3. 对左肺叶进行三次切割：第一次在主支气管分叉上方横向切割，距顶端2 mm；第二次在同一分叉上方横向切割，距顶端5 mm；第三次在肺叶末端切割，距顶端8 mm。弃去最上方的一小块组织，将其余三块组织切面朝上包埋于同一石蜡块中。
         注：当多个肺组织块需一同包埋时，可用显微镜擦镜纸包裹后再放入组织包埋盒中，继续进行脱水处理。
      4. 将组织在固定液中再次固定24小时。
   3. 将组织块放入容器中，在流动水中冲洗15分钟。
   4. 依次将组织置于以下溶液中：65%乙醇30分钟，75%乙醇30分钟，85%乙醇30分钟，95%乙醇I 60分钟，95%乙醇II 60分钟，无水乙醇I 60分钟，无水乙醇II 60分钟，70%乙醇120分钟，80%乙醇120分钟，90%乙醇120分钟，95%乙醇120分钟，无水乙醇I 120分钟，无水乙醇II 120分钟。
   5. 将组织置于二甲苯I中30分钟，二甲苯II中30分钟。
   6. 将组织置于低于54 °C的软蜡中1小时，58 °C的硬蜡I中1小时，58 °C的硬蜡II中30分钟。
   7. 选择合适大小的模具，加入适量液态石蜡，用镊子将组织按正确方向置于包埋框中央，并放入包埋机冷冻区，用镊子轻轻压平组织。
   8. 当石蜡开始略微变白时，迅速将未加盖的包埋框置于模具上方，进行第二次注蜡，封闭包埋框底部的孔洞，然后将整个模具转移至冷冻台完成成型。
   9. 将石蜡块固定于切片机上，经粗修和细修暴露出平整光滑的切面后，旋转切片机手轮，切出厚度为4 µm的切片。
   10. 将切下的切片按顺序平稳地放置于水面上。待切片完全展开后，在各切片之间的连接处将断裂部分分开。
   11. 将载玻片斜置于切片下方，接触水面后，缓慢而均匀地垂直提起载玻片，使切片粘附于载玻片表面。

2. 肺微血管的免疫荧光染色检测

1. 将石蜡包埋切片置于65 °C烘箱中孵育60分钟。
2. 将切片置于载玻片架上，并在染色缸中依次进行以下步骤：分别浸入二甲苯1、二甲苯2和二甲苯3中各15分钟，随后浸入二甲苯/乙醇（1:1）中5分钟，再依次浸入100%乙醇#1、100%乙醇#2、85%乙醇、75%乙醇和蒸馏水中，每步各5分钟。
3. 用去离子水将改良的柠檬酸钠抗原修复液稀释50倍。将微波炉调至高功率预热至沸腾，然后将载玻片放入抗原修复液中。保持载玻片在修复液中沸腾15分钟，随后自然冷却至室温。
4. 用PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。用0.25% Triton通透两次，每次10分钟。
5. 用免疫组化笔在组织周围画圈，并在室温下用5% BSA封闭1小时。用PBS洗涤一次，每次5分钟。
6. 进行Alexa-647荧光标记的IB₄与DAPI染色。
   1. 将IB₄置于冰上，用1% BSA按1:50稀释。去除画圈周围多余液体，向每张组织切片加入50–100 µL稀释后的IB₄，4 °C孵育过夜（从本步骤开始，所有操作均需避光进行）。
   2. 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。用0.25% Triton通透10分钟。
7. 将DAPI（10 µg/mL）用PBS按1:10稀释，每张组织切片加入50–100 µL，室温孵育5分钟。
8. 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
9. 向载玻片滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，避免光照。室温晾干后，在荧光显微镜下观察并采集细胞核及目标信号的图像。

3. 肺微血管密度的定量分析

1. 获取图像。
   1. 在年轻组和老年组中，针对每个肺叶，在10倍物镜下观察肺微血管密度信号和DAPI信号。
   2. 根据观察结果，对每个通道的光源强度和曝光时间进行标准化。采集覆盖每个肺叶整个区域的双通道图像。将图像以 ND2 格式保存，包含两个通道（图2).
2. 使用 Image J 进行定量分析（补充图1).
   1. 启动 ImageJ 软件。
   2. 将指定图像导入 ImageJ，然后加载并选中图像。相应地拆分通道。以 ND2 格式分别加载 DAPI 和 IB 文件₄ 通道
   3. 导航至 分析 > 设定比例尺 > 将图像参数设置为 0.48 µm/像素 （取决于摄影参数） > 全球 > 好的.
   4. 设置相同的显示范围以调整图像呈现效果。选择 图像> 调节 > 亮度/对比度 > 设置. 分别为两个通道设置显示范围，IB₄：0-10000；DAPI：0-20000。
   5. 为消除背景信号的影响，请执行以下步骤：单击 过程 > 数学 > 减去；根据检测到的信号值减去背景信号 魔杖 背景上的工具，IB₄: 3000；DAPI:300
   6. 为了选择最符合原始图像的阈值，前往 图像 > 重复.
   7. 选择原始文件和副本 图像 > 类型 > 8 位.
   8. 选择适当的阈值以精确定位肺微血管系统。点击 图像 > 调节 > 阈值 > 介电泳模式 （根据原始图表选择最合理的阈值），勾选 > 暗背景 > 应用.
   9. 消除 IB₄ 小鼠肺部大血管（包括动脉和静脉）中的阳性信号：使用 魔杖 与复制的图像相比，选择较大血管的工具，然后单击 删除 （重复该步骤直至 IB₄ 较大血管内皮细胞中的阳性信号被去除。
      注意：IB₄ 在小鼠肺组织的动脉和静脉内皮细胞中可检测到染色信号。为特异性地观察肺微血管系统的分布情况，建议均匀去除大血管内皮细胞中的信号焦点。
   10. 计数目标信号的数量，点击 分析 > 设置测量参数，以及蜱虫 区域，阈值限制，以及 显示标签然后选择 分析颗粒 并设置 大小0至无穷大 圆形度: 0.00-1.00; 显示：过度遮罩；勾选 总结 并点击 好的.
   11. 选择 总结结果 > 文件 > 保存为.
3. 数据分析与统计学
   1. 匹配并整理 IB 的数量₄ 阳性焦点和DAPI阳性焦点分别在同一图像中整合到一个统一的表格中。
   2. 总结IB的总数₄ 各叶中指定年轻或老龄组的阳性焦点及DAPI阳性焦点
      1. 通过将IB4阳性灶的总数除以总灶数，计算IB4阳性灶的百分比（%）。₄ 各组中每个叶中DAPI染色焦点总数中的阳性焦点数。呈现IB的数量₄ 阳性焦点数、DAPI染色焦点数以及IB的百分比₄ 阳性焦点（%），如图所示 图 3A.
   3. 启动数据分析软件并创建一个新的列联表。
      注意：此处使用 GraphPad Prism 9 进行统计分析。
   4. 依次将它们命名为A组到J组 "幼年颅叶", "旧颅叶", "年轻中叶", "上叶下段", "幼年尾叶", "旧尾叶", "年轻附属叶", "陈旧性副叶", "左外叶（年轻）", "旧左叶"。然后，输入相应的IB₄ 阳性焦点（%）填入表格（补充表1).
   5. 采用非配对t检验进行两两比较，以评估两个年龄组之间相应脑叶区域的显著性差异。针对五个脑叶共进行五次比较。
   6. 创建图表以可视化结果（图3B）。选择柱状图，并在图中包含统计学分析结果。

结果

为了区分主支气管与小气道分支中的病变，关键在于观察这两类气道中病变的连续结构。这可通过遵循图1中所示的切片与包埋步骤来实现。由于小鼠肺叶数量较多，方向各异，且具有网状结构，相较于其他实体组织更易发生塌陷。为实现对目标区域病变的清晰直观观察，建议在切片前将组织样本固定数小时。

图1：小鼠肺叶的代表性照片，显示共5个不同的肺叶。 左肺为单个肺叶，而右肺包含四个肺叶（从上至下依次为：头侧叶、中叶、副叶和尾侧叶）。下方箭头指示了每个肺叶的切面...

讨论

肺微血管密度的研究对于理解肺部生理过程以及确定呼吸系统疾病的生物标志物具有重要意义。肺循环拥有广阔的毛细血管表面积，其表面被一层纤细的内皮细胞包裹。这些内皮细胞与肺泡上皮细胞协调排列，形成脆弱的肺泡-毛细血管膜，专门用于促进复杂的气体交换过程³。此类细胞间的通讯在调节多种肺部生理过程中发挥关键作用，凸显了这种紧密关联在维持呼吸功能精细平衡中的重要性。因此，研究肺微血管的变化对于评估肺部气体交换这一基本功能至关重要。此外，微血管密度的变化与血流调节直接相关。微血管密度的改变可能影响血液灌注，进而导致低氧血症或肺部及其他组织氧输送受损等状况。内皮细胞被认为是信号传导的核心，可协调组织再生，并有助于防止失控的、促进疾病的病理过程^9,10。对异常肺微血管密度进行可靠评估，对于判断肺部微环境中血管稳态具有重要意义。

本方案通过IB₄染色法提供了一种简单且经济的小鼠肺微血管密度无偏定量方法。必须认识到，小鼠肺...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL539A	组织固定剂
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	MCE	HY-D0814	核酸染料
Alexa-647 荧光标记异凝集素 B4	Thermo	I32450	微血管结合剂
抗荧光封片剂	Abcam	AB104135	样本固定
抗原修复液	Biosharp	BL151A	抗原位点修复
活检盒	ActivFlo	39LC-500-1	组织样本的固定与定位
牛血清白蛋白	Sigma	B2064-50G	封闭液
冷冻板	Leica	HistoCore Arcadia H	样本冷冻
恒温电热干燥箱	Taisite	101-0AB	高温修复
一次性切片刀	Leica	14035838383	切割组织样本以制备切片
包埋模具	Shitai	26155166627	组织样本固定
乙醇	Kelong	CAS 64-17-5	组织脱水液
加热式石蜡包埋工作站	Leica	EG1150	将组织样本包埋于石蜡中
HistoCore 水浴锅	Leica	HI1220	展平并固定组织切片
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	定量分析工具
免疫组化笔	Biosharp	BC004	防水隔离剂
医用镊子	上海医疗器械	N/A	夹取、操作或移动组织样本
显微镜	Nikon	Ts2	成像设备
封片介质	江源	Tasteless	固定和保存组织切片
石蜡	SCHLEDEN	80200-0014	固定组织结构
PBS	Beyotime	C0221A	洗涤缓冲液
戊巴比妥钠	北京化学试剂公司	Q/H82-F158-2002	麻醉剂
旋转式切片机	Biobase	Bk-2258	切片制备
无菌剪刀	上海医疗器械	N/A	分割组织样本
手术刀	上海医疗器械	N/A	切割组织样本
Triton	Solarbio	T8200	通透液
免洗载玻片	PLATINUM PRO	PRO-04	染色用样本固定
二甲苯	SUM	XK13-011-00031	组织脱蜡液