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方法文章

基于泪液外泌体miR-15a的糖尿病视网膜病变新型诊断工具

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DOI：

10.3791/66687

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种从泪液中收集和检测miR-15a的实验方案，作为一种用于糖尿病视网膜病变的新诊断工具。

摘要

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的主要并发症之一，影响着相当大比例的糖尿病患者。早期诊断和干预对于预防不可逆的视力丧失至关重要。目前的诊断方法虽然有效，但仍存在局限性。miRNA 是一种小分子非编码 RNA，可通过与靶 mRNA 的 3'-非翻译区（3'-UTR）结合，抑制 mRNA 的稳定性和/或翻译，近年来被越来越多地认为与糖尿病密切相关，并且可从泪液中获取。本研究探讨了泪液来源的外泌体 miR-15a 作为 DR 新型诊断标志物的潜力。研究共收集了 135 例糖尿病患者（其中 36 例患有糖尿病视网膜病变 [DR]，50 例无 DR）和 49 例健康对照者的泪液样本。分离外泌体后，采用微滴数字 PCR（ddPCR）检测外泌体 miR-15a 的表达水平。结果显示，与健康个体相比，糖尿病及 DR 患者中外泌体 miR-15a 的表达水平发生改变。这些发现表明，来源于泪液的外泌体 miR-15a 可能在糖尿病及其并发症的分子机制中发挥一定作用。此外，它有望成为一种无创、可靠的糖尿病视网膜病变诊断生物标志物，具有高灵敏度和特异性。

引言

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，威胁着全球数百万人的视力。根据国际糖尿病联合会（IDP）2019年 Atlas 的人群数据，全球糖尿病患者中 DR 的总体患病率估计为 22.7%，且新发病例数量持续上升，尤其在发达国家和发展中国家1。临床上，DR 可分为早期 DR 或非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）、晚期 DR 或增殖性糖尿病视网膜病变（PDR），以及是否存在黄斑水肿。NPDR 常见的病理改变包括血管通透性增加和毛细血管阻塞，而 PDR 则表现为虹膜、黄斑、视盘或视网膜的异常新生血管形成2,3。进展至 PDR 阶段可能导致玻璃体出血和视网膜脱离，从而引起显著的视力损害3。在所有情况下，经过培训的眼科医生均可通过检眼镜检查或眼底摄影检查发现这些病理改变4。采用标准眼底摄影方法，糖尿病视网膜病变的检出敏感度为 78%–96%，特异度为 86%–97%5。然而，该方法仅能在视网膜已发生损伤后才能检测到病变。目前仍迫切需要在出现临床可见的视网膜体征（如斑点状视网膜出血、微动脉瘤、渗出物和新生血管增殖）之前，实现对 DR 的早期检测。

分子工具的进步使得外泌体被发现可作为多种疾病（包括癌症和心血管疾病）的潜在诊断工具6,7。外泌体是由大多数细胞分泌到细胞外囊泡（EV）空间中、由脂质双分子层膜包裹的纳米级颗粒。这些外泌体可通过血液、泪液、唾液和尿液等生物流体进行运输，使其能够方便地用于无创或微创诊断程序8。外泌体携带多种来源细胞的标志物，包括蛋白质、脂质和核酸。其中特别受关注的是存在于细胞外囊泡内的小分子非编码RNA。尽管这些RNA不编码蛋白质，但它们在基因调控中发挥关键作用，并已被证实参与多种生理和病理过程，包括在糖尿病发生中具有重要意义的胰岛β细胞中的相关过程9,10。     

已有研究表明，miR-15a 与糖尿病的发生发展密切相关，主要通过调控胰岛素的生成及胰腺β细胞功能实现11。我们课题组近期证实，糖尿病视网膜病变患者的血浆中 miR-15a 水平发生改变。此外，miR-15a 也被证实由胰腺β细胞分泌，并可通过血液循环到达视网膜12。泪液是一种易于获取的体液，可通过非侵入性、低成本的方式从眼部采集13。其成分包含多种蛋白质、脂质、电解质及其他分子，能够反映眼表及周围组织（包括视网膜）的生理状态14。在泪液中检测到的 miRNA 数量多于血清和房水15,16。泪液成分会随多种全身性疾病状态（包括糖尿病）而发生变化17。事实上，已有研究显示，泪液分析在监测和诊断多发性硬化症、乳腺癌等非眼部相关疾病方面具有良好的应用前景18,19。鉴于糖尿病视网膜病变与眼部的直接关联，探索泪液在此类疾病中的潜在诊断价值更具相关性。研究发现，糖尿病视网膜病变患者泪液中 IL-1RA、IL-8、IL-6 和 TNF-α 的水平发生改变，且其变化程度与疾病的严重程度相关20,21。与传统的眼底检查相比，泪液分析在可及性、非侵入性、特异性方面具有潜在优势，且可在疾病发生前实现早期检测22。

因此，本研究的主要目的是通过分离和定量糖尿病视网膜病变人群泪液中的miRNA，探讨泪液来源外泌体miR-15a作为糖尿病视网膜病变新型诊断标志物的潜力。该方法将建立一种通过泪液筛查检测糖尿病视网膜病变的新手段，可在视网膜并发症出现之前即实现早期检测，从而为采取预防性或治疗性干预措施提供可能。

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方案

本研究获得了马来亚大学医学中心医学研究伦理委员会的批准（参考编号：20165-2446）。所有人类受试者在入组前均签署了书面知情同意书。共有135名受试者被纳入研究，均来自吉隆坡马来亚大学医学中心（UMMC）眼科门诊的就诊患者。纳入标准包括在UMMC接受医疗服务且年龄在20至80岁之间的患者。正在接受胰岛素治疗、在过去3个月内接受过激光或抗VEGF治疗，或常规使用抗血小板药物或抗凝药物的患者被排除在研究之外。受试者随后被分为三组：（1）健康对照组（对照组），（2）无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者（DM No DR），（3）伴有糖尿病视网膜病变的糖尿病患者（DR）。研究方案的概要见图1。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

研究流程图：采集泪液、RNA提取、cDNA合成、数字滴定PCR分析。
图1：实验方案概览。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 材料准备    

  1. 准备一个无菌基础敷料包，内含两把镊子、六个棉球、四个纱布垫、一个托盘和一个生物危害袋。
  2. 将 5 mL 的 0.9% w/v 氯化钠冲洗液倒入托盘中。
  3. 打开一包眼睑清洁湿巾，并将其放置在无菌区域。
  4. 准备一支含有 250 µL 防腐液的试管。
  5. 在仍处于包装状态时，将一条 Schirmer 试纸在楔形刻度处折叠，然后将其无菌试纸条放置于无菌区域上。
  6. 以无菌方式戴上外科手套。
  7. 使用一把无菌镊子，用 0.9% w/v 无菌氯化钠冲洗液浸湿棉球。

2. 人类受试者的准备    

  1. 让受试者舒适地坐着，并要求其闭上眼睛。
  2. 使用浸有灌洗液的棉球擦拭眼周皮肤四次。
  3. 用眼睑清洁湿巾擦拭眼周皮肤。

3. 人泪液的采集

  1. 使用放置在颞侧下穹隆处的Schirmer试纸收集泪液。
  2. 将部分折叠的试纸置于右眼时，要求受试者向左注视。下拉下眼睑以暴露下穹隆。
  3. 使用无菌镊子，将Schirmer试纸置于下结膜穹隆外侧三分之二处。避免试纸接触皮肤，以防汗液或其他皮肤物质污染样本。
  4. 在试纸下方放置一块纱布垫，以防止接触皮肤。
  5. 让泪液被试纸吸收，直至达到20 mm标记处或最长5分钟，以先到者为准。
  6. 若未达到20 mm标记线，应根据试纸上已有的刻度记录泪液上升高度，以便标准化泪液体积。
  7. 使用无菌镊子小心取出Schirmer试纸，并将试纸放入含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的试管中。
  8. 将试管放入冷藏盒中，运送到实验室。
  9. 用纱布擦拭皮肤表面残留液体，清洁眼周区域。

4. 泪液样本的预处理    

  1. 将含有浸有PBS的Schirmer试纸条的试管在室温下涡旋振荡5分钟。
  2. 将试管在室温下于摇床上振荡5分钟。
  3. 在4 °C下以2000 × g 离心15分钟。
  4. 将溶液转移至新试管中，标记后于-80 °C保存，直至进行后续处理。
  5. 丢弃剩余的试纸条。

5. 外泌体分离

注意：RNA 提取采用市售试剂盒，按照制造商提供的方案进行（参见材料表）。

  1. 将裂解液置于冰上解冻10分钟。
  2. 使用前于室温下平衡离心柱15分钟。
  3. 取下柱子的下端出口，并将其放置于提供的废液收集板上。
  4. 移除顶部密封垫，使保存缓冲液依靠重力通过柱子。
  5. 加入250 µL PBS，使其通过柱子。
  6. 重复步骤5.5。
  7. 将110 µL样品加至每根柱子的顶部，并让样品进入柱子。
  8. 将柱子转移至提供的样品收集板上。
  9. 加入100 µL PBS，使其通过柱子进入样品收集板。
  10. 将柱子转移回废液收集板上。
  11. 向柱子中加入4次，每次200 µL PBS，并使其进入柱子，以去除第一次上样时的游离蛋白组分。
  12. 向柱子中加入110 µL样品，待其进入柱子。
  13. 将柱子置于样品收集板上，加入100 µL PBS，使其通过柱子。
  14. 将样品收集板短暂离心（100 × g，30秒）。分离得到的外泌体现在可用于RNA提取。

6. RNA 提取

注意：RNA 提取采用市售试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行（参见材料表）。

  1. 取200 µL分离得到的外泌体进行RNA提取。
  2. 向分离的外泌体中加入60 µL裂解缓冲液，涡旋振荡5秒。
  3. 室温孵育3分钟。
  4. 加入20 µL抑制剂沉淀缓冲液，涡旋振荡20秒，室温孵育3分钟。
  5. 在室温下以12,000 x g 离心3分钟。
  6. 将澄清无色的上清液转移至新离心管中。
  7. 加入等体积的异丙醇。
  8. 涡旋振荡5秒，然后将溶液转移至试剂盒提供的微型离心柱中。
  9. 在室温下以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。
  10. 用700 µL RWT洗涤缓冲液洗涤离心柱。
  11. 以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。
  12. 用500 µL RPE洗涤缓冲液洗涤离心柱。
  13. 以8000 x g 离心15秒，弃去穿流液。
  14. 向样品微型离心柱中加入500 µL 80%乙醇。
  15. 以8000 x g 离心2分钟，弃去穿流液和收集管。
  16. 将微型离心柱放入新的2 mL收集管中。
  17. 将离心柱和收集管在18,000 x g 下离心5分钟，弃去穿流液和收集管。
  18. 将微型离心柱转移至新的1.5 mL离心管中，并在离心柱膜中央加入15 µL无RNase水。
  19. 室温孵育3分钟。
  20. 在18,000 x g 下离心1分钟以洗脱RNA。RNA即可用于后续实验。
  21. 进行纳米颗粒追踪分析，以进行质量控制并验证RNA得率。

7. cDNA 合成

  1. 按照制造商说明书，使用市售试剂盒进行 cDNA 合成（参见材料表）。
  2. 根据表 1在 1.5 mL 微量离心管中配制总反应混合液。
  3. 通过移液器吹打混匀溶液。
  4. 将 5.1 µL 总反应混合液加入 0.1 µL PCR 管中。
  5. 向含有总反应混合液的指定 PCR 管中加入 9.9 µL 样品。
  6. 将 PCR 管放入热循环仪中，并按照表 2运行程序。
    注意：cDNA 已准备好用于后续分析。
组分每反应体积
10x RT Buffer1.5 µL 
100M dNTP mix0.15 µL
RNA酶抑制剂 (200U/µL )0.19 µL
Multiscribe RT 酶 (50U/µl )1 µl 
20x RT 引物0.75 µL 
无RNA酶水1.51 µL
样品9.9 µL
总体积15 µL 

表1：从分离的RNA合成cDNA所用的PCR预混液的配制。

步骤温度持续时间
逆转录16 °C30 min
42 °C30 min
终止反应85 °C5 min
保持4 °C

表2：cDNA合成的热循环条件。

8. 数字化液滴PCR

注意：数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）使用市售试剂盒并按照制造商提供的方案进行操作（参见材料表）。

  1. 根据表3，在1.5 mL微量离心管中配制ddPCR的预混液。
  2. 将19.8 µL预混液加入0.1 µL PCR管中，再加入2.2 µL样品，通过上下吹打10次充分混匀。
  3. 将20 µL样品混合液转移至ddPCR微滴生成卡的样品通道中。     
  4. 向卡的油相通道中加入50 µL油相。     
  5. 使用板上的卡扣将垫圈固定在卡上。
  6. 将卡插入微滴生成仪中，听到“咔”声表示卡已正确插入。
  7. 小心地将生成的所有微滴转移至96孔板的孔中。至少设置一个无模板阴性对照孔。
  8. 使用可穿刺封板膜在封板机上密封96孔板（见材料表）。    
  9. 将96孔板放入热循环仪中，并按照表4的程序运行。
  10. 将96孔板转移至微滴读取仪中，计数阳性与阴性微滴。
  11. 根据运行结果得到的每20 µL样品中的拷贝数，计算每毫升样品中的拷贝数。
组分每反应体积
2x ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)10 µL
20x 引物/探针1 µL
样本7 µL 
无RNA酶水2 µL 
总体积20 µL 

表3：用于数字PCR的PCR预混液的配制。

步骤温度持续时间升温速率循环数
酶活化95  °C10 min~2 °C/ s 每步1
变性94 °C30 s40
退火60 °C1 min40
酶失活98 °C10 min1
保持4 °CN/AN/A

表4：数字滴定PCR（ddPCR）的热循环条件。

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结果

标准曲线
建立标准曲线以确定从每位患者收集的泪液确切体积。具体而言，将不同体积（3 µL 至 25 µL）的防腐剂滴加到Schirmer试纸上，并测量Schirmer试纸上湿润区域的长度。每种体积重复操作三次，取平均值。绘制泪液体积与Schirmer试纸湿润长度之间的标准曲线（图2），作为测定收集泪液体积的参考依据。

线性回归图，体积(μL) 对 湿润长度(mm)，Y=1.245X+2.530，R²=0.9931。
图2：泪液收集量与Schirmer试纸上湿润区长度的标准曲线。<...

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讨论

眼底镜检查、光学相干断层扫描和荧光素眼底血管造影是目前可用于糖尿病视网膜病变检测的技术。这三种技术通常联合使用，以对多种视网膜和脉络膜疾病进行全面评估。眼底镜检查是糖尿病视网膜病变评估过程中常规进行的临床检查，由经过培训的眼科医生操作，是诊断糖尿病视网膜病变的金标准。该方法可对视网膜进行详细评估，并能够记录视网膜外观以供后续比较，具备对照片中特定感兴趣区域进行电子放大、以及对图像进行电子存档和传输的能力4,23。光学相干断层扫描利用光波生成视网膜和视神经的高分辨率横断面图像。荧光素眼底血管造影则需要注射特定染料并进行照射，以检测视网膜循环中的异常4。然而，这些检测技术仅适用于疾病发生之后。随着全球糖尿病患者人数预计持续上升24，亟需一种便捷的筛查技术，能够在疾病发生前检测出糖尿病视网膜病变，从而实现密切监测并预防失明。已有若干研究强调了血浆和血清来源的miRNA作为糖尿病诊断工具的潜力25<...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了Alcon研究学会（IF011-2020）和FOM UMSC Care博士后研究基金2021的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% w/v 氯化钠Ain Medicare Sdn BhdGB16165967618
1× 磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific10010-023
Applied Biosystems TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒Applied Biosystems4366596
ddPCR 探针用Supermix（不含dUTP）BioRad Laboratories1863024
ddPCR 96孔板BioRad Laboratories12001925
DG8 微流控芯片BioRad Laboratories1864008
DG8 密封垫圈BioRad Laboratories1863009
探针用微滴生成油BioRad Laboratories1863005
Exospin-96 外泌体分离试剂盒Cell Guidance SystemsEX07-96
miRNeasy 血清/血浆高级提取试剂盒Qiagen 217204
PX1 PCR板封膜仪BioRad Laboratories1814000
QX100 微滴数字PCR系统BioRad LaboratoriesQX100
QXDx 微滴生成仪 BioRad Laboratories12001049
Schirmer试纸条OptitechSCH-100
T100 梯度PCR仪BioRad Laboratories1861096
TaqMan MicroRNA 检测试剂盒 MTOMED 20（检测ID：000389）Applied Biosystems4440887靶序列：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

参考文献

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