棘鼠模型中纤维脂肪生成祖细胞的分离、扩增与分化

摘要

本方案概述了从刺鼠（Acomys）中分离骨骼肌和心肌纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）的方法Acomys) 通过 酶解离与荧光激活细胞分选。通过本方案获得的FAPs可有效扩增，并分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。

摘要

由于其卓越的修复能力，刺毛鼠正成为再生医学领域新兴的研究模型。纤维脂肪生成祖细胞是一类组织驻留细胞，能够分化为脂肪细胞、成纤维细胞和软骨细胞。这类细胞在调控组织再生过程中发挥核心作用，因其负责损伤后细胞外基质的重塑。本研究聚焦于探究纤维脂肪生成祖细胞在刺毛鼠心脏修复与骨骼肌再生中的特定功能。为此，已优化了一套通过流式细胞术从酶解分离的骨骼肌和心肌组织中纯化刺毛鼠纤维脂肪生成祖细胞的实验方案。采用该方案获得的细胞群体具备扩增能力 体外 并可分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。该方案为研究人员提供了一种有价值的工具，用于研究棘鼠的独特特性，并将其与 Mus musculus 这将提供有助于深化理解该有趣模型中再生机制的见解。

引言

最初因其皮肤异常脆弱以及修复皮肤损伤的能力而受到关注，与小家鼠（Mus musculus）相比，棘鼠在多种器官系统（如肌肉骨骼系统、肾脏、中枢神经系统和心血管系统）中均表现出更优越的再生能力^1,2。

纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类存在于多种组织（包括骨骼肌和心肌）中的基质细胞。这些细胞在体内和体外均具有向成纤维细胞系和脂肪细胞系分化的独特能力in vivo 和 in vitro^3,4。FAPs通过调节细胞外基质并支持参与修复过程的其他细胞类型的功能，在组织再生中发挥关键作用。在骨骼肌中，FAPs在损伤后被激活，促进肌肉干细胞的分化和肌生成^5,6。在心脏缺血性损伤中，FAPs形成瘢痕组织以维持心肌的完整性。与骨骼肌不同，心肌FAPs会持续长期激活，并促进病理性重构^7,8。

先前的研究表明，与小家鼠（Mus musculus）相比，刺毛鼠的细胞外基质在组成、结构和特性上有所不同，能够支持组织再生^9,10。在肌肉和心脏损伤中，已发现刺毛鼠的纤维脂肪前体细胞（FAPs）有助于实现更优异的愈合效果^11,12,13。深入了解刺毛鼠FAPs及间质细胞的行为及其调控机制，可能揭示其再生能力背后的分子机制。尽管FAPs已在其他动物模型（如Mus musculus）中被广泛研究^14,15，但目前尚无已发表的刺毛鼠FAPs分离方案。建立此类实验方案将填补该领域的重要空白，并使研究人员能够探究刺毛鼠再生潜能所依赖的细胞与分子机制。

本方案描述了一种稳定且可重复的方法，用于从刺鼠中分离、扩增和分化骨骼肌与心肌的纤维脂肪生成祖细胞（FAP）。本方案可获得高质量的单细胞悬液，适用于荧光激活细胞分选（FACS）。通过使用重组人TGFβ1（rh-TGFβ1）或一种可替代的市售培养基——这两种方法均被广泛用于诱导小家鼠（mus musculus）FAPs的分化¹⁶，分选后的刺鼠FAPs分别保持了向成纤维细胞系和成脂细胞系分化的潜能（图1）。

方案

所有动物饲养和实验操作均依照不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准及不列颠哥伦比亚大学的相关规定进行。动物饲养于封闭的无特定病原体设施中，环境条件为标准条件（12小时光照/12小时黑暗循环，21–23 °C，相对湿度40%–60%），并可自由摄取富含蛋白质的小鼠饲料和饮水。本研究使用成年（4至6月龄，体重50–60 g）雌性和雄性 Acomys dimidiatus 小鼠。所有所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 溶液与缓冲液的配制

1. 配制 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 通过将 4 mL 的 0.5 M EDTA（终浓度 2 mM）与 996 mL 的 1× PBS 混合，配制 PBS-EDTA，pH = 7.4。
3. 将 2.7745 g CaCl₂ 溶于 100 mL 无核酸酶水中，配制 250 mM CaCl₂ 溶液。
4. 配制消化缓冲液：在 DMEM/F12 培养基中加入 50 µg/mL liberase、2.5 mM CaCl₂ 和 5% 胎牛血清（FBS）。
5. 配制 FACS 缓冲液：将 488 mL 的 1× PBS、2 mL 的 0.5 M EDTA 和 10 mL 的 FBS 混合。
6. 配制活率检测缓冲液：将 FACS 缓冲液与碘化丙啶（PI；终浓度 1 µg/mL）混合。
7. 配制基础培养基：将 DMEM/F12 与 5% FBS 和 1%（v/v）青霉素-链霉素（pen/strep）混合。
8. 配制增殖培养基：将 DMEM/F12 与 10% FBS、1%（v/v）青霉素-链霉素和 2.5 ng/mL bFGF 混合。
9. 配制成纤维诱导培养基：将基础培养基与 10 ng/mL rh-TGFβ1 混合。
10. 配制脂肪成脂诱导培养基（1×）：将 DMEM/F12 与 1% 青霉素-链霉素及市售的小鼠成脂分化 10× 补充剂混合。
11. 将 4%（w/v）多聚甲醛（PFA）加入 1× PBS 中，配制 4% PFA 固定液。
12. 将 498.5 mL 的 1× PBS 与 1.5 mL Triton X-100 混合，配制 0.3% PBS-Triton 溶液。
13. 配制驴源封闭缓冲液：将 5%（v/v）驴血清、1% BSA（w/v）和 0.3% PBS-Triton 混合。
14. 配制驴源 + MOM 封闭缓冲液：将 2.5 mL 驴源封闭缓冲液与 2 滴 MOM 封闭液混合。
15. 将 600 nM 的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶于 1× PBS 中，配制 DAPI 染色液。

2. 组织采集

1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南对动物实施安乐死。对于刺鼠，建议使用异氟烷麻醉后，再给予 CO₂（流速为笼体积的20%/分钟），并辅以脊髓离断法以确保动物死亡。
2. 将小鼠仰卧位置于解剖台上，并用70%乙醇充分喷洒，以防止鼠毛污染。
3. 在腹侧中线做2-3 cm的纵向切口，暴露肋骨和腹肌。用组织剪在剑突处剪开肌肉，暴露膈肌。沿两侧剪开膈肌和肋骨。使用止血钳夹住并掀开剪断的肋骨。
4. 用组织剪在右心房处剪一小口，将连接20 mL注射器的23 G针头插入心尖，缓慢注入20 mL 2 mM PBS-EDTA进行灌注。
5. 取出心脏，置于冰上盛有冷1x PBS的60 mm培养皿中冲洗，去除心房组织，并尽可能清除血液残留。
6. 去除膝关节上方的皮肤。使用精细镊子剥离筋膜，以股骨为解剖标志，用剪刀分离股四头肌，并将其放入另一盛有冷1x PBS的培养皿中。
7. 对另一条腿重复步骤2.6。

3. 组织消化

1. 向5 mL运输管中加入2 mL消化缓冲液用于心脏组织，向15 mL离心管中加入4 mL消化缓冲液用于两块股四头肌。
2. 在培养皿盖上用组织剪将组织剪碎至小于1 mm³的片段。
3. 将剪碎的组织分别加入对应的消化管中，低速涡旋振荡2秒以混匀。
4. 在37 °C条件下轻柔旋转并振荡孵育。
5. 20分钟后，从旋转仪上取下离心管，静置使组织碎片沉降，用P1000移液器将上清液转移至含有20 mL冰浴FACS缓冲液的50 mL离心管中。
6. 分别向心脏和肌肉消化管中补充2 mL和4 mL消化缓冲液，重新置于37 °C下进行轻柔旋转和振荡。
7. 再经过20分钟后，重复步骤3.5至步骤3.6一次，并将上清液加入步骤3.5中对应的50 mL离心管中。
8. 消化60分钟后，加入冰浴FACS缓冲液终止消化反应。
9. 将消化悬液及上清液通过置于50 mL离心管上方的40 µm细胞滤筛过滤，再用FACS缓冲液补至40 mL。
10. 在4 °C条件下以500 x g离心8分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL ACK裂解缓冲液中，冰上孵育5分钟，再用FACS缓冲液补至40 mL。
11. 在4 °C条件下以500 x g离心5分钟，弃去上清液。
12. 用0.5 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，反复吹打以确保细胞均匀分散。
13. 将悬液通过带细胞滤筛帽的40 µm滤膜过滤至5 mL聚苯乙烯圆底管中。

4. 荧光激活细胞分选（FACS）染色

1. 对于单色染色和荧光减一（FMO）对照，将抗体用FACS缓冲液稀释至2倍工作浓度，于预先标记的1.5 mL离心管中制备30 µL染色缓冲液。抗体染色缓冲液的配制参见表1。
2. 分别制备肌肉和心脏组织的单色染色和FMO对照。
3. 将30 µL单色染色和FMO对照染色缓冲液转移至96孔板中，再加入20 µL FACS缓冲液补足体积。
4. 对于样本的FACS染色，在1.5 mL离心管中用FACS缓冲液将抗体稀释至2倍工作浓度，制备0.5 mL染色缓冲液。
5. 向单色染色和FMO对照孔中各加入10 µL细胞悬液；向其余细胞悬液中加入染色缓冲液并重悬细胞。
6. 在4 °C避光孵育30分钟。
7. 向各孔中加入100 µL FACS缓冲液，向样本管中加入2 mL FACS缓冲液。
8. 在4 °C以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。
9. 重复步骤4.7和4.8。
10. 用活力缓冲液重悬细胞沉淀：单色染色和FMO对照使用100 µL，FACS分选样本使用1 mL。
11. 在1.7 mL离心管中加入300 µL增殖培养基，制备收集管。

5. 荧光激活细胞分选

1. 设门策略：使用 FSC vs. SSC（对数）去除碎片。使用 FSC-H vs. FSC-A 设门单细胞。使用 CD31 vs. PI 设门活细胞及谱系阴性细胞。使用 PDGFRα 设门成纤维细胞活化蛋白阳性细胞（图 2）。
2. 分选至预先准备好的收集管中。

6. 组织培养

1. 在 4 °C 条件下，以 800 x g 离心收集的细胞 10 分钟。
2. 使用 P1000 移液器小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
3. 将沉淀重悬于培养基中（每孔 250 µL），按每孔 25,000 个细胞接种至 48 孔组织培养板中。
4. 在培养箱中培养（37 °C，5% CO₂），每 3 天更换一次培养基，直至细胞达到 80% 汇合度。

7. 成纤维分化

1. 当细胞准备就绪可以进行处理时，将基础培养基和1×DPBS置于温水浴或室温下预热后再使用。
2. 吸除培养基。
3. 用200 µL的1×DPBS冲洗两次。
4. 用200 µL的基础培养基冲洗一次。
5. 向相应的孔中加入250 µL促纤维化培养基或基础培养基。
6. 将细胞放回培养箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养。
7. 在48小时后终止分化过程。

8. 脂肪向分化

1. 当细胞准备好进行处理时，将基础培养基、成脂诱导培养基和1x DPBS置于温水浴或室温下预温后再使用。
2. 吸出培养基。
3. 用200 µL的1x DPBS洗涤两次。
4. 用 200 µL 基础培养基洗涤一次。
5. 向相应的孔中加入 400 µL 成脂诱导培养基或基础培养基。
6. 返回培养箱（37°C，5% CO₂）₂).
7. 每2天用移液器从孔中移除200 µL培养基，并加入200 µL新鲜的成脂诱导培养基或基础培养基。
8. 在第6天停止分化^th 天用于骨骼肌FAPs，以及14^th 心脏FAPs的一天。

9. 免疫染色

1. 通过吸去培养基并用 250 µL 1x PBS 洗涤两次来终止分化实验。所有洗涤步骤均需使用连接 3 mL 注射器的 18 G 针头进行，以避免细胞脱落。
2. 每孔加入 250 µL 4% 多聚甲醛（PFA），室温孵育 7 分钟。
3. 去除 PFA，用 250 µL 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
4. 最后一次洗涤时，吸去 1x PBS，每孔加入 250 µL 驴源封闭缓冲液（Donkey + MOM blocking buffer）。
5. 室温孵育 60 分钟。
6. 在驴源封闭缓冲液中配制一抗染色溶液（抗-SMA 和抗-perilipin 抗体），每孔终体积为 100 µL。
7. 吸去待染色孔中的液体。如设有对照孔，保留其中的驴源封闭缓冲液。
8. 将一抗染色溶液分别加入对应孔中。
9. 4 °C 孵育过夜。
10. 次日，用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
11. 在驴源封闭缓冲液中配制二抗染色溶液，每孔终体积为 100 µL。
12. 吸去最后一次洗涤液，向所有孔中加入二抗染色溶液。
13. 室温孵育 45 分钟（从此时起样品需避光处理）。
14. 用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
15. 吸去最后一次洗涤液，每孔加入 250 µL DAPI 染色液。
16. 室温孵育 5 分钟。
17. 去除 DAPI 染色液，用 1x PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。
18. 每孔加入 100 µL Fluoromount-G 封片剂。
19. 用盖板和石蜡膜密封培养板，以减少蒸发。避光保存于 4 °C，直至成像。
20. 使用显微镜进行成像（图 3 和 图 4）。
    注：封闭缓冲液中使用驴血清是为了特异性阻断本实验所用的驴源二抗可能产生的非特异性结合。鼠源抗鼠（mouse-on-mouse）封闭试剂则用于阻断由小鼠产生的抗-SMA 一抗可能引起的背景信号。

结果

分离和培养骨骼肌及心脏FAPs的本实验方案示意图见图1。在组织采集过程中，肝脏颜色由深红色变为淡黄色通常表明灌注成功。根据所指定的刺鼠年龄范围，心脏重量通常约为200 mg，而股四头肌重量约为350 mg。

在步骤3.5-3.7每次更换消化缓冲液时，消化管中的消化缓冲液会因细胞从组织中释放而呈现不透明状。消化结束时，溶液应为相对均一的悬液，仍残留少量组织块。务必在所有组织完全消化之前终止消化，以避免过度消化，否则将对细胞活力和培养结果产生不利影响。

FACS 的预期流式图显示在图2中。FAPs 预计占活细胞和 LIN- 细胞的约 2%。PI+ 事件的百分比是样品制备质量的指标，应低于 10%。在本研究中，通常每颗心脏（仅心室）可获得 150k FAPs，从两块股四头肌可获得 100k FAPs。

接种到培养板后，细胞通常在72小时内贴壁，5天内达到80%汇合度，并呈现典型的成纤维细胞形态，具有突起结构（图5）。

图1：实验方案及各步骤所需大致时间的示意图。 组织采集：每只小鼠约10分钟。组织消化：1.5–2小时。细胞染色：45–75分钟。荧光激活细胞分选：2小时。成纤维-脂肪生成祖细胞（FAP）扩增：4天。FAP分化：成纤维分化需48小时，骨骼肌FAP的脂肪生成分化需6天，心脏FAP的脂肪生成分化需14天。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：骨骼肌（上）和心肌（下）FAP分离的代表性FACS图谱。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：刺鼠骨骼肌FAP的分化。（A）成纤维分化对照组。（B）成纤维分化组。（C）成脂分化对照组。（D）成脂分化组。Perilipin（绿色），SMA（品红色），DAPI（蓝色），比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：刺鼠心脏FAP的分化。（A）成纤维性分化对照组。（B）成纤维性分化。（C）成脂性分化对照组。（D）成脂性分化。Perilipin（绿色），SMA（洋红色），DAPI（蓝色），比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：培养5天后（分化前）多刺鼠骨骼肌（A）和心脏（B）FAPs的明场图像。 比例尺 = 360 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

对照	CD31 SC	PDGFRα SC	CD31 FMO	PDGFRα FMO	样本
CD31 抗体	+	-	-	+	+
PDGFRα 抗体	-	+	+	-	+

表1：抗体染色混合液设置对照和样本的示意图解。 SC = 单色对照，FMO = 荧光减一对照，+ = 包含相应抗体，- = 不包含相应抗体。

讨论

多刺鼠组织对组织解离过程中的应激更为敏感，本方案的多个环节旨在最大限度减少应激以提高细胞活力。样品制备采用连续酶解消化法，以降低所需酶的浓度。随着酶消化的进行，酶活性会逐渐下降。通过更换新鲜酶液，可更好地维持整个消化过程中酶活性的稳定性，并避免使用高浓度酶。此外，还可避免因持续使用同一消化缓冲液而导致已释放细胞在溶液中过度消化。其次，使用ACK裂解缓冲液去除红细胞。尽管心脏已进行放血和灌注，但由于其为高度血管化的器官，仍含有红细胞。通过去除污染的红细胞，可最大限度缩短流式细胞分选（FACS）所需时间，从而避免细胞降解。最后，从步骤2.1到步骤6.4需迅速且严谨地操作，并遵循细胞操作的最佳实践，例如轻柔吹打和尽可能将样品置于冰上。某些操作细节即使在音视频格式中也难以完全展示，可能需要一定经验才能掌握。

在细胞培养中，初始接种密度对于细胞的最佳扩增至关重要。培养皿中的FAPs通过旁分泌方式相互交流，并通过分泌的生长因子刺激生长。在接种密度较低的条件下，细胞无法接收到足够的生长信号，可能导致扩增失败，或需要更长的培养时间才能达到下游实验所需的汇合度。这同样解释了为何在脂肪生成分化过程中每次换液时仅更换一半培养基。保留部分含有前脂肪细胞分泌的生长因子的条件培养基，对于其分化过程至关重要。

进行免疫染色时，在添加或移除缓冲液的过程中应轻柔操作，以尽量减少细胞脱落。特别是在步骤 9.1 中，细胞在固定前最容易脱落。建议采用手动吸取的方式，例如使用移液器或针头与注射器，但不建议使用强力的真空抽吸装置。

该方案的一个局限性在于，PDGFRα 是 FAPs 的通用标记物，需要更多标记物来区分 FAPs 的不同亚型¹⁷。某些亚型，如表达 DPP4 的 FAPs 前体细胞和表达 CD10 的成脂性 FAPs，已被证实参与疾病过程以及稳态调控^18,19,20。有袋鼠鼠中也可能存在不同的 FAP 亚群。这些亚群可能以不同的比例存在，表现出不同的细胞行为，或具有不同于相应 mus musculus FAP 亚群的生理功能。未来需要进一步优化针对有袋鼠鼠 FAP 亚型的特异性标记物，以深入研究有袋鼠鼠 FAPs 的详细特征。

综上所述，本方案详细描述了一种从刺鼠中分离、培养和分化骨骼肌及心脏成纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）的稳健且可重复的方法。刺鼠正逐渐成为一种新的高再生能力动物模型。FAPs及其间质在维持肌肉和心脏稳态中具有重要作用，并在多种慢性疾病模型中参与器官功能障碍^5,7。对刺鼠FAPs进行表征，可能揭示其卓越再生能力背后的机制，并为再生医学领域的新策略开辟道路。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Invitrogen	15575–038
1.7 mL 微型离心管	VWR	87003-294
15 毫升离心管	Falcon	352096
1x 达尔伯克’磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190-144
20 mL 注射器	BD	309661
4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Invitrogen	D3571
40 μm细胞滤器	Falcon	352340
48孔平底组织培养板	Falcon	53078
5 mL 聚丙烯	Falcon	352063
5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞滤网帽	Falcon	352235
5 mL 注射器	BD	309646
50 毫升离心管	Falcon	352070
60 mm 培养皿	Falcon	353002
96孔V型底组织培养板	康宁	3894
Acomys dimidiatus 刺毛鼠（spiny mice）			由肯塔基大学Ashley W. Seifert博士惠赠
氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
抗perilipin（1:100）	Sigma	P1873
抗-SMA（1:100）	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa（1:800）	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide 针头 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide 针头 23 G	BD	305145
牛血清白蛋白	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD生物科学	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
离心	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
驴抗小鼠 Alexa 555（1:1000）	Invitrogen	A31570
驴抗兔 Alexa 647（1:1000）	Invitrogen	A31573
驴血清	Sigma	S30-100ML
FACS 分选仪 - MoFlo Astrios 5 激光器	Beckman Coulter	B52102
胎牛血清	双子座	100-500
精细剪刀	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
镊子	FST	11051-10
止血钳	FST	91308-12
人碱性成纤维细胞生长因子重组蛋白（bFGF）	Gibco	13256029
人TGFβ1重组蛋白（TGFb1）	eBiosciences	14-8348-62
培养箱 - Heracell 160i CO₂2	ThermoFisher	51033557
倒置显微镜 - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	罗氏	5401127001
小鼠间充质细胞培养脂肪分化10倍添加剂	STEMCELL Technologies	5507
小鼠来源小鼠（MOM）封闭试剂	Vector Laboratories	MKB-2213
多聚甲醛	Sigma	P1648-500g
青霉素-链霉素	Gibco	15140–122
PicoLab 小鼠饮食 20	LabDiet	3005750-220
碘化丙啶（PI）	Invitrogen	P3566
5 mL 运输管	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5