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陈旧与新鲜腐尸性蝇类样本的DNA提取及比较

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DOI：

10.3791/66737

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2024年5月3日

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1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, Hainan Gongping Forensic Center, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

本文介绍了一种利用改良的通用DNA提取试剂盒从新鲜及陈旧的嗜尸性蝇类中提取DNA的实验方案。

摘要

共选取了五份Chrysomya megacephala样本——三份新鲜样本、一份在酒精中保存2年的样本，以及一份仅避光干密封保存2年的样本，旨在探究血液DNA提取试剂盒是否可用于从嗜尸性蝇类中提取DNA，并评估酒精是否能够延长嗜尸性蝇类DNA的保存效果。首先，使用血液DNA提取试剂盒从这些样本的胸部组织中提取DNA；随后，采用微孔板读数仪和荧光计检测所提取DNA的纯度和浓度；最后，利用位于线粒体CO I基因序列内的嗜尸性蝇类特异性引物，对提取的DNA进行PCR扩增和电泳分析。结果显示，所有样本的DNA纯度均大于2.0；DNA浓度的高低顺序依次为：新鲜样本 > 酒精保存的陈旧样本 > 未经处理的陈旧样本；所有样本在PCR扩增后均出现特异性电泳条带。综上所述，血液DNA提取试剂盒可成功用于从嗜尸性蝇类中提取DNA，且新鲜蝇类样本的DNA浓度高于陈旧样本；蝇类样本可在酒精中长期保存。

引言

推断死亡时间一直是司法实践中需要解决的关键且困难的问题之一。在法医学实践中，对于刑事案件而言，确定死亡后经过的时间（死后间隔）在推断犯罪时间、锁定犯罪嫌疑人以及缩小侦查范围方面起着至关重要的作用。传统的死亡时间推断方法主要基于早期的死后现象，通常仅适用于推断24小时内的死亡时间。然而，对于较长的死亡时间，无法通过死后现象进行判定。目前法医学界普遍认为，法医昆虫学具有成为推断较长死亡时间有效方法的潜力。

腐食性昆虫因其幼虫以尸体为食而得名。其中，一旦出现尸体，嗜尸性成蝇便会最先到达尸体并产卵或产幼虫。幼虫取食尸体组织，随后发育为蛹，最终羽化为成虫。由于其规律的生活周期和地理分布特征，嗜尸性蝇类在法医学实践中具有重要作用，例如推断死亡时间及判断死亡地点1,2。然而，将嗜尸性蝇类应用于法医学实践的主要障碍在于物种鉴定。目前，形态学方法仍被视为嗜尸性蝇类物种鉴定的权威手段。但形态学鉴定要求昆虫具有较高的完整性；若蝇类处于不同的发育阶段，或因环境选择导致形态发生变化，均会增加形态学鉴定的难度。特别是犯罪现场最常见的蛹及蛹壳，其形态特征极难辨认。加之形态学鉴定专家稀缺，使得通过形态学方法进行物种鉴定面临巨大困难。因此，分子生物学技术在蝇类物种鉴定中的应用应运而生，该方法降低了对形态学鉴定的依赖，且不受发育阶段的限制3,4,5,6,7。

基于分子生物学方法对嗜尸性蝇类进行物种鉴定的第一步是高效提取DNA，而目前专门用于昆虫DNA提取的试剂盒尚不常见。因此，如何利用常见的血液DNA提取试剂盒来提取嗜尸性蝇类的DNA在法医学实践中显得尤为重要。在犯罪现场发现的嗜尸性蝇类通常受到损毁或已发生腐败，导致DNA降解。蝇类样本在获取后往往无法立即用于DNA提取，或者由于证据保存的要求，必须保留完整的样本。基于上述需求，本研究采用基于蛋白酶K消化的血液DNA提取试剂盒，选取了三只新鲜的Chrysomya megacephala（双翅目，丽蝇科）样本（图1）、一只在酒精中保存两年的旧C. megacephala样本以及一只避光保存两年的C. megacephala样本，分别称量这五个样本，并选取昆虫的胸部组织进行DNA提取。通过比较新旧样本提取DNA的质量与纯度，使用针对嗜尸性蝇类线粒体CO figure-introduction-1基因序列设计的特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增和电泳分析。

方案

注意：本方案共使用了五份 C. megacephala 样本——三份新鲜样本（Fresh 1、Fresh 2 和 Fresh 3），一份在酒精中保存两年的样本（Old 1），以及一份仅避光干封保存两年的样本（Old 2）。样本必须根据实验要求进行标记。

1. 样品常规保存与制备

  1. 样本选择与制备
    注意：使用乙酸乙酯处理腐食性蝇类时，务必在通风橱中操作。在称重前去除蝇体表面的液体。
    1. 新鲜样本：将采集的三只蝇样本用乙酸乙酯处死后放入气体样品瓶中。称重后分别标记为“新鲜1”、“新鲜2”和“新鲜3”，并立即用于实验。
      注意：本实验方案中，新鲜蝇样本的质量分别为56.8 mg、49.3 mg和52.1 mg。
    2. 旧样本1：取出用乙酸乙酯处死并置于含酒精的离心管中、在避光室温条件下密闭保存2年的蝇样本。用滤纸吸除表面液体后称重，标记为“旧1”。
      注意：本实验方案中，“旧1”的质量为42.3 mg。
    3. 旧样本2：取出用乙酸乙酯处死并置于离心管中、在避光室温条件下密闭保存2年的蝇样本。称重后标记为“旧2”。
  2. 提取前准备
    1. 加入少量液氮以冷却不锈钢容器；待所有液氮完全蒸发后再进行下一步操作。
    2. 将一个蝇样本放入容器中；缓慢倒入液氮，防止液氮飞溅影响昆虫样本。
    3. 在液氮中将样本冷冻，待液氮蒸发后取出样本。
    4. 单独分离出胸部组织，放入2 mL离心管中，并切割成尽可能小的片段。
      注意：将样本切碎有助于充分裂解，从而大量释放DNA。
    5. 对每只蝇重复上述步骤，分别冷冻处理后转移至新的离心管中，以避免DNA交叉污染。

2. DNA 提取

注意：所有离心步骤均须在室温（15–25 °C）下使用微量离心机进行。所有操作步骤必须严格遵守无菌原则，以避免交叉污染。

  1. 组织裂解
    1. 向含有剪碎样品的 2 mL 离心管中加入 180 µL 组织裂解缓冲液。
    2. 加入 20 µL 蛋白酶 K，于 3 000 rpm 涡旋振荡 10 s 以充分混匀，然后在 56 °C 下孵育，直至昆虫组织完全裂解。
      注意：若组织未完全消化，应添加更多蛋白酶 K。裂解通常在 1–3 小时内完成，也可延长裂解时间至过夜。
  2. DNA 沉淀
    1. 以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 s。向样品中加入 200 µL 裂解缓冲液，并以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 s 充分混匀。
    2. 加入 200 µL 乙醇（96–100%），再次以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 s 充分混匀。
      注意：为节省时间，可将裂解缓冲液与乙醇预先混合后一次性加入。加入裂解缓冲液和乙醇后可能形成白色沉淀。
  3. 用移液器将混合液转移至置于 2 mL 收集管中的 DNA 吸附柱中，于 6,000 × g 离心 1 min。弃去穿流液及收集管。
  4. 将上一步所得 DNA 吸附柱转移至新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL 蛋白去除缓冲液，于 6,000 × g 离心 1 min。弃去穿流液及收集管。
  5. 将 DNA 吸附柱转移至另一新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL 脱盐缓冲液，于 20,000 × g 离心 3 min 以干燥 DNA 吸附柱膜。弃去穿流液及收集管。
    注意：此离心步骤可确保在后续洗脱前彻底去除残留乙醇。若仍有乙醇残留，需再次于 20,000 × g 离心 1 min。
  6. 将 DNA 吸附柱放入洁净的 2 mL 微离心管中，直接将 100 µL DNA 洗脱缓冲液加入柱膜上，室温孵育 1 min，然后于 6,000 × g 离心 1 min 进行洗脱。
    注意：使用 100 µL（而非 200 µL）进行洗脱可提高洗脱液中 DNA 的最终浓度，但会降低总 DNA 得率。为最大化 DNA 得率，可按照步骤 2.8 所述重复洗脱一次。
  7. 将 DNA 样品储存于 4 °C（最多 1 周）或 -80 °C 长期保存。

3. DNA 浓度检测

  1. 使用微孔板读数仪测定 OD 260 和 OD 280 的值，以评估 DNA 纯度和核酸浓度。每个样本重复测定三次。
  2. 使用配套试剂盒通过荧光计测定提取 DNA 的浓度，每个样本设三个重复。
    1. 取 190 µL 工作液分别加入两个 0.5 mL 离心管中，各取 10 µL 标准品 #1 和标准品 #2，分别加入工作液中，避光孵育不少于 15 分钟。
      注：标准品 #1 和标准品 #2 已精确校准为特定浓度的 DNA。标准溶液应准确配制，以确保生成准确的标准曲线。标准品 #1 为 0.2 ng/µL 的双链 DNA (dsDNA) 样品；标准品 #2 为 2,000 ng/µL。工作液为特异性结合 dsDNA 的染料。
    2. 取 2 µL 待测 DNA 与 198 µL 工作液混合于 0.5 mL 离心管中，避光孵育不少于 15 分钟。
      注：若 DNA 浓度较低，可加入 5 µL 待测 DNA 与 195 µL 工作液混合。
    3. 15 分钟后，开启仪器并选择 dsDNA Concentration Measurement | Long Range。先测定标准品 #1，再测定标准品 #2，以获得标准曲线。
      注：标准溶液配制后必须于当日使用；放置过久会导致标准曲线出现较大误差。
    4. 将待测样品依次放入检测孔中，调整 DNA 加样体积为 2 µL，每个样品重复测定三次，取平均值并记录。

4. PCR 与电泳检测

注意：采用长度为 278 bp 的线粒体 CO figure-protocol-1 基因序列进行 PCR 扩增，上游引物 C1-J-2495 序列为 CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG，下游引物 C1-N-2800 序列为 CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8，随后进行 2% 琼脂糖凝胶电泳以验证扩增效果，并确认扩增产物的长度。

  1. 加入10 µL的2x Taq混合液、各1 µL的引物、5 µL的ddH2O和3 µL的模板DNA，配制20 µL的PCR扩增体系；在离心机中充分混匀10秒。
  2. 采用以下PCR扩增循环参数：95 °C预变性10分钟；95 °C变性30秒，48 °C退火30秒，72 °C延伸45秒，共40个循环；最后72 °C终延伸10分钟。
  3. 将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后置于凝胶成像系统中进行成像分析。

结果

我们使用微孔板读数仪测定提取的DNA溶液在260 nm和280 nm处的光密度值（OD260和OD280），并计算OD260/OD280比值以评估DNA纯度。所有新鲜样品及旧样品1的OD260/OD280比值均大于2。旧样品2的OD260/OD280比值最大值为2.187，但其平均值为1.753，且三次测量值波动较大，这是由于其OD280和OD280值均较小（≤0.01）所致（表1）。根据测得的OD260值，我们估算了DNA浓度。三种样品的DNA浓度顺序为：新鲜样品 > 旧样品1 > 旧样品2，使用微孔板读数仪测得，但新鲜样品与旧样品之间的差异较小，仅为~10–20 ng/µL（表1）；而使用Qubit荧光计测得的新鲜样品DNA浓度比微孔板读数仪测得值高125–130 ng/µL，旧样品1的差异为15 ng/µL，旧样品2仅为1.3 ng/µL。DNA浓度顺序仍为新鲜样品 > 旧样品1 > 旧样品2（表2）。

目前使用的提取方法所提取的DNA包含来自样本中不同来源的所有DNA组分。这意味着DNA溶液不仅是蝇类基因组DNA的溶液。通过查阅文献并结合NCBI-Blast引物验证，筛选出可特异性扩增蝇线粒体CO figure-results-1 基因片段的引物。结果显示，线粒体CO figure-results-2 基因的正向引物C1-J-2495和反向引物C1-N-2800具有序列多态性，为蝇类特异性引物，可覆盖多种蝇类物种。扩增结果未显示人源基因。这对引物是用于腐生性蝇类鉴定的一组可靠DNA生物标记，被选用于本实验结果的验证。

所有不同样品均显示出明显的电泳条带，长度范围在 250 bp–400 bp 之间。新鲜样品的条带比陈旧样品更亮，且经酒精处理的陈旧样品（图 2，Old1）比未经处理的陈旧样品（图 2，Old2）更亮，但陈旧样品在不同位置出现了两条条带。空白对照无任何条带（图 2）。

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图1：Chrysomya megacephala 不同角度的图像。（A）雄性；（B）雌性。请点击此处查看此图的放大版本。

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图 2：PCR 扩增产物的电泳图谱。 从左数前三个条带为新鲜蝇类样本 DNA 的 PCR 扩增产物。第四个电泳条带为保存在酒精中的陈旧蝇类样本 DNA 的 PCR 扩增产物。第五个条带为未经特殊保存的陈旧蝇类样本 DNA 的 PCR 扩增产物。第六个条带为空白对照，条带洁净，证明 PCR 扩增过程中未发生污染。最右侧为 DNA Marker，其中标注了长度为 250 bp 和 400 bp 的 DNA 位置。所有样本的 PCR 产物电泳条带均略高于 250 bp 且低于 400 bp 的 Marker 条带，该位置与目标基因 278 bp 的长度相符。肉眼可明显观察到，代表新鲜样本的 DNA 条带比陈旧样本的更亮。陈旧样本中还包含其他长度不同的非目标基因 DNA 条带，其亮度较弱。请点击此处查看该图的放大版本。

样品新鲜1新鲜2新鲜3陈旧1陈旧2
OD260/OD2802.354±0.0362.245±0.0272.060±0.0382.143±0.0121.753±0.421
DNA(ng/µL)119.91±1.686116.084±4.96595.239±3.40186.845±6.1410.151±0.168

表1：使用微孔板读板仪测定DNA纯度和浓度。

样品Fresh1Fresh2Fresh3Old1Old2
DNA(ng/µL)243.333±1.528237.667±2.082226.000±2.000101.000±0.00011.433±0.058

表2：使用荧光计测量DNA浓度。

讨论

DNA 提取是腐生性蝇类分子鉴定中最关键的环节，其提取方法及所获得 DNA 的质量直接影响后续检测结果。本实验中，我们使用常规血液试剂盒成功提取了腐生性蝇类的 DNA，无需购买专门的昆虫 DNA 提取试剂盒，使昆虫 DNA 提取更易于实现。

蝇类体表富含几丁质，尤其在幼虫和蛹期，表皮几丁质含量可高达60-70%，这使得从腐生性蝇类中提取DNA较为困难9。我们在提取过程中发现，若样品处于湿润状态，即使已充分剪切样品，在加入蛋白酶K进行消化时，样品仍会呈现胶状。这会阻碍后续液体顺利通过吸附柱。为解决此问题，我们首先使用液氮快速冷冻样品，使蝇体变脆，易于研磨，并有利于实现充分消化。若无法获取液氮进行研磨，但仍需提高DNA提取效率，可将蝇类样品置于通风环境中约48小时，待其自然干燥后再进行充分剪切，进而提取DNA。

考虑到陈旧样本的DNA降解问题更为突出，本实验选择果蝇胸部样本进行DNA提取，因为胸部含有较高的DNA含量。然而，使用胸部会对果蝇形态完整性造成较大破坏，不利于后续证据的完整保存以及形态学鉴定需求。当胸部组织腐烂时，样本难以提取。若样本新鲜，则足部和翅部的DNA提取可能更为合适。足和翅呈左右对称分布，从一侧取材后仍可保留较完整的形态特征。但翅和足提取的DNA浓度相对较低，可能对后续研究带来风险。此外，样本体积小，容易丢失10。

使用DNA提取试剂盒进行DNA提取时，除旧样本2外，其余样本经酶标仪测定的OD260/OD280值均大于2。首先，这表明蛋白质被更彻底地去除，但可能存在RNA污染、因反复离心导致的DNA双链断裂，或旧样本中DNA降解的情况11。其次，这也可能提示酒精延长了RNA的保存时间。

DNA 浓度通过酶标仪的 OD260 值计算得出，而 Qubit 荧光计则需先建立标准曲线，再测定荧光吸光度值以计算 DNA 浓度。两种方法均可实现痕量 DNA 浓度的测定，但各有优缺点：酶标仪采用 OD260 计算 DNA 浓度，但其计算方法仍为一种估算。若样品中混有大量可吸收紫外光的核苷酸、蛋白质或其他物质，则光度测定误差会较大，因此应尽量在测定前将其去除。

酶标仪和紫外分光光度计利用紫外吸收进行检测，但无法区分DNA、RNA、降解的核酸、游离核苷酸以及其他杂质，且其吸光度易受其他污染物的显著影响，导致读数相对不可靠。在进行样品加样时，通常以滴为单位测量，样品可直接加入，无需稀释或预处理，从而实现多个样品的同时测定，并通过OD260/OD280比值直接计算DNA纯度。而Qubit荧光计则专用于测定双链DNA浓度，其原理是利用两种已知浓度的标准溶液建立标准曲线，并结合特异性结合双链DNA的荧光染料的特性进行检测。然而，每个样品均需单独进行预处理后再逐一测量，对于批量样品检测而言操作繁琐，且无法测定提取DNA的纯度。在具体应用中，可根据实际需求选择上述方法之一用于DNA质量检测12,13,14。

无论使用微孔板读数仪还是Qubit荧光计测量DNA浓度，新鲜样本的DNA浓度均高于保存在酒精中的旧样本，也高于未经处理的旧样本。对于长期保存，可将样本浸入酒精中以抑制细菌和真菌的生长15,16。

不同的测量方法对未经处理的古老样本的DNA测量影响较小，可能是因为古老样本降解程度更高，尤其是蛋白质和RNA的降解速度通常比DNA更快。相比之下，新鲜样本含有更多的蛋白质和RNA，因此对检测结果的影响更大。如果仅比较双链DNA浓度，则应采用Qubit荧光计的检测结果，而我们的实验结果也在新旧样本之间形成了显著的DNA浓度梯度。

DNA提取后，新鲜样本与陈旧样本的DNA含量均可用于后续分子生物学分析。本实验中，所选用的线粒体CO figure-discussion-1 基因引物长度仅为278 bp，所有样本均能通过DNA成功扩增。线粒体CO figure-discussion-2 基因是果蝇中公认的DNA条形码位点，因此可通过后续测序分析鉴定嗜尸性蝇类物种17。对于保存时间较长的样本，可通过选择其他较短DNA序列的引物，成功实现分子生物学分析。值得注意的是，陈旧样本的电泳条带出现两条位置不同且长度较短的条带，可能是由于DNA降解以及退火温度较低，导致引物发生非特异性扩增所致。

然而，在本实验中，为满足重复实验的需求，仅保存了较少的样本用于长期保存，而实验结果仅需具有代表性的样本即可。因此，我们未进行重复性测试，该测试可能对新旧样本的保存具有探索意义，但并不影响腐生性蝇类样本的成功提取。

综上所述，使用血液DNA提取试剂盒也有助于腐生性蝇类DNA的提取。无论是陈旧样本还是新鲜样本均可成功提取，且所有提取得到的DNA均可用于后续分析。酒精也有利于蝇类DNA样本的长期保存。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（82060341，81560304）和海南省院士创新平台科研项目（YSPTZX202134）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Buffer AEQiagen172026832DNA 洗脱缓冲液
Buffer ALQiagen172028374裂解缓冲液
Buffer ATLQiagen172028162组织裂解缓冲液
Buffer AW1Qiagen172028760蛋白去除缓冲液
Buffer AW2Qiagen57203108脱盐缓冲液
C1-J-2495Taihe BiotechnologyTW21109216正向引物
C1-N-2800Taihe BiotechnologyTW21109217反向引物
D2000 DNA ladderReal-Times(北京)生物科技RTM415用于测定电泳条带位置
DNeasy Mini spin columnQiagen166050343DNA 吸附柱
Dry Bath IncubatorMiulabDKT200-2D用于加热
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206振荡混匀
Proteinase KQiagen172026218灭活细胞内核酸酶及其他蛋白质
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher Scientific2321611188
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121离心机
Standard#1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard#2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455凝胶成像
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR 混合液
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR 混合液
Thermo Cycler珠海黑马VRB020A普通 PCR
Working SolutionThermo Fisher Scientific2342797

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Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.

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Chrysomya megacephala DNA DNA DNA PCR

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