本文介绍了一种利用改良的通用DNA提取试剂盒从新鲜及陈旧的嗜尸性蝇类中提取DNA的实验方案。
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摘要
摘要
共选取了五份Chrysomya megacephala样本——三份新鲜样本、一份在酒精中保存2年的样本，以及一份仅避光干密封保存2年的样本，旨在探究血液DNA提取试剂盒是否可用于从嗜尸性蝇类中提取DNA，并评估酒精是否能够延长嗜尸性蝇类DNA的保存效果。首先，使用血液DNA提取试剂盒从这些样本的胸部组织中提取DNA；随后，采用微孔板读数仪和荧光计检测所提取DNA的纯度和浓度；最后，利用位于线粒体CO I基因序列内的嗜尸性蝇类特异性引物，对提取的DNA进行PCR扩增和电泳分析。结果显示，所有样本的DNA纯度均大于2.0；DNA浓度的高低顺序依次为：新鲜样本 > 酒精保存的陈旧样本 > 未经处理的陈旧样本；所有样本在PCR扩增后均出现特异性电泳条带。综上所述，血液DNA提取试剂盒可成功用于从嗜尸性蝇类中提取DNA，且新鲜蝇类样本的DNA浓度高于陈旧样本；蝇类样本可在酒精中长期保存。
引言
推断死亡时间一直是司法实践中需要解决的关键且困难的问题之一。在法医学实践中，对于刑事案件而言，确定死亡后经过的时间（死后间隔）在推断犯罪时间、锁定犯罪嫌疑人以及缩小侦查范围方面起着至关重要的作用。传统的死亡时间推断方法主要基于早期的死后现象，通常仅适用于推断24小时内的死亡时间。然而，对于较长的死亡时间，无法通过死后现象进行判定。目前法医学界普遍认为，法医昆虫学具有成为推断较长死亡时间有效方法的潜力。
腐食性昆虫因其幼虫以尸体为食而得名。其中，一旦出现尸体，嗜尸性成蝇便会最先到达尸体并产卵或产幼虫。幼虫取食尸体组织，随后发育为蛹，最终羽化为成虫。由于其规律的生活周期和特定的地理分布，嗜尸性蝇类在法医学实践中具有重要作用，例如推断死亡时间及判断死亡地点1,2。然而，将嗜尸性蝇类应用于法医学实践的主要障碍在于物种鉴定。目前，形态学方法仍被作为嗜尸性蝇类物种鉴定的权威手段。但形态学鉴定要求昆虫具有较高的完整性。若蝇类处于不同的发育阶段，或因环境选择导致形态发生变化，均会增加形态学鉴定的难度。特别是犯罪现场最常发现的蛹及蛹壳，其形态特征极难辨认。加之形态学鉴定专家稀缺，使得通过形态学方法进行物种鉴定面临巨大困难。因此，分子生物学技术在蝇类物种鉴定中的应用应运而生，该方法降低了对形态学鉴定的依赖，且不受发育阶段的限制3,4,5,6,7。
基于分子生物学方法对嗜尸性蝇类进行物种鉴定的第一步是高效提取DNA，而目前专门用于昆虫DNA提取的试剂盒尚不常见。因此，如何利用常见的血液试剂盒提取嗜尸性蝇类的DNA在法医学上具有更重要的意义。在犯罪现场发现的嗜尸性蝇类通常受到损毁或已发生腐败，导致DNA降解。蝇类样本在获取后往往无法立即用于DNA提取，或者由于证据保存的要求，必须保留完整的样本。基于上述需求，本研究采用基于蛋白酶K消化的血液DNA试剂盒，选取了三只新鲜的Chrysomya megacephala（双翅目，鳞翅目）样本（图1），一只在酒精中保存两年的陈旧C. megacephala样本，以及一只避光保存两年的C. megacephala样本，分别称量这五个样本，并选取昆虫胸部组织进行DNA提取。通过比较新旧样本提取DNA的质量与纯度，使用位于线粒体CO 
基因序列的嗜尸性蝇类特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增和电泳分析。
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方案
注意：本方案共使用了五份 C. megacephala 样本——三份新鲜样本（Fresh 1、Fresh 2 和 Fresh 3），一份在酒精中保存 2 年的样本（Old 1），以及一份在避光条件下干燥密封保存 2 年的样本（Old 2）。样本必须根据实验要求进行标记。
1. 样品常规保存与制备
- 样本选择与制备
注意：使用乙酸乙酯处死腐食性蝇类时，务必在通风橱中操作。在称重前去除蝇体表面的液体。- 新鲜样本：将采集的三份蝇样本用乙酸乙酯处死后放入气体样品瓶中。称重后分别命名为新鲜1、新鲜2和新鲜3，并立即用于实验。
注意：本方案中新鲜蝇样本的质量分别为56.8 mg、49.3 mg和52.1 mg。 - 旧样本1：取出经乙酸乙酯处死并置于盛有酒精的离心管中、在避光室温条件下密闭保存2年的蝇样本。用滤纸吸干表面液体后称重，命名为旧1。
注意：本方案中旧1的质量为42.3 mg。 - 旧样本2：取出经乙酸乙酯处死并置于离心管中、在避光室温条件下密闭保存2年的蝇样本。称重后命名为旧2。
- 新鲜样本：将采集的三份蝇样本用乙酸乙酯处死后放入气体样品瓶中。称重后分别命名为新鲜1、新鲜2和新鲜3，并立即用于实验。
- 提取前准备
- 加入少量液氮冷却不锈钢容器；等待所有液氮完全挥发。
- 将一个蝇样本放入容器中；缓慢倒入液氮，防止液氮飞溅并影响昆虫样本。
- 在液氮中冷冻样本。待液氮挥发后取出样本。
- 单独分离胸部，放入2 mL离心管中，并切成尽可能小的片段。
注意：将样本切碎以确保充分裂解，从而大量释放DNA。 - 对每只蝇重复上述步骤，分别冷冻后转移至新的离心管中，以防止DNA交叉污染。
2. DNA 提取
注意：所有离心步骤均须在室温（15–25 °C）下使用微量离心机进行。所有操作步骤必须严格遵守无菌原则，以避免交叉污染。
- 组织裂解
- 向含有剪碎样品的 2 mL 离心管中加入 180 µL 组织裂解缓冲液。
- 加入 20 µL 蛋白酶 K，于 3 000 rpm 涡旋振荡 10 秒以充分混匀，随后在 56 °C 孵育，直至昆虫组织完全裂解。
注意：若组织未完全消化，应添加更多蛋白酶 K。裂解通常在 1–3 小时内完成，也可延长裂解时间过夜。
- DNA 沉淀
- 以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 秒。向样品中加入 200 µL 裂解缓冲液，并以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 秒充分混匀。
- 加入 200 µL 乙醇（96–100%），再次以 3,000 rpm 涡旋振荡 15 秒充分混匀。
注意：为节省时间，可将裂解缓冲液与乙醇预先混合后一次性加入。加入裂解缓冲液和乙醇后可能形成白色沉淀。
- 将混合液转移至置于 2 mL 收集管中的 DNA 吸附柱中，于 6,000 × g 离心 1 分钟。弃去穿滤液及收集管。
- 将上一步所得 DNA 吸附柱转移至新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL 蛋白去除缓冲液，于 6,000 × g 离心 1 分钟。弃去穿滤液及收集管。
- 将 DNA 吸附柱转移至另一新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL 脱盐缓冲液，于 20,000 × g 离心 3 分钟以干燥 DNA 吸附柱膜。弃去穿滤液及收集管。
注意：此离心步骤可确保在后续洗脱前彻底去除残留乙醇。若仍有乙醇残留，需再次于 20,000 × g 离心 1 分钟。 - 将 DNA 吸附柱放入洁净的 2 mL 微量离心管中，直接将 100 µL DNA 洗脱缓冲液加入柱膜上，室温孵育 1 分钟，然后于 6,000 × g 离心 1 分钟以完成洗脱。
注意：使用 100 µL（而非 200 µL）进行洗脱可提高最终洗脱液中 DNA 的浓度，但会降低总 DNA 产量。为最大化 DNA 产量，可按照步骤 2.8 所述重复洗脱一次。 - 将 DNA 样品储存于 4 °C（最多 1 周）或 -80 °C 长期保存。
3. DNA 浓度检测
- 使用微孔板读数仪测定 OD 260 和 OD 280 的值，以评估 DNA 纯度和核酸浓度。每个样本重复测定三次。
- 使用配套试剂盒通过荧光计测定提取 DNA 的浓度，每个样本设三个重复。
- 取 190 µL 工作液至两个 0.5 mL 离心管中，分别取 10 µL 标准品 #1 和标准品 #2，加入工作液中，避光孵育不少于 15 分钟。
注意：标准品 #1 和标准品 #2 是针对特定浓度 DNA 精确校准的。标准溶液应准确配制，以确保形成准确的标准曲线。标准品 #1 为 0.2 ng/µL 的双链 DNA (dsDNA) 样品；标准品 #2 为 2,000 ng/µL。工作液为特异性结合 dsDNA 的染料。 - 取 2 µL 待测 DNA 样品，与 198 µL 工作液混合于一个 0.5 mL 离心管中，避光孵育不少于 15 分钟。
注意：若 DNA 浓度较低，可加入 5 µL 待测 DNA 与 195 µL 工作液混合。 - 孵育 15 分钟后，开启仪器并选择 dsDNA Concentration Measurement | Long Range 模式。先测定标准品 #1，再测定标准品 #2，以获得标准曲线。
注意：标准溶液配制后必须当天使用；放置过久会导致标准曲线出现较大误差。 - 将待测样品依次放入检测孔中，调整 DNA 加样体积为 2 µL，每个样品重复测定三次，取平均值并记录结果。
- 取 190 µL 工作液至两个 0.5 mL 离心管中，分别取 10 µL 标准品 #1 和标准品 #2，加入工作液中，避光孵育不少于 15 分钟。
4. PCR 与电泳检测
注意：采用长度为 278 bp 的线粒体 CO 基因序列进行 PCR 扩增，上游引物 C1-J-2495 序列为 CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG，下游引物 C1-N-2800 序列为 CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8，随后进行 2% 琼脂糖凝胶电泳以验证扩增效果，并确认扩增产物的长度。
- 加入10 µL的2x Taq混合液、1 µL的上下游引物各一、5 µL的ddH2O和3 µL的模板DNA，配制成20 µL的PCR扩增体系；在离心机中充分混匀10秒。
- 采用以下PCR扩增程序：95 °C预变性10分钟；95 °C变性30秒，48 °C退火30秒，72 °C延伸45秒，共40个循环；最后72 °C终延伸10分钟。
- 将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后置于凝胶成像系统中进行图像分析。
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结果
我们使用酶标仪测定提取的DNA溶液在OD260和OD280处的吸光度值，然后计算OD260/OD280比值以评估DNA纯度。所有新鲜样品及旧样品1的OD260/OD280比值均大于2。旧样品2的OD260/OD280比值最大值为2.187，但其平均值为1.753，由于其OD280和OD260值均较小（≤0.01），三次测量结果波动较大（表1）。根据测得的OD260值，我们估算了DNA浓度。三种样品的DNA浓度顺序为：新鲜样品 > 旧样品1 > 旧样品2，使用酶标仪测得的结果显示新鲜样品与旧样品之间的差异较小，仅为约10–20 ng/µL（表1）；而使用Qubit荧光计测定的三个新鲜样品的DNA浓度比酶标仪测定值高125–130 ng/µL，旧样品1的差异为15 ng/µL，旧样品2仅为1.3 ng/µL。DNA浓度顺序仍为新鲜样品 > 旧样品1 > 旧样品2（表2）。
采用当前提取方法获得的DNA包含样本中不同来源的全部DNA组分，这意味着DNA溶液并非仅含有蝇类基因组DNA。通过...
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讨论
DNA 提取是腐生性蝇类分子鉴定中最关键的环节，其提取方法及所获得 DNA 的质量直接影响后续检测结果。本实验中，我们使用常规血液试剂盒成功提取了腐生性蝇类的 DNA，无需购买专门的昆虫 DNA 提取试剂盒，从而简化了昆虫 DNA 提取的操作流程。
果蝇体表富含几丁质，尤其在幼虫和蛹期，表皮几丁质含量可高达60–70%，这使得从嗜尸性蝇类中提取DNA较为困难9。我们在提取过程中发现，若样品处于湿润状态，即使已充分剪切样品，在加入蛋白酶K进行消化时，样品仍会呈现胶状。这会阻碍后续液体顺利通过吸附柱。为解决此问题，我们首先使用液氮快速冷冻样品，使果蝇组织变脆，易于研磨，并有利于充分消化。若无法使用液氮进行研磨但仍需提高DNA提取效率，可将蝇类样品置于通风环境中约48小时，待其自然干燥后再进行充分剪切，进而提取DNA。
考虑到陈旧样本的DNA降解问题更为突出，本实验选择果蝇胸部样本进行DNA提取，因为胸部含有较高的DNA含量。然而，使用胸部会对果蝇形态完整性造成较大破坏，不利于后续证据...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82060341，81560304）和海南省院士创新平台科研项目（YSPTZX202134）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Buffer AE | Qiagen | 172026832 | DNA 洗脱缓冲液 |
| Buffer AL | Qiagen | 172028374 | 裂解缓冲液 |
| Buffer ATL | Qiagen | 172028162 | 组织裂解缓冲液 |
| Buffer AW1 | Qiagen | 172028760 | 蛋白去除缓冲液 |
| Buffer AW2 | Qiagen | 57203108 | 脱盐缓冲液 |
| C1-J-2495 | Taihe Biotechnology | TW21109216 | 正向引物 |
| C1-N-2800 | Taihe Biotechnology | TW21109217 | 反向引物 |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(北京)生物科技 | RTM415 | 用于测定电泳条带位置 |
| DNeasy Mini spin column | Qiagen | 166050343 | DNA 吸附柱 |
| Dry Bath Incubator | Miulab | DKT200-2D | 用于加热 |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | 振荡混匀 |
| Proteinase K | Qiagen | 172026218 | 灭活细胞内核酸酶及其他蛋白质 |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | 2321611188 | |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | 离心机 |
| Standard#1 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Standard#2 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | 凝胶成像 |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR 混合液 |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR 混合液 |
| Thermo Cycler | 珠海黑马 | VRB020A | 普通 PCR |
| Working Solution | Thermo Fisher Scientific | 2342797 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples
Posted by JoVE Editors on 8/12/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66737
