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揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

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DOI：

10.3791/66740

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2024年5月31日

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1Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo, 2Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi) Latin America, 3Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia, Universidade Federal de São Paulo, 4Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

本文内容

摘要

本方案详细描述了在Trypanosoma cruzi感染的生物发光模型中开展药物疗效研究的具体步骤，重点介绍数据采集、分析与解读。同时提供了故障排除和质量控制程序，以尽量减少技术问题。

摘要

为了控制并降低恰加斯病、利什曼病和人类非洲锥虫病等人源原虫病对公共卫生的影响，亟需加快新药和疫苗的研发进程。然而，这一过程面临诸多困难，例如寄生虫生物学和疾病发病机制的高度复杂性，以及与大多数被忽视的热带病一样，研发领域的科研经费相对有限。因此， 体外 和 在体 能够充分再现感染和疾病关键特征同时合理利用资源的研究模型，对于推进这些疾病的研究至关重要。一个例子是 体内 用于克氏锥虫病的生物发光成像（BLI）小鼠模型，可高灵敏度检测由长波长光产生的信号 克氏锥虫 表达荧光素酶的寄生虫。尽管该技术已成为药物疗效评估的标准方法 体内 研究，即使在生物发光成像（BLI）设备易于获取的情况下，研究团队仍可能因缺乏关于设备操作和质量控制程序应用的充分实践培训而难以实施该技术。鉴于这一现状，本实验方案旨在从实验设计、数据采集到数据分析各个环节提供详细指导，以帮助那些在查加斯病或其他传染病小鼠模型研究中缺乏或仅有少量BLI使用经验的研究团队顺利建立并实施相关实验流程。

引言

恰加斯病在拉丁美洲呈地方性流行，全球约有七百万人受到感染1。每年因该疾病导致的致残性后果引发超过五万例死亡，并造成约七十亿美元的经济损失 2。恰加斯病由原虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，该病原体是一种异宿生的血鞭毛虫寄生虫，可在美洲地区感染哺乳动物（野生和家养）以及锥蝽媒介（半翅目，猎蝽科）3，并在该区域建立了媒介传播循环。其他重要的感染途径包括输血、器官移植、经口途径（摄入被感染锥蝽污染的食物）4以及先天性传播。非媒介传播途径促使恰加斯病扩散至非流行地区3,5。

恰加斯病表现为两个临床阶段。在大多数情况下，急性期无症状。有症状的感染通常与非特异性体征相关，如发热、疲劳、肌痛、淋巴结病、脾肿大和肝肿大。急性期还常伴有明显的寄生虫血症和寄生虫的全身循环。在诊断病例中，死亡率可能高达10%，尤其是在经口感染的病例中6。慢性期通常表现为长期无任何症状。随着时间推移，大约三分之一在数十年前感染的患者会出现心脏表现，通常伴有纤维化和心肌炎症，和/或胃肠道紊乱，主要与巨食管和/或巨结肠综合征的发展相关3,5,6。

恰加斯病的病因治疗仅包括两种药物：苯硝唑和硝呋莫司。这些抗寄生虫药物已使用超过50年，具有明显的毒性且疗效有限5,7,8。因此，迫切需要为恰加斯病患者开发新的、安全且更有效的治疗方法。

如今，更复杂且精确的技术使得人们能够回答一些长期存在的问题，从而推动了对恰加斯病新疗法的探索。在这方面，经过基因改造的寄生虫为开展感染过程及药物疗效评价的体内研究提供了重要支持9,10,11,12。基于生物发光成像（BLI）系统的纵向检测方法可在治疗过程中及治疗结束后评估药物疗效，有助于鉴定具有锥虫杀灭活性的化合物10,13。BLI 方法通过定量检测经基因改造的T. cruzi CL Brener Luc::Neon 菌株所发出的光信号，直接测量循环系统或组织器官中的寄生虫负荷量11，该菌株可持续表达红移型萤火虫荧光素酶12。

尽管在建立恰加斯病BLI动物模型及药物疗效研究方法后已过去近10年，但目前仍仅有少数研究团队掌握并主导该技术。这一现状不仅源于成像设备获取受限，更在于缺乏系统化、详尽的操作流程以及相关培训资源。相较于依赖显微镜检测寄生血症、血清学方法或通过qPCR检测寄生虫DNA以评估器官/组织感染程度的传统手段，该方法具有多项优势：它能够通过获取更可靠且整合性更强的数据，提升实验小鼠的福利水平，并减少实验动物的使用数量。 体内此外，这种方法的灵敏度可能更高，因为它能够在药物治疗后轻松检测到内脏器官中的寄生虫病灶。10,12因此，本实验方案旨在通过详细描述技术操作步骤，指导寄生虫学及其他传染病研究团队在其实验室中建立该方法。本文分享了在巴西实施恰加斯病生物发光成像（BLI）模型的经验，这是拉丁美洲首个此类模型，作为被忽视疾病药物倡议组织（DNDi）协调的药物发现工作的一部分。

方案

本方案中描述的所有操作均按照圣保罗大学生物医学科学研究所动物伦理委员会预先提出的指南14 提交、批准并实施：协议编号 CEUA ICB/USP no 5787250522。

1. 溶液

注意：建议给药体积为 10 mL/kg（以 20 g 体重的小鼠为例，即 200 µL）15,16。例如，配制 15 mg/mL 的工作液，以达到动物剂量 150 mg/kg。

  1. 羟丙基甲基纤维素悬浮液载体（HPMC-SV）
    注意：所需试剂为 0.5%（w/v）羟丙基甲基纤维素（HPMC）、0.4%（v/v）吐温 80 和 0.5%（v/v）苯甲醇。
    1. 配制 200 mL 载体溶液时，称取 1 g HPMC，溶于 64 mL 热的超纯水中，搅拌 2 分钟。
    2. 加入 120 mL 冰冷的超纯水，持续搅拌 1 小时，再加入 1 mL 苯甲醇。
    3. 使用反向移液技术加入 0.8 mL 吐温 80，并持续搅拌直至溶液变为透明。
    4. 将溶液定容至最终体积 200 mL。将 HPMC-SV 在冷藏条件下（4 °C）保存，最长不超过 3 个月。
  2. 苯硝唑
    1. 计算所需化合物溶液的体积，公式如下：
      化合物溶液体积 =（每日给药次数 × 给药天数 × 处理小鼠数量 × 每只小鼠给药体积）+ 30% 额外余量。
    2. 根据所需剂量称取相应量的苯硝唑（BZ）。在治疗克氏锥虫慢性感染模型时，每日一次口服 100 mg/kg 剂量，连续给药 10 天，可实现 100% 治愈率17。
    3. 根据所需最终体积，计算达到 5%（v/v）DMSO 浓度所需的量，并将 BZ 完全溶解于纯 DMSO 中。
    4. 向玻璃试管中加入适量载体，使 HPMC-SV 的终浓度为 95%（v/v）。将溶解于 DMSO 中的 BZ 转移至含有 HPMC-SV 的玻璃试管中。剧烈混匀悬浮液，并在 4 °C 下保存。
      例如：BZ 制剂的最终体积 = 10 mL（步骤 1.2.1）
      BZ 用量 = 100 mg（步骤 1.2.2）
      5% DMSO = 0.5 mL（步骤 1.2.3），95% HPMC-SV = 9.5 mL（步骤 1.2.4）
    5. 每次给药前，将制剂置于 37 °C 超声水浴中处理 5 分钟，并在动物给药前剧烈混匀。
  3. 环磷酰胺
    1. 将所需量的环磷酰胺溶于超纯水中，配制成 12.5 mg/mL 的溶液。
    2. 通过过滤除菌，于 4 °C 保存。
  4. 吉姆萨染色液
    1. 将 0.6 mg 吉姆萨粉末试剂溶于 50 mL 甲醇中，加入 25 mL 甘油并混匀。使用滤纸和漏斗去除沉淀物。将储备液在室温（RT）避光保存。
    2. 通过将 10 mL 吉姆萨溶液稀释于 90 mL 混合磷酸盐缓冲液（20.5 M Na2HPO4，65.4 M KH2PO4，pH 7.2）中配制工作液。

2. 克氏锥虫 培养

  1. 在生物安全柜（BSC）中操作，将 4 × 106 个/mL 的T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 滋养体培养于 LIT 培养基（68.44 mM NaCl、5.36 mM KCl、112.7 mM Na2HPO4、5 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 肝浸液肉汤、0.03 M 血红素、4.16 mM 葡萄糖）中，添加 10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100 µg/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素以及 150 µg/mL 潮霉素作为筛选药物，在 28 °C 条件下培养。寄生虫通常在 3–4 天内进入稳定期。
  2. 通过将 3 × 108 个无鞭毛体置于含 10%（v/v）FBS 的 10 mL Grace's 昆虫培养基中，于 28 °C 在 15 mL 圆锥形试管中孵育 7–10 天，诱导其转化为感染性寄生虫，以实现动基体形成。
  3. 通过吉姆萨染色涂片评估分化率。取 20 µL 已分化寄生虫悬液滴于载玻片上，室温干燥 10 分钟。
  4. 在通风橱内，用纯甲醇覆盖载玻片对样本进行固定，静置完全干燥（1–2 分钟）。随后用吉姆萨工作液覆盖载玻片染色 20 分钟。
  5. 用蒸馏水轻轻冲洗载玻片。在显微镜下计数动基体型前鞭毛体所占百分比。若分化率达到至少 10%，则进行下一步操作。
  6. 将寄生虫以 120 × g 离心 10 分钟，弃上清后用 10 mL DPBS 重悬沉淀。再次离心后，将寄生虫重悬于 5 mL 添加了 10%（v/v）FBS、100 µg/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的 DMEM 培养基中。
  7. 在 25 cm2 培养瓶中，以每瓶 1.66 × 105 个的数量接种 LLC-MK2 细胞（来自Macaca mulatta的肾上皮细胞），在 37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中培养18，进行感染实验。
  8. 组织培养型前鞭毛体（TCTs）在感染后 8–9 天释放至培养基中。将 TCTs 以感染复数（MOI）1:40 的比例接种至新鲜的 LLC-MK2 单层细胞中进行下一轮感染。

通过流式细胞仪分析克氏锥虫种群均一性

  1. 收集CL Brener Luc::Neon株和CL Brener野生型株的TCTs，以120 × g 离心10分钟，用DPBS重悬TCTs。调整寄生虫密度至1 × 106/mL。
  2. 根据mNeonGreen荧光（激发波长506 nm，发射波长517 nm）19，通过流式细胞仪进行群体分析，每份样本至少采集20,000个事件。
    注意：荧光阳性群体百分比通过将转染寄生虫与野生型寄生虫进行比较获得。进行小鼠感染前，CL Brener Luc::Neon品系的荧光寄生虫群体比例应至少达到95%（补充图1）。

4. 小鼠实验感染

注意：为了增加寄生虫数量，血液中的动基体鞭毛体（BT）通常从免疫缺陷小鼠中获取10,13。本实验采用化学免疫抑制法处理BALB/C小鼠以获得BT。具体方法为：在感染T. cruzi的同时，每隔96小时进行一次腹腔注射环磷酰胺（CTX），剂量为62.5 mg/kg，共注射四次，以实现轻度免疫抑制。

  1. 在感染 T. cruzi 前1天，通过腹腔注射（i.p.）给予每只小鼠无菌环磷酰胺62.5 mg/kg。
  2. 通过腹腔途径，每只小鼠接种1 x 104 条TCTs，溶于0.2 mL DPBS中。操作病原体和针头时存在较高事故风险，需特别注意。整个操作过程应在生物安全柜（BSC）中进行，并佩戴手套和面部防护罩。
  3. 通过直接显微镜观察血液中的锥鞭毛体（BT）每日监测寄生虫血症（Pizzi-Brener法）20。在感染后约13–17天（dpi）寄生虫血症达峰值时，进行采血。采血前以100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪麻醉小鼠。
  4. 待小鼠完全麻醉21后，使用连接24 G X¾针头的1 mL注射器进行心脏穿刺，针头内预先加入50 µL 3.8%（w/v）柠檬酸钠。拔下针头后，轻柔地将血液转移至离心管中。
  5. 在生物安全柜（BSC）中，取部分血液与氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液进行稀释，并在牛鲍计数板中计数寄生虫。由于微小血凝块会影响计数结果，该步骤至少重复两次。
    注意：为避免计数误差，应调整稀释倍数，使牛鲍计数板中每个计数区域的锥鞭毛体数量不低于30条且不超过300条。
  6. 通过将适量全血与DPBS混合，将寄生虫浓度调整至5 x 103 BT/mL。
  7. 使用26 G针头通过腹腔途径对非免疫抑制的BALB/c小鼠进行感染，每只小鼠接种0.2 mL DPBS中含有1 x 103 条BT（即5 x 103 BT/mL）；注意使用更细的针头可能导致寄生虫裂解22。腹腔注射完毕后，将针头保留在小鼠体内5秒，以防止液体回流。
  8. 将感染后的小鼠暂时置于铺有纸巾的盒子中，观察是否有渗漏或出血情况，随后将小鼠放回笼具中。

5. 在体 成像

注意：此处所用术语的名词解释如下：

成像实验：在特定实验中，于给定日期对所有组别进行的生物发光信号采集。图1A 展示了该操作流程的概览。

成像流程：每组三只小鼠进行一次成像操作，从D-荧光素注射开始至麻醉恢复结束。由于小鼠体内寄生虫负荷存在固有变异性以及其他影响生物发光成像（BLI）定量结果的因素（如下所述），建议每个实验组包含6只小鼠。

成像采集：通过成像设备进行拍摄以定量生物发光，结果为一张照片与以伪彩色标度显示的定量生物发光信号叠加的图像。

成像流程：本方案中讨论的所有步骤。

生物发光成像示意图，展示荧光素酶反应及通量图数据分析，体内研究。
图 1：获取生物发光成像（BLI）数据。 （A）用于传染病研究的数据采集工作流程示意图，以恰加斯病生物发光小鼠模型为例。感染经基因改造的T. cruzi的小鼠在预定时间点接受体内成像分析。每次成像时，每组最多三只小鼠注射150 mg/kg的酶底物（D-荧光素）。5分钟后，以氧气中2.5%（v/v）异氟烷进行麻醉。当小鼠完全静止后，将其置于成像系统中，并根据预设参数开始图像采集。成像完成后，小鼠从麻醉中恢复并放回笼中。采集过程中研究人员可能遇到的常见问题和挑战以红色标出。 本示意图改编自Lewis等（2014）12（使用BioRender.com创建：UD26KWEVS2）。（B）D-荧光素/红移萤火虫荧光素酶（PpyRE9h）的体内动力学。处于T. cruzi寄生虫血症高峰期的小鼠（n = 3）被麻醉后注射150 mg/kg D-荧光素。连续采集图像1小时（曝光时间：2分钟；binning：4）。上图：腹侧总通量（p/s）定量结果（左侧Y轴，红色）以及相对于最高平均值的百分比（右侧Y轴，蓝色）。数据以均值曲线和标准差（阴影区域）表示。下图：采集的早期（4分钟）、BLI信号最强（30分钟）及末期（62分钟）时间点的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 检查绿色进度条 采集 窗口以确认电荷耦合器件（CCD）相机是否已冷却至低温（-90 °C）点击色条（绿色或红色）以查看温度。
    注意：根据成像设备使用手册，应始终保持成像设备和软件处于开启状态，以确保CCD保持低温。
  2. 验证是否已执行自动背景校正。为此，请单击 采集 > 背景 > 查看可用的暗电荷将出现一个包含多个设置组合的列表。
    注意：此步骤可降低发光噪声。若所选配置根据公式“曝光时间 ×（binning²）”计算出的数值高于1000，则不应忽略暗电流。根据软件配置的不同，binning 可能显示为一个数值（binning 因子）或从“小”到“大”的范围。该范围与 binning 因子之间的对应关系可在设备手册中查得。
  3. 如果 活动窗口 （软件底部的白色区域）未显示时，请在 菜单 视图 > 活动窗口.
  4. 通过单击来设定成像区域 采集窗口 > 视野。选项 C （13.2 cm）获取3只小鼠，且 选项 D （22 厘米）捕获 5 只小鼠。
  5. 点击以选择自动保存选项 采集 > 自动保存 并为每个时间点选择或创建一个新文件夹。
  6. 在成像区域铺上一张哑光黑纸，并将分隔载玻片垂直放置于进样口之间。如果制造商未提供载玻片，可使用尺寸为3 cm × 15 cm的哑光黑纸片替代。
  7. 调节成像室内部空间，以适配连接麻醉进气口的玻璃鼻锥。使用小块黑色电工胶带将麻醉系统固定在平台（图像区域外）。
    注意：在某些成像设备的版本中，激光用于定义成像区域。如果该工具不可用，可通过软件采集图像，以检查成像区域内样本的位置分布。
  8. 将异氟烷挥发器设定为在氧气中浓度为2.5%（v/v），用于成像和诱导舱。通过压力表检查气体是否在系统中流动21.
    注意：如果成像设备未连接吸入式麻醉系统，也可选择其他麻醉方式，例如注射用赛拉嗪和氯胺酮23在这种情况下，小鼠恢复缓慢，且死亡风险较高24.
  9. 用注射器（31 G 针头）吸取 D-荧光素（不同供应商提供了制备 D-荧光素的详细方案）25,26，避免直接光照，并准备几个塑料容器或额外的笼子，内壁用纸巾覆盖。
  10. 在实验过程中，将钟表或手表置于附近以便准确计时，并准备好实验记录本，用于记录小鼠分组、荧光素注射时间及其他相关信息。
  11. 称重所有小鼠并记录其体重。使用记号笔或尾部纹身标记每只小鼠。在整个实验过程中确保小鼠编号清晰可辨。此步骤也可在获取数据的前一天完成。
    注意：标记不应占据过大的体表面积，因为墨水可能会干扰生物发光信号。不同颜色的记号笔也有助于区分不同组别。
  12. 开始成像实验时，先采集一张背景生物发光图像（设置： 曝光时间：5 分钟； 分箱“大”或“16” 光圈值：1）在不放置小鼠的情况下对成像室进行检测。该步骤有助于识别自发光光源或设备上的其他异常问题。
    注意：由于生物发光成像（BLI）基于酶促反应，时间是实验中的关键因素。在开始动物操作前，务必检查上述所有项目及设备设置。
  13. 向前三只小鼠腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin，注意避免触及内脏。将小鼠放入容器盒中，观察D-luciferin是否泄漏（亮黄色溶液）。如发生泄漏，需记录相应情况，并登记小鼠分组及D-luciferin注射时间。
  14. 等待5分钟，然后将小鼠转移至麻醉诱导室。打开系统，小鼠完全麻醉约需3分钟（表现为无腿部抖动、尾部摆动等反应）。21.
  15. 打开成像设备的门，开启麻醉气流向成像室，并同时关闭诱导室。
  16. 将每只小鼠放置于鼻罩位置：从左至右依次为小鼠1-3。将小鼠腹侧朝上，轻柔地安置在激光指示的成像区域内。在安置过程中，核对小鼠的编号与位置。切勿强行将部分麻醉的小鼠插入鼻罩。
  17. 将分隔板放置在小鼠之间，并关闭成像设备的门。
  18. 调整软件中的采集参数 采集窗口，如下所示：
    1. 对于未感染的小鼠， 曝光时间 = 5 分钟 / 分箱 大 或 16
      （对阈值设定最具数学敏感性的一组配置）
    2. 对于急性模型中的感染小鼠： 曝光时间 = 2 分钟/ 分箱 中等或4
    3. 慢性模型中感染的小鼠： 曝光时间 = 5 分钟/ 分箱 “大”或“16”
  19. 确认D-荧光素钠注射时间是否在开始采集图像前至少10分钟完成。若未满足该时间间隔，则需等待必要时间，以确保在荧光素酶信号峰值期间获取图像图1B）；否则，请点击 获取 开始图像采集。
  20. 的 图像标签 成像开始后将出现一个窗口。在相应输入框中填写每组的适当信息，包括荧光素注射时间、实验名称、小鼠编号、时间点，以及任何有助于记录的其他所需信息。这些信息将被包含在测量数据表文件中。
  21. 验证警告标志是否有效 饱和图像 成像采集结束时会显示结果。饱和图像不可接受。如果出现此情况，应降低像素合并（binning）并重新采集图像。请记录相关情况，以便在分析时予以考虑。
  22. 图像采集完成后，打开成像仪舱门，将小鼠翻转至背侧向上。重新进行图像采集，并做好相应标记。
  23. 成像采集结束后，关闭麻醉气流。将小鼠从成像室中轻轻取出，并放入容器中。
  24. 记录小鼠体重并观察麻醉恢复情况。记录操作过程中发现的任何异常行为或身体异常。待小鼠恢复活动后，将其放回笼中。
    注意：验证每张采集图像的生物发光成像（BLI）强度。采集结束后，记录的生物发光图像和照片将在软件中显示，附带一个自动生成的比例尺，该比例尺不应被采用。请使用数据分析中定义的比例尺（如下所述）进行设置。 工具调色板 窗口

6. 数据分析

注意：上述方案基于商业产品 体内 成像软件。然而，无需软件许可的版本也可执行最基本的分析。软件详细信息可在以下位置找到： 材料表.

  1. 打开文件。
    1. 打开包含特定成像时间点所获取数据的文件夹，方法是选择 菜单 文件 > 浏览器 > 选择 文件夹（图 2A - 步骤1）。
      注意：一个以表格格式显示的新窗口将会打开，其中保存了所获取的所有数据。该窗口将显示 点击数 编号，即软件自动分配的图像ID（日期和小时数字），以及研究人员提供的信息 图像标签 采集过程中的时间窗口及采集参数设置。所有这些数据有助于筛选可用于分析的图像，因为饱和图像不得用于分析。
    2. 选择与所选图像相关的多行数据，包括未感染的对照组。在实验记录本中记下图像编号以及成像过程中登记的信息。
    3. 单击以组装选定的图像 作为组加载该步骤将创建一个新的序列图像，因此可以同时调整所有图像的特征。将新的序列图像保存在一个与步骤6.1中所用文件夹不同的新文件夹中，以便在需要时重新分析原始数据。
    4. 在序列图像中，通过点击来识别每幅图像所使用的分箱方式 选项 > 显示 > 选择合并因子 (图 2A - 步骤2）。获得的像素合并因子将显示在序列中每幅图像的顶部。
    5. 将所有合并因子校正为相同的数值。为此，请双击需要调整的图像。在弹出的窗口中 工具面板 窗 > 图像调整 切片，选择合适的 binning 因子（图 2A - 步骤3）— 分箱因子的选择参见步骤5.18。在所有发散图像中执行此操作。
      注意：该操作步骤直接影响生物发光成像（BLI）的定量结果（表1并在讨论部分进一步阐述。
  2. 设置比例尺。
    1. 根据未感染对照组确定有效的生物发光信号（依据设备说明书，高于600计数）。为此，双击未感染小鼠的图像，然后在新窗口的左上角选择该选项 计数 在 单位 领域。然后，调整 颜色标尺 对于600的最小值，所得图像将作为辐射亮度最小刻度的基准。
    2. 序列窗口处于活动状态时，选择该选项 辐射度 在 单位 领域。调整 颜色标尺 和 颜色表 在 工具面板. 为此，请取消勾选该复选框 个体 在 颜色标尺范围 区域。
    3. 标记盒子 对数尺度 和 手动 (图 2A - 步骤4）。根据未感染对照组（如步骤6.8中所观察到的）设定最小刻度值，以信号最强的区域作为最大值（如图所示） 图 2A 由箭头所示。
      注意：体内二维光测量为相对定量。由于不同设备的版本和校准存在差异，可能导致测量尺度值不同。因此，代表性结果中所示数值可能与其他设备上进行的实验数值不一致，但只要在内部对照（未感染组与未治疗感染组）范围内，仍具有同等有效性。
    4. 在为所有图像设置相同的尺度后，双击每幅图像，最大化窗口，并使用以下方法将图像视图以图像格式（.jpg、.tiff 等）导出 导出图形 按钮，通过命名文件来 处理_小鼠编号_时间点. (图 2A - 第5步：对所有图像执行此操作。
  3. 进行测量。
    1. 从序列中选择任意一幅图像并双击。在 工具面板 窗口 > 感兴趣区域 工具部分，点击 方形 按钮图2B- 步骤1）绘制一个覆盖整只小鼠的矩形。
    2. 单击已创建的感兴趣区域（ROI）的边界，为每只小鼠复制并粘贴相同的 ROI（最终在图像中生成三个 ROI）。通过单击保存按钮保存这些 ROI。 ROI 工具部分. 通过选中复选框，将已保存的感兴趣区域（ROI）应用于所有图像 应用于序列，然后单击 加载. 保存的感兴趣区域（ROIs）将用于整个实验中的所有小鼠。
    3. 调整每只小鼠的 ROI 位置，使其更贴合测量区域中的动物。当所有小鼠均标记完成后，点击 测量感兴趣区域 按钮图2B- 步骤2）。该 ROI 测量数据表 会出现。选择 测量类型：辐亮度；图像属性：所有可能值；感兴趣区域尺寸：cm然后，单击 全选 按钮，随后是 复制 按钮
    4. 将数据直接粘贴到表格分析软件（电子表格）中。或者，导出为 .csv 或 .txt 格式的文件。
  4. 处理数据。
    1. 在表格分析软件中，按组（处理组、未感染对照组、未处理组等）对数据进行整理。
    2. 寄生虫负荷以全身生物发光表示。因此，需将同一只小鼠的腹侧和背侧总荧光通量值进行匹配并求和。
    3. 计算每组总和值的平均值和标准差（例如： 补充表1)。将数据绘制成图表并导入统计分析软件。
    4. 在图像或幻灯片演示软件中制备一组生物发光图像面板。将每只小鼠置于列中，每个时间点置于行中，构建药物疗效矩阵，以方便数据的可视化与解读。
      注意：可以选择不执行步骤 6.2.4，直接在成像软件中构建图像查看 > 图像布局窗口然而，软件界面和工具限制了数据的组织。

活体成像分析、发光数据、软件界面、示意图、光强分布图
图 2：从设定图像尺度到发光强度定量的数据分析步骤。（A）Living Image 软件中的图像数据处理界面。步骤 1：使用浏览器工具将采集的数据作为序列上传。步骤 2：确认每次采集所使用的 binning 值（将显示在各单独图像上方）。步骤 3：将感染小鼠的所有图像设定为相同的 binning 因子，非感染小鼠则应用 binning 因子 16。步骤 4：根据非感染小鼠手动设定颜色尺度（紫色箭头），其在屏幕上应显示为无生物发光信号；而感染且未经治疗的小鼠应以其最强生物发光焦点（红色箭头）显示为红色。步骤 5：为获得不含任何文字信息的图像，双击每幅图像，并使用导出图形按钮导出图像。（B）感兴趣区域（ROI）工具界面。步骤 1：绘制一个完全覆盖一只小鼠的 ROI，并将该 ROI 复制粘贴至每只动物。保存调整后的 ROI，并将其应用于实验中的所有图像。步骤 2：点击测量 ROI按钮，生成可导出为 .csv 或 .txt 格式的表格。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 离体 步骤

  1. 每只用于 ex vivo 成像的小鼠腹腔注射 150 mg/kg D-萤光素，注射后等待 3 分钟。随后通过腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪对小鼠进行麻醉。
  2. 在生物安全柜中，当小鼠对足部夹捏完全无反应时，剪开小鼠皮肤以暴露腹膜（不打开腹腔）以及左侧腋部组织。通过切断腋动脉和血管进行放血处死。
  3. 使用一次性巴斯德吸管收集血液。然后经心脏左心室灌注 10 mL 含 0.3 mg/mL D-萤光素的 DPBS 溶液。
  4. 将选定的器官置于培养皿上预先确定的位置，并浸入 0.3 mg/mL D-萤光素溶液中。该操作必须在 30 分钟内完成。
  5. 使用 5 分钟曝光时间和 16 倍 binning 模式，对离体器官（心脏、肺、胸腺、肝、股四头肌、肠系膜、脾、肾、肾上腺、内脏脂肪、食管、胃、小肠、盲肠、结肠、脑、皮下脂肪、子宫、性腺脂肪、膀胱和腹膜）进行生物发光成像，具体参数根据信号强度调整（不可接受信号饱和的图像）22。
    注意：在处理感染小鼠前，须先对未感染小鼠执行相同操作以设定信号阈值。

结果

利用基于组成型表达荧光素酶的转基因寄生虫的合适小鼠模型，能够重现关键的人类T. cruzi感染特征，同时对宿主造成的伤害最小，从而可通过全身体内生物发光成像（BLI）对宿主中的寄生虫进行长达数月的实时、纵向（终生）追踪12。

图3展示了一项初步实验，显示了CL Brener Luc::Neon株在BALB/c小鼠体内从感染后第1天至感染后150天（dpi）的感染时间进程。在前20天内，基于生物发光信号推断的寄生虫负荷上升，表现为典型的寄生虫血症高峰，随后由于小鼠免疫系统的控制作用，寄生虫负荷急剧下降。因此，感染的急性期定义为前50天。当感染达到稳定的生物发光水平时，即进入慢性期，通常出现在100至150 dpi之间。

慢性感染研究，生物发光成像，通量图；感染进程分析。
图3理解模型。 动力学 克氏锥虫 CL Brener Luc::Neon 感染 BALB/c 小鼠（n = 11）。上图：通过腹腔注射 1 × 10³ 个血液型动基体鞭毛体，感染后 150 天内不同时间点的腹侧与背侧生物发光图像。热图标度（以 Log 为单位）10) 以辐亮度（p/s/cm²/sterad）表示的生物发光信号2/sr）。颜色代码：紫色 = 5 × 103；红色 = 1 × 107下图：小鼠整体生物发光信号以总通量（p/s）进行定量。数据以均值（线条）和标准差（阴影区域）表示。该小鼠模型中感染急性期与慢性期的时间段以橙色标出。非感染小鼠（n = 3）的发光均值作为阈值（浅灰色线）显示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

由于感染的主要阶段在小鼠模型中得到了良好重现，因此也可以预测治疗效果。因此，生物发光成像（BLI）现已被应用于转化科学研究，通过概念验证研究支持有关化合物疗效潜力及其在研发管线中推进决策的判断10,27。在急性小鼠模型中，口服治疗应在感染达到寄生血症高峰时开始（约感染后14–21天），此时血液中含有大量上鞭毛体（约1 × 105 个上鞭毛体/mL——数据未显示），并表现为全身性感染。在慢性阶段，小鼠治疗始于感染后100天，此时寄生虫负荷相对低得多，且寄生血症处于稳定的隐性水平。

为展示上述方案在抗寄生虫药物评价中的应用，我们比较了苄硝唑（BZ）——目前治疗恰加斯病的标准药物，与泊沙康唑（Posa）——一种甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）抑制剂，后者在恰加斯病的临床试验中已显示无效，且已被证实作为抗寄生虫药物针对 T. cruzi 体外培养 和 体内，包括在本方案所述的BLI模型中13,18,28,29,30.

在急性小鼠模型中，每组6只小鼠，分别通过口服灌胃31给予波沙（Posa）20 mg/kg 或苯硝咪唑（BZ）100 mg/kg，每日一次，持续20天。另设小鼠给予BZ 100 mg/kg 每日一次，连续治疗5天，以评估短期治疗的效果。在药物清除期（停药后10天），将生物发光成像（BLI）阴性小鼠进行免疫抑制处理，该条件可在未实现寄生虫学治愈时促进感染复发（图4A）。波沙治疗在疗程结束时使基于生物发光推断的寄生虫负荷减少了99.49% ± 0.27%（均值 ± 标准差），并在药物清除期间维持与非感染小鼠相似的水平（仅小鼠#3在40 dpi时出现短暂信号，小鼠#2在44 dpi时显示微弱的BLI信号）。与未治疗组相比，BZ连续治疗20天在疗程结束时使基于生物发光推断的寄生虫负荷减少了100% ± 0.01%。相比之下，BZ短期治疗5天在19 dpi时实现了99.98% ± 0.03%的减少（接近检测阈值水平）。然而，此种BLI信号的降低是短暂的，在后续检测中，所有小鼠均出现感染再激活（图4B）。

CD急性模型时间线与数据；感染、治疗；实验结果；示意图、图表
图4：利用生物发光成像在恰加斯病急性模型中开展的概念验证实验设计及结果。 (A急性克氏病小鼠模型用于化合物疗效临床前评估的时间线流程示意图。黑点：成像时间点。药瓶和橙色条：分别表示治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射。dpi：感染后天数。颜色编码：灰色 = 未治疗感染；橙色 = 治疗期；蓝色 = 化合物清除期；黄色 = 免疫抑制期。B) 处理时间进程 克氏锥虫左图：BALB/c小鼠的腹侧生物发光成像结果，(i) 未处理组，或经20天处理的 (ii) 泊沙康唑（Posa）20 mg/kg组、(iii) 苯硝唑（BZ）100 mg/kg组（连续给药20天）和 (iv) 苯硝唑（BZ）100 mg/kg组（给药5天）（每组n = 6）。所有药物均通过灌胃途径每日给药一次（10 mL/kg）。Log10 色阶热图表示从低（蓝色）到高（红色）的生物发光信号强度。右侧图表：全身体内生物发光成像数据的定量分析。数据以均值（线条）和标准差（阴影区域）表示。图注：药瓶图标：治疗开始（感染后第14天）；橙色竖线：治疗结束（感染后第18天/第33天）；注射器图标：环磷酰胺注射（第44–53天）；橙色圆点：用于分析的小鼠 离体 步骤；§ 由于尿液中 D-荧光素泄漏，相关数据已被排除。C) 离体 操作步骤 T. cruzi 器官和组织中病灶检测。图底部展示了孔板分布图例（由 BioRender.com 制作：ZY26LG8AOF）。采用相同的辐射强度标度 体内 面板 请点击此处查看该图的放大版本。

在此模型中，抗寄生虫治疗可能将寄生虫负荷降低至BLI检测下限（1000个寄生虫）以下，因此小鼠表现为BLI阴性10为确保实现寄生虫学治愈，有必要通过环磷酰胺处理对小鼠进行免疫抑制。29,32. 经药物治疗后寄生虫负荷仍不可检测的小鼠，在免疫抑制后将转为生物发光成像阳性。在急性模型中，Posa处理更广泛地展示了这一效应，其可促进寄生虫复发。本实验中，e离体 在生物发光信号最低的小鼠中进行该操作，以评估寄生虫的组织趋向性（图4C）。未经治疗的小鼠显示出强烈的生物发光信号，尤其是在胃肠道（TGI）及内脏脂肪和肠系膜等相关组织中。此外，皮肤也是寄生虫持续存在的部位之一。接受泊沙康唑（Posa）治疗的小鼠表现出强度较低的生物发光信号，且信号更局限于结肠、肠系膜和内脏脂肪。另一方面，采用治愈性治疗方案（如每日给予BZ 100 mg/kg，持续20天）处理的小鼠，即使在免疫抑制条件下也未检测到生物发光信号。因此，在考虑促进生物发光信号上升至超过1000个寄生虫阈值水平的条件下10，并通过暴露内脏器官以提高检测灵敏度，认为连续20天给予100 mg/kg的BZ可实现无菌治愈。此前已采用多种技术对无菌治愈的评估方法进行了验证10,13,17,33,34.

在慢性模型中采用了类似的研究设计（图5A），其中小鼠（每组 n = 6）从感染后第100天开始治疗。此时，每日口服给予泊沙康唑（Posa）20 mg/kg、BZ 100 mg/kg 或 10 mg/kg，持续20天。在药物清除期结束后，对生物发光成像（BLI）阴性的小鼠进行免疫抑制处理。此外，为了评估无菌治愈情况，在免疫抑制阶段结束时仍保持BLI阴性的小鼠接受离体（ex vivo）分析。

在慢性感染中，使用20 mg/kg的Posa治疗，治疗结束时通过生物发光推断的寄生虫负荷降低了95.03% ± 6.18%，且在药物清除期间维持在与未感染小鼠相似的水平。免疫抑制后，大多数小鼠表现出不同程度的BLI信号和分布图5B). 离体 实验结果显示，一只经泊沙康唑处理且全身生物发光成像呈阴性的 小鼠，通过成像检测可在结肠部位发现一处生物发光信号 离体 检查（图 5C).

CD慢性模型时间线、生物发光成像、治疗效果、感染实验结果
图5慢性模型中的药物评估实验设计及取得的结果 克氏锥虫 通过生物发光成像检测感染。 (A慢性恰加斯病小鼠模型实验设计示意图。黑点：成像时间点。药瓶图标和橙色条：分别表示治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射。dpi：感染后天数。颜色编码：灰色 = 未治疗感染；橙色 = 治疗期；蓝色 = 化合物清除期；黄色 = 免疫抑制；淡紫色 = 复发。B) 克氏锥虫病慢性模型中治疗效果的纵向评估。左图：BALB/c小鼠的腹侧生物发光成像（BLI），（i）未治疗组，或经20天治疗组：（ii）口服20 mg/kg泊沙康唑（Posa）；（iii）口服100 mg/kg苯硝咪唑（BZ）；（iv）口服10 mg/kg苯硝咪唑（BZ）（n = 6/组）。所有药物均通过灌胃每日给药一次。右图：腹侧与背侧总荧光通量原始数据之和。图示：药瓶图标：治疗开始（感染后第102天）；橙色条：治疗结束（感染后第121天）；黄色条与注射器图标：环磷酰胺注射（第131至142天）。橙色圆点：经分析的小鼠 离体 操作过程中！小鼠在麻醉期间死亡。 静力平衡，ΣFx=0 示意图，用于说明受力平衡，是物理与工程教育中的关键内容。 小鼠表现出腹部异常。热图刻度（Log10) 表示以辐射单位计量的生物发光强度，从低水平（3 × 10⁻⁹）开始5 为蓝色）到高（1 × 107 如红色所示）。(C) 离体 分析 T. cruzi 组织趋向性。免疫抑制小鼠离体器官的生物发光检测 体内 经Posa和BZ（100 mg/kg）处理后BLI呈阴性的动物，或未经处理组及BZ（10 mg/kg）组中信号最低的动物。图底部显示了孔板分布示意图（由BioRender.com制作：ZY26LG8AOF）。辐射度标尺单位相同 体内 面板 请点击此处以查看此图的放大版本。

以100 mg/kg剂量给予BZ处理，在122 dpi时将生物发光降低至阈值水平（93.87% ± 2.14%），并持续至实验结束。考虑到 离体 分析显示，BZ治疗组达到了100%的治愈率（6/6只小鼠），即使在免疫抑制状态下且对内脏器官进行检测后，也未发现生物发光信号的复发，表明无复发迹象。然而，较低浓度的BZ治疗方案仅使生物发光信号轻微降低（85.95% ± 18.43%），但未能实现治愈，因为小鼠在后续所有时间点仍持续显示可检测到的生物发光信号病灶。因此，该模型能够对无效治疗（如泊沙康唑及苯并咪唑次优治疗）与有效治疗（如苯并咪唑的最佳剂量和疗程）进行定量区分。

补充图1：通过报告基因mNeonGreen荧光检测克氏锥虫（T. cruzi）群体在感染前的荧光素酶表达分析。 对CL Brener Luc::Neon寄生虫持续表达的mNeonGreen荧光蛋白进行流式细胞术分析。图中为寄生虫数量（Y轴）相对于mNeonGreen荧光强度（X轴）的归一化直方图。内部图例显示了所分析的菌株与形态、荧光中位值以及荧光群体百分比。门控线由CL Brener野生型（WT）菌株作为非荧光对照确定。请点击此处下载该文件。

补充表 1：BLI 测量中分析表格的示例。 从代表性结果中所示急性模型感染后第 19 天的生物发光成像定量获得的原始数据，该结果见于 图 4B。组别说明：对照组为未感染小鼠（n = 3/组）；溶剂组为感染但未治疗小鼠；泊沙康唑（Posa）剂量为 20 mg/kg，连续给药 20 天；苯硝唑（BZ）剂量为 100 mg/kg，连续给药 20 天；苯硝唑（BZ）剂量为 100 mg/kg，给药 5 天（n = 6/组）。请点击此处下载该文件。

讨论

生物发光成像是一种突破性方法，可通过可见光和红外电磁波谱检测报告基因，因此无需使用放射性标记物来追踪样本35。该技术适用于啮齿类动物模型及其他小型物种，在临床前研究中尤为有用，因其更安全且可进行多次成像，对动物造成的不适极小。此外，由于能够将生物发光、荧光与其他技术（如正电子发射断层扫描）相结合，in vivo 成像具有很高的灵活性36。

光学成像受光学物理特性支配，例如吸收和散射。不同组织对不同波长的光具有各异的吸收和散射特性37一个关键步骤是在选择报告基因时未考虑化学反应所产生光的发射波长。尽管报告基因的表达水平可能很高 体外 在生物发光检测中，当进行到下一步时，可能无法达到相同的表达水平 体内 设置。在本方案中，我们使用了红移的 Photinus pyralis 荧光素酶（PpyRE9H）38 为锥虫科生物优化的密码子版本9，其在617 nm处发光，是其中最适合的波长之一 体内 研究39波长超过600 nm的光被体内内源性发色团（尤其是血红蛋白和黑色素）吸收和散射的程度较低。因此，红光可穿透数厘米厚的组织，使光子即使来自内脏组织内部也能到达CCD相机39,40.

成像领域的一个关注点是，人们对成像技术的功能和效应缺乏全面的理解。像素合并（Binning）是一种预处理技术，可将相邻探测器获取的信息整合为更大的像素。该过程能够提高信噪比，降低背景噪声，增强灵敏度。然而，它会降低空间分辨率的准确性，导致图像出现像素化现象41,42。 这种权衡是在制定成像策略时需要重点考虑的因素。

根据恰加斯病的目标产品概况和目标候选药物概况34，概念验证研究的重点是检测克氏锥虫（T. cruzi）的敏感性，并帮助确定新的候选药物是否能够实现无菌性治愈（表现为经过多轮免疫抑制后无复发）。因此，我们采用最高的分箱因子进行生物发光成像（BLI），但避免图像过饱和。当图像出现过饱和时，将使用较低的分箱因子重新进行成像采集。在分析过程中，对使用了不同分箱因子的图像应用数学校正方法。通过这种方式，最终数据应以相同的分箱因子呈现。表1展示了在同一图像和感兴趣区域（ROIs）应用不同分箱因子时获得的数值差异。

表1：分箱设置对BLI定量的影响。 对急性模型（d13）和慢性模型（d118）图像上的三个感兴趣区域（ROI）在不同分箱因子下进行定量分析。请点击此处下载该表格。

由于目前临床中恰加斯病的现状，药物研发的目标是彻底清除寄生虫 （寄生虫学治愈）27,34因此， 体内 临床前实验方案包含多种方法，以克服生物发光成像（BLI）技术灵敏度的局限性。其中一种方法是使用环磷酰胺处理小鼠，以降低免疫反应，从而减少对寄生虫载量的控制。另一种策略是减小组织深度，去除阻碍光线到达相机的肌肉、皮肤和毛发层。通过上述方法 离体 步骤，可检测到微小的生物发光点，揭示出皮下的寄生虫病灶 体内 BLI 阈值，如图所示 图5C 在 离体 Posa处理小鼠的结果

设计初步实验以评估模型本身及感染动态，对于建立准确的抗寄生虫药物疗效评价实验至关重要。因此，研究人员可提前确定合适的生物发光成像（BLI）参数和感染时间进程。在探索性实验中，一种有助于确定图像采集参数的工具是“自动曝光”功能。使用该工具时，研究人员可设定三个参数（曝光时间、二乘二合并（Binning） 和 F/Stop）的优先级，以获取最佳图像。特别需要注意的是，应确保图像采集处于CCD相机的动态范围之内，避免过饱和或曝光不足，这可通过标尺的最小值和最大值以及自动曝光功能进行检查（菜单路径：编辑 > 首选项 > 采集选项卡 > 自动曝光选项卡）。在本方案中，相机光圈设置为最大值（F/Stop: 1），并为急性模型和慢性模型分别设定了不同的曝光时间和二乘二合并因子。这些设置有助于在同时进行多轮成像时实现时间上的可预测性。由于报告基因方法基于酶促反应，底物在小鼠体内的生物分布以及荧光素酶的动力学均会影响生物发光信号，从而影响感染程度的定量（图1B）。因此，在酶促反应的不同时间点采集图像会引入无法校正或补偿的数据变异性，进而影响总通量（光子/秒）或辐射通量（光子/秒/cm2/球面度）的计算结果。此外，T. cruzi 感染在小鼠体内具有动态的空间分布特征（不同区域和组织、深度以及寄生虫负荷）。因此，若仅依据设定的计数值进行图像采集，当某一较强信号源满足自动曝光条件时，可能会遗漏较弱的信号源（例如组织较深处某区域寄生虫数量较少），导致检测不全。

Living Image 软件的一个棘手特性是所获取图像会以自动颜色标尺显示。该软件没有选项可预先设置标尺，以使新获取的图像自动按照选定的标尺值显示（参见实验方案步骤 6.2）。这种情况迫使研究人员必须手动逐个调整图像至选定的最大值和最小值。因此，缺乏经验或培训不足的用户在采集过程中无法获得正确的读数，可能在此时误导数据或丢失重要信息。为此，预实验具有重要意义。

关于概念验证实验设计最常见的问题之一是如何选择处理持续时间和剂量。对于新化学实体，这些参数通常由化合物的效价和选择性决定 体外，结合在测试前开展的药物代谢与药代动力学（DMPK）及耐受性研究产生的数据 体内 以评估其有效性。综上所述，在鉴定出能够在细胞内选择性杀灭寄生虫的化合物后，将进行首次ADME实验（吸收、分布、代谢和排泄） 体外 以评估化合物的水溶性、细胞通透性和代谢稳定性等参数。若化合物表现出良好的平衡性 体外 特性（通常在目标候选特征谱中定义），随后这些候选物将被推进至 在体 在健康小鼠中进行的药代动力学（PK）研究，可阐明化合物在血液中的暴露情况（也可能包括组织中的暴露），并初步评估不同剂量水平下的耐受性17,34,43理想情况下，大多数感染性疾病中药代动力学评估的目标是确定游离血浆浓度（已校正血浆蛋白结合率）达到并超过EC的可行性50/EC90 浓度44 - 分别指在足够长的时间内，杀死或至少抑制50%或90%寄生虫生长的有效浓度。若在特定剂量水平达到足够的暴露量，则该给药方案可用于基于恰加斯病BLI模型的药效学研究。对于药物重定位研究， 体外 和 体内 应获取药代动力学数据。药物重定位的一个良好起点是化学数据库，例如 PubChem。45，这些数据可通过异速生长缩放法转换应用于小鼠46 以评估安全且无毒性的治疗方案供进一步测试。然而，实际情况并非总是如此。药代动力学（PK）研究在学术科研领域仍常被忽视，且很少有制药公司公开其PK研究结果。药物研发科学界建议，应在药物有效性检测（药效学）的同时，纳入体内药代动力学评估。47因此，临床前成像可与化合物检测同时进行，这种联合方法增强了数据的稳健性。

此外，在整个实验过程中需持续监测小鼠的操作、体重和健康状况。在临床前研究中，应记录并报告该组小鼠或个体小鼠出现的任何毒性迹象和副作用，例如弓背、颤抖、失去平衡、不愿移动、拒食或拒水、卧倒不起或其他任何异常情况。光学成像的目标之一是确保实验动物的福利。因此，对于出现“疼痛表情量表”中所描述疼痛迹象的小鼠，应实施人道终点措施48。同时，在进行生物发光成像（BLI）期间，小鼠每周 称重一次 ，而在给药和环磷酰胺（CTX）治疗期间则需更频繁地称重。根据动物福利相关规定，若小鼠体重减轻超过20%，必须立即实施人道安乐死。

T. cruzi 生物发光模型现已成为发现 和开发 克氏锥虫病新疗法的前沿实验模型。该模型可模拟 T. cruzi 感染及克氏锥虫病的关键特征49，能够实时监测寄生虫血症，并区分具有不同疗效特征且作用机制已知的化合物。生物发光成像（BLI）是一种可提高感染组织识别准确性的技术，能够精确定位可用于多种研究方法的感染组织，包括所有已在 T. cruzi 研究中应用的经典方法50,51。此外，该技术还使研究人员能够探索前沿技术并开发新技术33。同时，BLI 还遵循“3R”原则，有助于改善实验动物福利并实现更合理的动物使用10,35，一举多得。

多个专注于被忽视热带病的研究团队位于缺乏体内成像设备的国家。为应对当前状况，诸如全球生物成像（Global BioImaging）及其相关联盟等新型国际网络正推动相关行动，以提供对成像核心设施的开放获取，并加强技术人员与成像科学家的培训52,53。这些举措，结合本方案等易于操作的用户协议，可为所有研究人员创造条件，使高端技术得以普及化。该方法在临床前药物发现中的应用，提供了可靠的疗效读数和对临床结果的预测价值，有助于推动恰加斯病的药物研发。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Amanda Franscisco、John Kelly和Fanny Escudié在药物功效检测方面提供的BLI培训与支持，感谢John Kelly和Simone Calderano提供寄生虫，以及Gabriel Padilla在动物实验方面的支持。A.C.S.获得了巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）PSDE奖学金，用于在伦敦卫生与热带医学院（英国）进行培训。作者还感谢圣保罗大学科研核心设施（CEFAP-USP）的流式细胞术与成像研究（FLUIR）平台在IVIS Spectrum设备分析方面提供的技术支持，以及圣保罗大学生物医学科学研究所（ICB-USP）遗传学与卫生控制实验室在实验后为小鼠进行的特定病原体阴性（specific pathogen-free）质量控制检测。本项目由DNDi资助。DNDi感谢自2003年成立以来为其各项活动提供资金支持的公共和私人捐助方。DNDi捐助方的完整名单可访问 https://dndi.org/about/donors/ 查询。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD LSRFortessa™ X-20 细胞分析仪BD Biosciences
电子天平（动物房用）可从多家供应商处获得
IVIS Spectrum 活体成像系统Revvity（原 PerkinElmer）
FlowJ 软件 v10.7.1BD Biosciences
Spectrum 用 Living Image 软件 v4.7.1Revvity（原 PerkinElmer）可使用 Spectral Instruments Imaging（Bruker 公司）提供的免费分析软件“Aura Imaging”实现其基本功能（https://spectralinvivo.com/software/）
Microsoft Office 软件Microsoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM 低糖培养基VitrocellD0025
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761-500G
胎牛血清（FBS）Gibco16000-044
青霉素-链霉素Gibco15140-122
0.5% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300-062
LIT 培养基本实验室自制
潮霉素 B（50 mg/mL）Gibco10687010
Grace′s 昆虫培养基Sigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite D-荧光素钾盐Revvity（原 PerkinElmer）122799也可使用：VivoGlo 荧光素，活体级（Promega/P1043）；D-荧光素，单钾盐（Thermo Scientific/88293）或 Pierce D-荧光素，单钠盐（Thermo Scientific/88291）；D-荧光素，钾盐（GoldBio/LUCK 或 eLUCK）；D-荧光素，钠盐（GoldBio/LUCNA 或 eLUCNA）。钠盐与钾盐在溶解度上差异极小，对活体性能无显著影响。 
DPBSGibco21600-044
环磷酰胺（CTX）Sigma-AldrichC0768-5g
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD5879
羟丙基甲基纤维素（HPMC）Sigma-Aldrich09963-25G
苯甲醇Sigma-Aldrich402834
吐温 80Sigma-Aldrich P1754-1L
苯硝唑ELEA
泊沙康唑（Noxafil 商品制剂）Schering-Phough
吉姆萨染液可从多家供应商处获得
灌胃针（不锈钢直头）- 22GAAton CA2003
1 mL 注射器及 31G 针头可从多家供应商处获得
1 mL 注射器及可拆卸 26G 针头可从多家供应商处获得
1 mL 注射器及可拆卸 24G X¾ 针头可从多家供应商处获得
无菌注射器滤器 0.2 µm可从多家供应商处获得
A4 哑光黑纸 120 克或更厚Paper Color / Canson（可从多家供应商处获得）
铝箔可从多家供应商处获得
血细胞计数板（Neubauer 计数室）可从多家供应商处获得

参考文献

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