本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物的心脏是在发育过程中形成的复杂器官 通过 高度多样化的前体细胞群体。这些前体细胞的来源、招募时间及其命运对器官的正常发育至关重要。调控心脏形态发生的分子机制，对于理解先天性心脏病的发病机制以及胚胎期心脏再生具有重要意义。传统研究这些机制的方法依赖于构建转基因小鼠，以评估特定基因在心脏发育过程中的功能。然而，小鼠转基因技术复杂且耗时，通常难以用于快速评估特定基因在心脏发育中的作用。为解决这一问题，我们建立了一种高效的小鼠胚胎心脏电穿孔与培养方案，可实现瞬时转基因，从而快速评估与心脏发育相关基因的功能获得或功能缺失效应。利用该方法，我们成功在胚胎心脏中过表达了Meis1，且该基因转染更倾向于心外膜细胞，充分展示了该技术的应用潜力。
引言
心脏是胚胎发育过程中最先形成的器官。这一过程涉及来自胚胎不同区域的多种前体细胞群在时空上的协调作用。在此期间，发育中的心脏持续跳动并发挥功能，凸显了其形成过程中所需的精妙协调性1,2,3。鉴于心脏的重要作用，其正常发育依赖于细胞和分子水平上的严密调控4,5。揭示调控心脏发育的机制一直备受关注，因为这些机制对于阐明影响全球大量患者的先天性心脏病至关重要6。此外，理解心脏发育过程对于解析心脏再生机制也具有关键意义，因为哺乳动物出生后的心脏仍具备一定的再生能力，但在成年后该能力丧失或受到抑制7,8。因此，解析心脏发育的分子调控机制对于推进先天性心脏病和心脏再生的研究至关重要。
为了实现这一目标，人们日益关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用9。心外膜是一层薄薄的间皮组织，构成哺乳动物心脏的最外层（图1）。最近的研....
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方案
所有动物实验均经国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会批准，并符合现行法律法规，包括欧盟指令2010/63/EU和建议书2007/526/EC，以及西班牙皇家法令Real Decreto 53/2013的实施规定。本实验方案采用15至21周龄的雌性野生型CD-1小鼠。有关所用动物、试剂和仪器设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 质粒与工具的准备
- 首先，在冰上配制电穿孔混合液，加入所需质粒 DNA，使其终浓度为 1 µg/µL。然后加入蔗糖至终浓度 6%（溶于 PBS），再加入生物相容性染料至 0.01%，最后用 PBS 补足至终体积 30 µL。
注意：每个样品约使用 1–2 µL 电穿孔混合液。请根据实验中样品的数量按比例调整电穿孔混合液的配制量。请注意，用于电穿孔的 DNA 应从细菌培养物中纯化获得，以确保其最佳稳定性和最低杂质含量。有关本研究中所用质粒的更多细节，请参见代表性结果部分。 - 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% HEPES 缓冲液和 1% 青霉素/链霉素来配制生长培养基。将培养基置于 37 °C 培养箱中保温备用。同时，将 1× PBS 与生长培养基一同预热至 37 °C。
- 使用拉针仪拉制针头：采用直径为 20 µm 的玻璃毛细管，设置参数为：加热 = 550；拉力....
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结果
为了验证该技术在心脏发育相关调控因子的功能获得（GOF）实验中的有效性，通过电穿孔导入了过表达Meis1转录因子的构建体。为此，从E9.5胚胎中提取RNA，并进行逆转录以获得互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，将Meis1编码序列克隆至pCAG表达质粒中（后文简称pCAG::Meis1）（补充表 1），同时使用组成型表达GFP的质粒（pCAG::GFP）作为对照。随后对心脏组织进行电穿孔，分别导入pCAG::GFP单独或与pCAG::Meis1联合的质粒。
电穿孔后24小时（hpe），心脏仍在跳动，且外观状态良好（图4A；补充视频 1；补充视频2）。为评估电穿孔细胞的存活能力，通过caspase 3的免疫组织化学染色分析细胞凋亡情况。尽管在心脏中检测到少量阳性细胞，但电穿孔细胞主要分布的心肌层和心外膜层均未受到凋亡影响（补充图 1
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讨论
总体而言，本文所述方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个可靠的框架（图4B），Meis1过表达的结果已对此进行了验证（图4C）。通过使用适当的构建体，本方案可用于 transient 地评估特定基因的功能获得（GOF）或功能丧失（LOF）效应。LOF效应可通过转染靶向候选基因的RNA干扰质粒来实现26。基因GOF或LOF的快速评估具有显著优势，特别是考虑到心外膜细胞存在较大的转录组异质性12，这使得为逐一评估每个候选基因而构建转基因动物变得不切实际。
由于该方案采用离体（ex vivo）培养，因此可在特定时间窗口内研究心外膜细胞的命运。发育中的心外膜在成年心脏不同区域的形成过程中发挥关键作用13,27,.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由西班牙科学与创新部资助项目 RTI2018-097617-J-I00 支持́n 以及来自安达卢西亚政府的 Acción 9 资助；O.H.O. 获得西班牙科学与创新部项目基金 PGC2018-096486-B-I00 资助́n 以及欧盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2016-722427）向 M.T. 提供的资助。J.M.G. 获得了西班牙科学部和塞韦罗·奥乔亚基金会（PRE2022-101884）提供的博士奖学金。国家心血管研究中心（CNIC）和生物分子与细胞生物学研究中心（CBMSO）均得到西班牙科学部的支持，CNIC 还获得了 ProCNIC 基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #55 镊子 | 杜蒙特 | 11295-51 | |
| 12孔透明平底多孔细胞培养板 | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm 台式虎钳 | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm细胞筛 | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL 离心管 | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm细胞筛 | 康宁 | CLS431751 | |
| 抗GFP多克隆抗体 | Invitrogen | A10262 | 使用1:1000稀释度 |
| 抗肌球蛋白4（MF20）单克隆抗体 | Invitrogen | 14-6503-82 | 使用1:500稀释度 |
| CD1 野生型小鼠 | 由中国实验动物中心（CNIC）提供 | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体 | 细胞信号转导技术 | 9661 | 使用1:400稀释度 |
| DAPI | 细胞信号传导技术 | 4083 | 使用1:1000稀释度 |
| 中性蛋白酶/胶原酶 | 罗氏 | 10269638001 | |
| 蒸馏水 | |||
| DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco | 10313021 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51032720 | |
| Leica 体视显微镜 S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | 罗氏 | 5401119001 | |
| 显微移液器拉制仪 型号 P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG表达质粒 | Addgene | #89689 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15070-063 | |
| 35 毫米培养皿 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| 60 mm 培养皿 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| 酚红 | 默克 | P3532 | |
| 移液器吸头 | 来自旧实验室设备的再利用 | ||
| 大鼠血清培养胚胎，雄性大鼠 SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| 重组抗威尔姆斯肿瘤蛋白1（WT1）抗体 | Abcam | ab89901 | 使用1:300稀释度 |
| 方波电穿孔仪 CUY21SC | Nepa 基因 | CUY664-10X15 | |
| 无菌 PBS | 由技术部门提供并灭菌 | ||
| 蔗糖 | Millipore | 84100 | |
| 可调间隙镊子电极 | Nepa 基因 | CUY650P5 |
参考文献
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. ....
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