本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。
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本文内容
摘要
摘要
哺乳动物的心脏是在发育过程中形成的复杂器官 通过 高度多样化的前体细胞群体。这些前体细胞的来源、招募时间及其命运对器官的正常发育至关重要。调控心脏形态发生的分子机制，对于理解先天性心脏病的发病机制以及胚胎期心脏再生具有重要意义。传统研究这些机制的方法依赖于构建转基因小鼠，以评估特定基因在心脏发育过程中的功能。然而，小鼠转基因技术复杂且耗时，通常难以用于快速评估特定基因在心脏发育中的作用。为解决这一问题，我们建立了一种高效的小鼠胚胎心脏电穿孔与培养方案，可实现瞬时转基因，从而快速评估与心脏发育相关基因的功能获得或功能缺失效应。利用该方法，我们成功在胚胎心脏中过表达了Meis1，且该基因转染更倾向于心外膜细胞，充分展示了该技术的应用潜力。
引言
心脏是胚胎发育过程中最先形成的器官。这一过程涉及来自胚胎不同区域的多种前体细胞群在时空上的协调作用。在此期间，发育中的心脏持续跳动并发挥功能，凸显了其形成过程中所需的精妙协调性1,2,3。鉴于心脏的重要作用，其正常发育依赖于细胞和分子水平上的严密调控4,5。揭示调控心脏发育的机制一直备受关注，因为这些机制对于阐明影响全球大量患者的先天性心脏病至关重要6。此外，理解心脏发育过程对于解析心脏再生机制也具有关键意义，因为哺乳动物出生后的心脏仍具备一定的再生能力，但在成年后该能力丧失或受到抑制7,8。因此，解析心脏发育的分子调控机制对于推进先天性心脏病和心脏再生的研究至关重要。
为了实现这一目标，人们日益关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用9。心外膜是一层薄薄的间皮组织，构成哺乳动物心脏的最外层（图1）。最近的研究表明，心外膜在心脏损伤过程中具有重要作用，能够向受损区域的心肌细胞传递增殖信号，从而减轻损伤10,11。尽管心外膜至关重要，但其高度异质性为深入开展分子研究带来了挑战。单细胞RNA测序实验揭示了心外膜的异质性，其中包含多个具有不同转录组特征的细胞亚群12,13,14,15,16。因此，筛选心脏发育潜在调控因子的策略必须考虑到心外膜前体细胞的多样性。
从这一角度来看，小鼠模型易于进行遗传修饰的特性促进了众多心脏发育关键基因的鉴定，使得研究人员能够构建特定基因获得功能（GOF）或丧失功能（LOF）的突变品系。然而，这些方法需要耗费大量时间和实验资源，因此在评估大量候选基因功能时并不切实际。此外，发育相关基因通常在不同组织中具有多效性功能，或在早期胚胎发育过程中发挥必需作用，这使得解析其在特定发育过程中的具体贡献变得困难。尽管可以针对特定结构或发育时间点进行基因功能调控，但这通常需要使用更为复杂的遗传构建策略，而这类策略往往难以实现或通常无法获得。
为克服这些局限性，我们提出了一种电穿孔小鼠胚胎心脏以实现瞬时转基因的方法图2）。配对使用 离体 培养与荧光激活细胞分选（FACS），该策略通过瞬时过表达Meis1（一个在心脏发育与再生中作用明确的基因）来展示其功能17,18,19本文还探讨了该方法的其他潜在应用，并讨论了其优势与局限性，同时将其与现有的瞬时调控基因表达的实验方案进行了比较。我们相信，本文所呈现的框架和可视化示例将有助于加深对发育及疾病过程中心外膜生物学的理解。
图1：小鼠胚胎心脏各层结构。 E13-14期小鼠胚胎心脏冠状切面示意图。心脏的三个主要细胞层分别用黄色（心内膜）、红色（心肌层）和蓝色（心外膜）表示。心包膜以棕色线条表示。心脏的四个腔室缩写如下：LV，左心室；RV，右心室；LA，左心房；RA，右心房。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：心脏电穿孔实验方案的示意图概述。 请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
所有动物实验均经国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会批准，并符合现行法律法规，包括欧盟指令2010/63/EU和建议书2007/526/EC，以及西班牙皇家法令Real Decreto 53/2013的实施规定。本实验方案采用15至21周龄的雌性野生型CD-1小鼠。有关所用动物、试剂和仪器设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 质粒与工具的准备
- 首先，在冰上配制电穿孔混合液，加入所需质粒 DNA，使其终浓度为 1 µg/µL。然后加入蔗糖至终浓度 6%（溶于 PBS），再加入生物相容性染料至 0.01%，最后用 PBS 补足至终体积 30 µL。
注意：每个样品约使用 1–2 µL 电穿孔混合液。请根据实验中样品的数量按比例调整电穿孔混合液的配制量。请注意，用于电穿孔的 DNA 应从细菌培养物中纯化获得，以确保其最佳稳定性和最低杂质含量。有关本研究中所用质粒的更多细节，请参见代表性结果部分。 - 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% HEPES 缓冲液和 1% 青霉素/链霉素来配制生长培养基。将培养基置于 37 °C 培养箱中保温备用。同时，将 1× PBS 与生长培养基一同预热至 37 °C。
- 使用拉针仪拉制针头：采用直径为 20 µm 的玻璃毛细管，设置参数为：加热 = 550；拉力 = 100；速度 = 250；时间 = 120。拉制后的最终针尖直径应约为 5–8 µm。
- 设置电穿孔仪参数为 40 V、5 次循环，每次持续 50 ms，间隔 900 ms。准备好电极、口吸管和钝头针（图 3A）。将针头安装到口吸管上以加载 DNA（图 3A）。
2. 胚胎解剖与心脏提取
- 建立野生型 CD-1 小鼠的交配组合。次日早晨，挑选出现阴道栓的雌鼠，并将该时间记为胚胎发育第 E0.5 天。按照机构批准的方案，于胚胎发育第 E12–12.5 天通过颈椎脱臼法处死动物。
- 小心取出小鼠子宫并置于干燥的纸巾上。随后使用精细剪刀从子宫系膜侧插入剪刀尖端，沿刀刃缓慢剪开整个子宫长度。暴露蜕膜组织，并将其转移至生长培养基中。更多细节请参见 Behringer 等人的研究20。
- 解剖蜕膜以分离胚胎，然后将胚胎放入盛有温热生长培养基的 60 mm 培养皿中。使用精细镊子小心剪除胚胎的尾部和头部，仅保留躯干部。可通过评估解剖学特征来确认胚胎发育阶段，具体方法如 Wong 等人所述21。
- 接着，在不损伤心脏及肺动脉和主动脉的前提下，小心尽可能多地去除胚胎躯干部分的周围组织。暴露心脏后，立即将其放入新鲜的温热生长培养基中，并在 37 °C 培养箱中保存直至进行电穿孔。
注意：维持心脏温度对其存活至关重要。确保培养基始终温热，并每 5–10 分钟更换一次。另一方面，操作样品时无需保持无菌条件，因为这不会影响实验效率。请注意，生长培养基中含有抗生素。
3. 心脏电穿孔及 离体 培养
- 用口吸管小心吸取约 10 µL 质粒混合物（按步骤 1.1 制备），将其加载至针头中。
- 将单个心脏置于洁净的 60 mm 培养皿中，加入已预热至 37 °C 的无菌 1× PBS，以准备电穿孔。将培养皿置于解剖显微镜下（图 3A）。
- 调节正负电极之间的距离至约 4 mm，以准备电极（图 3B）。
注意：4 mm 是本研究中所用电极适用于 E12.5 小鼠心脏的孔径距离。请根据不同的样本尺寸或电极规格考虑调整该距离。 - 用口吸管的针头轻轻刺入心脏最表层组织，小心注入 1–2 µL 质粒混合物后撤出针头。可进行多次注射，以确保充分渗透并增加电穿孔细胞的数量。
- 固定电极位置，使心脏位于两极之间（图 3C），然后按照上述条件对心脏进行电穿孔。
注意：为确保最大电穿孔效率，可切换电极极性并施加另一次脉冲。 - 将电穿孔后的心脏转移至含有 1 mL 培养基的新 12 孔板中，并置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 重复步骤 3.1 至 3.6，直至实验中所有样本均完成电穿孔。最后，将所有心脏置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 h，或培养至进行分析为止。
注意：据我们经验，心脏在培养中可维持长达 48 h 而无明显退化迹象（补充视频 1；补充视频 2；补充图 1）。
图3：电穿孔装置示意图。（A）用于电穿孔的实验装置。红色箭头分别指示电穿孔仪、电极以及进行心脏电穿孔操作的培养皿。（A'）电穿孔针头的放大细节图，对应于（A）中白色矩形框所示区域。（B）E12.5期心脏所用电极间距的调整细节。（C）电穿孔过程的示意图。请点击此处查看该图的高清版本。
4. 细胞分选和免疫组织化学分析
- 进行样品的细胞分选分析时，配制消化液以解离组织：将 400 µL 的 liberase（5 mg/mL）、300 µL 的 dispase（0.1 g/mL）、4 µL 的 CaCl2（0.4 µM）、50 µL 的 MgCl2（5 µM）混合，并用 DMEM 定容至 10 mL。使用前置于冰上保存。每颗心脏约需 1 mL 消化液。根据样本数量调整体积。
注意：如用于免疫组织化学，可将心脏直接置于 1.5 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）中，在室温下固定 2 小时，或在 4 °C 下过夜。次日，用 PBS 洗涤心脏 3 次，随后进行后续组织学和免疫染色操作。详细的免疫组织化学方案请参考 Morris 等人22。 - 将每颗培养的心脏转移至含有 1 mL 冰冷消化液的新离心管中。
- 为促进组织解离，用移液器轻轻吹打组织 3–4 次，随后立即在 37 °C、600 rpm 条件下的加热板上孵育 45 分钟。
- 将消化后的混合液通过 70 µm 细胞滤网过滤至新离心管中，依靠重力自然滤尽。收集滤过液后，再用 40 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。
- 加入 500 µL 胎牛血清（FBS），并用冷 DMEM 定容至 30 mL。
- 在室温下以 240 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液，将 50 mL 离心管倒置于纸巾上，使其完全干燥。
注意：此时可暂停实验，将细胞沉淀冷冻保存。若需冷冻，用含 10% DMSO 的 FBS 重悬细胞，并于 -80 °C 保存。 - 进行细胞分选时，将细胞重悬于 300 µL 分选缓冲液（含 1% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 PBS）中，并加入 0.3 µL DAPI（1000 倍稀释）。随后进行细胞分选。
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结果
为了验证该技术在心脏发育相关调控因子的功能获得（GOF）实验中的有效性，通过电穿孔导入了过表达Meis1转录因子的构建体。为此，从E9.5胚胎中提取RNA，并进行逆转录以获得互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，将Meis1编码序列克隆至pCAG表达质粒中（后文简称pCAG::Meis1）（补充表 1），同时使用组成型表达GFP的质粒（pCAG::GFP）作为对照。随后对心脏组织进行电穿孔，分别导入pCAG::GFP单独或与pCAG::Meis1联合的质粒。
电穿孔后24小时（hpe），心脏仍在跳动，且外观状态良好（图4A；补充视频 1；补充视频2）。为评估电穿孔细胞的存活能力，通过caspase 3的免疫组织化学染色分析细胞凋亡情况。尽管在心脏中检测到少量阳性细胞，但电穿孔细胞主要分布的心肌层和心外膜层均未受到凋亡影响（补充图 1
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讨论
总体而言，本文所述方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个可靠的框架（图4B），Meis1过表达的结果已对此进行了验证（图4C）。通过使用适当的构建体，本方案可用于 transient 地评估特定基因的功能获得（GOF）或功能丧失（LOF）效应。LOF效应可通过转染靶向候选基因的RNA干扰质粒来实现26。基因GOF或LOF的快速评估具有显著优势，特别是考虑到心外膜细胞存在较大的转录组异质性12，这使得为逐一评估每个候选基因而构建转基因动物变得不切实际。
由于该方案采用离体（ex vivo）培养，因此可在特定时间窗口内研究心外膜细胞的命运。发育中的心外膜在成年心脏不同区域的形成过程中发挥关键作用13,27,...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由西班牙科学与创新部资助项目 RTI2018-097617-J-I00 支持́n 以及来自安达卢西亚政府的 Acción 9 资助；O.H.O. 获得西班牙科学与创新部项目基金 PGC2018-096486-B-I00 资助́n 以及欧盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2016-722427）向 M.T. 提供的资助。J.M.G. 获得了西班牙科学部和塞韦罗·奥乔亚基金会（PRE2022-101884）提供的博士奖学金。国家心血管研究中心（CNIC）和生物分子与细胞生物学研究中心（CBMSO）均得到西班牙科学部的支持，CNIC 还获得了 ProCNIC 基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #55 镊子 | 杜蒙特 | 11295-51 | |
| 12孔透明平底多孔细胞培养板 | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm 台式虎钳 | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm细胞筛 | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL 离心管 | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm细胞筛 | 康宁 | CLS431751 | |
| 抗GFP多克隆抗体 | Invitrogen | A10262 | 使用1:1000稀释度 |
| 抗肌球蛋白4（MF20）单克隆抗体 | Invitrogen | 14-6503-82 | 使用1:500稀释度 |
| CD1 野生型小鼠 | 由中国实验动物中心（CNIC）提供 | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体 | 细胞信号转导技术 | 9661 | 使用1:400稀释度 |
| DAPI | 细胞信号传导技术 | 4083 | 使用1:1000稀释度 |
| 中性蛋白酶/胶原酶 | 罗氏 | 10269638001 | |
| 蒸馏水 | |||
| DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco | 10313021 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51032720 | |
| Leica 体视显微镜 S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | 罗氏 | 5401119001 | |
| 显微移液器拉制仪 型号 P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG表达质粒 | Addgene | #89689 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15070-063 | |
| 35 毫米培养皿 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| 60 mm 培养皿 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| 酚红 | 默克 | P3532 | |
| 移液器吸头 | 来自旧实验室设备的再利用 | ||
| 大鼠血清培养胚胎，雄性大鼠 SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| 重组抗威尔姆斯肿瘤蛋白1（WT1）抗体 | Abcam | ab89901 | 使用1:300稀释度 |
| 方波电穿孔仪 CUY21SC | Nepa 基因 | CUY664-10X15 | |
| 无菌 PBS | 由技术部门提供并灭菌 | ||
| 蔗糖 | Millipore | 84100 | |
| 可调间隙镊子电极 | Nepa 基因 | CUY650P5 |
参考文献
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