一种高效转基因方法用于小鼠胚胎心脏的基因递送

摘要

本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。

摘要

哺乳动物的心脏是在发育过程中形成的复杂器官 通过 高度多样化的前体细胞群体。这些前体细胞的来源、招募时间及其命运对器官的正常发育至关重要。调控心脏形态发生的分子机制，对于理解先天性心脏病的发病机制以及胚胎期心脏再生具有重要意义。传统研究这些机制的方法依赖于构建转基因小鼠，以评估特定基因在心脏发育过程中的功能。然而，小鼠转基因技术复杂且耗时，通常难以用于快速评估特定基因在心脏发育中的作用。为解决这一问题，我们建立了一种高效的小鼠胚胎心脏电穿孔与培养方案，可实现瞬时转基因，从而快速评估与心脏发育相关基因的功能获得或功能缺失效应。利用该方法，我们成功在胚胎心脏中过表达了Meis1，且该基因转染更倾向于心外膜细胞，充分展示了该技术的应用潜力。

引言

心脏是胚胎发育过程中最先形成的器官。这一过程涉及来自胚胎不同区域的多种前体细胞群体在时空上的协调作用。在此期间，发育中的心脏持续跳动并发挥功能，凸显了其形成过程中所需的惊人协调性^1,2,3。鉴于心脏的重要作用，其正常发育依赖于细胞和分子水平上的严密调控^4,5。揭示调控心脏发育的机制一直备受关注，因为这些机制对于阐明影响全球大量患者的先天性心脏病至关重要⁶。此外，理解心脏发育过程对于解析心脏再生机制也具有关键意义，因为哺乳动物出生后的心脏仍具备一定的再生能力，但在成年后该能力丧失或受到抑制^7,8。因此，解析心脏发育的分子调控机制对于推进先天性心脏病和心脏再生研究至关重要。

为了实现这一目标，人们日益关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用⁹。心外膜是一层薄薄的间皮组织，构成哺乳动物心脏的最外层（图1）。近期研究表明，心外膜在心脏损伤过程中具有重要作用，能够向受损区域的心肌细胞传递增殖信号，从而减轻损伤^10,11。尽管心外膜至关重要，但其高度异质性为深入开展分子研究带来了挑战。单细胞RNA测序实验揭示了心外膜的异质性，表明其中包含多个具有不同转录组特征的细胞亚群^{12,13,14,15,16}。因此，筛选心脏发育潜在调控因子的策略必须考虑到心外膜前体细胞的多样性。

从这一角度来看，小鼠模型易于进行遗传修饰的特性促进了众多心脏发育关键基因的鉴定，使得研究人员能够构建特定基因获得功能（GOF）或丧失功能（LOF）的突变品系。然而，这些方法需要投入大量时间和实验资源，因此在评估大量候选基因功能时并不切实际。此外，发育相关基因常在不同组织中发挥多效性功能，或在早期胚胎发育过程中具有必需作用，这会阻碍对其在特定发育过程中所起作用的准确解析。尽管有可能在特定结构或发育时间点靶向调控基因功能，但这通常需要使用更为复杂的遗传构建策略，而这类策略往往难以实现或通常无法获得。

为克服这些局限性，我们提出了一种电穿孔小鼠胚胎心脏以实现瞬时转基因的方法（图2）。配以 离体 培养与荧光激活细胞分选（FACS），该策略通过瞬时过表达Meis1（一个在心脏发育与再生中已有明确研究的基因）来展示其功能。^17,18,19本文还探讨了该方法的其他潜在应用，并讨论了其优势与局限性，同时将其与现有的瞬时调控基因表达的实验方案进行了比较。我们相信，本文所呈现的框架和可视化示例将有助于加深对发育及疾病过程中心外膜生物学的理解。

图1：小鼠胚胎心脏的层次结构。 E13-14期小鼠胚胎心脏冠状面的示意图。心脏的三个主要细胞层分别用黄色（心内膜）、红色（心肌层）和蓝色（心外膜）表示。心包膜以棕色线条表示。心脏的四个腔室缩写如下：LV，左心室；RV，右心室；LA，左心房；RA，右心房。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：心脏电转染实验方案的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有动物实验均经 CNIC 动物实验伦理委员会批准，并符合现行法律法规，包括欧盟指令 2010/63/EU 和建议书 2007/526/EC，依据西班牙皇家法令 Real Decreto 53/2013 执行。本实验方案采用 15–21 周龄的雌性野生型 CD-1 小鼠。所用动物、试剂和设备的详细信息列于 材料表.

1. 质粒与工具的准备

1. 首先，在冰上配制电穿孔混合液，加入所需质粒 DNA，使其终浓度为 1 µg/µL。然后加入蔗糖至终浓度 6%（溶于 PBS），再加入生物相容性染料至 0.01%，最后用 PBS 补足至终体积 30 µL。
   注意：每个样品约使用 1–2 µL 电穿孔混合液。请根据实验中样品的数量按比例调整电穿孔混合液的配制量。请注意，用于电穿孔的 DNA 应从细菌培养物中纯化获得，以确保其最佳稳定性和最低杂质含量。有关本研究中所用质粒的更多细节，请参见代表性结果部分。
2. 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% HEPES 缓冲液和 1% 青霉素/链霉素来配制生长培养基。将培养基置于 37 °C 培养箱中保温备用。同时，将 1× PBS 与生长培养基一同在 37 °C 预热。
3. 使用拉针仪拉制直径为 20 µm 的玻璃毛细管以制备针头，设置参数如下：加热温度 = 550；拉力 = 100；速度 = 250；时间 = 120。拉制后的最终针尖直径应约为 5–8 µm。
4. 设置电穿孔仪参数为 40 V、50 ms 脉冲，共 5 个循环，脉冲间隔 900 ms。准备好电极、口吸管和钝头针（图 3A）。将针头安装到口吸管上以加载 DNA（图 3A）。

2. 胚胎解剖与心脏提取

1. 建立野生型 CD-1 小鼠的交配组合。次日早晨，挑选出现阴道栓的雌鼠，并将该时间记为胚胎发育第 E0.5 天。按照机构批准的方案，于胚胎发育第 E12–12.5 天通过颈椎脱位法处死动物。
2. 小心取出小鼠子宫并置于干燥的纸巾上。随后使用精细剪刀从子宫系膜侧插入剪刀尖端，沿刀刃缓慢剪开整个子宫长度。暴露蜕膜组织，并将其转移至生长培养基中。更多细节请参见 Behringer 等人的研究²⁰。
3. 解剖蜕膜以分离胚胎，然后将胚胎放入盛有温热生长培养基的 60 mm 培养皿中。使用精细镊子小心剪除胚胎的尾部和头部，仅保留躯干部。可通过评估解剖学特征来确认胚胎发育阶段，具体方法详见 Wong 等人所述²¹。
4. 接着，在不损伤心脏及肺动脉和主动脉的前提下，小心尽可能多地去除胚胎躯干部分的周围组织。暴露心脏后，立即将其放入新鲜的温热生长培养基中，并在 37 °C 培养箱中保存直至进行电穿孔。
   注意：维持心脏温度对其存活至关重要。确保培养基始终温热，并每 5–10 分钟更换一次。另一方面，操作过程中无需保持无菌条件，因为这不会影响实验效率。请注意，生长培养基中含有抗生素。

3. 心脏电穿孔及 离体 培养

1. 用口吸管小心吸取约 10 µL 质粒混合物（按步骤 1.1 制备），将其加载至针头中。
2. 将单个心脏置于洁净的 60 mm 培养皿中，加入已预热至 37 °C 的无菌 1× PBS，以准备电穿孔实验。将培养皿置于解剖显微镜下（图 3A）。
3. 调节正负电极之间的距离至约 4 mm，以准备电极（图 3B）。
   注意：4 mm 是本研究中所用电极适用于 E12.5 小鼠心脏的孔径距离。请根据不同的样本尺寸或电极规格考虑调整该距离。
4. 用口吸管的针头轻轻刺入心脏最表层组织，小心注入 1–2 µL 质粒混合物后撤出针头。可进行多次注射，以确保最佳渗透效果，并增加电穿孔细胞的数量。
5. 固定电极位置，使心脏位于两极之间（图 3C），然后按照上述条件对心脏进行电穿孔。
   注意：为确保最高的电穿孔效率，可切换电极极性并施加第二次脉冲。
6. 将电穿孔后的心脏转移至含有 1 mL 培养基的新 12 孔板中，并置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
7. 重复步骤 3.1 至 3.6，直至实验中所有样本均完成电穿孔。最后，将所有心脏置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 24 h，或孵育至进行分析为止。
   注意：据我们经验，心脏在培养中可维持长达 48 h 而无明显退化迹象（补充视频 1；补充视频 2；补充图 1）。

图 3：电穿孔装置示意图。（A）用于电穿孔的装置。红色箭头分别指示电穿孔仪、电极和进行心脏电穿孔的培养皿。（A'）电穿孔针头的放大细节，对应于（A）中白色矩形框所示区域。（B）E12.5 胚胎心脏所用电极间距的调整细节。（C）电穿孔过程的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 细胞分选与免疫组织化学分析

1. 进行样品的细胞分选分析时，配制消化液以解离组织：将400 µL的liberase（5 mg/mL）、300 µL的dispase（0.1 g/mL）、4 µL的CaCl₂（0.4 µM）、50 µL的MgCl₂（5 µM）混合，并用DMEM补至10 mL。使用前置于冰上保存。每颗心脏约需1 mL消化液。根据样品数量调整体积。
   注意：如需进行免疫组织化学分析，可将心脏直接置于1.5 mL的4%多聚甲醛（PFA）中，在室温下固定2小时，或在4 °C下过夜。次日，用PBS洗涤心脏3次，随后进行后续组织学和免疫染色操作。详细的免疫组织化学方案请参考Morris等人的研究²²。
2. 将每颗培养的心脏转移至含有1 mL冰冻消化液的新离心管中。
3. 为促进组织解离，用移液器轻柔吹打组织3–4次，随后立即在37 °C、600 rpm条件下于加热板上孵育45分钟。
4. 将消化后的混合液通过70 µm细胞滤网过滤至新的离心管中，依靠重力自然滤尽。收集滤过液，并再次通过40 µm细胞滤网过滤至新的50 mL离心管中。
5. 加入500 µL胎牛血清（FBS），并用冷DMEM补至30 mL。
6. 在室温下以240 × g 离心10分钟。
7. 弃去上清液，将50 mL离心管倒置在纸巾上，使其完全干燥。
   注意：此时可暂停实验，将细胞沉淀冷冻保存。若需冷冻，用含10% DMSO的FBS重悬细胞，并于-80 °C保存。
8. 进行细胞分选时，将细胞重悬于300 µL分选缓冲液（含1% FBS、1%青霉素/链霉素的PBS）中，并加入0.3 µL DAPI（1000倍稀释）。随后进行细胞分选。

结果

为了验证该技术在心脏发育相关调控因子的功能获得（GOF）实验中的有效性，通过电穿孔导入了过表达Meis1转录因子的构建体。为此，从E9.5胚胎中提取RNA，并进行逆转录以获得互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，将Meis1编码序列克隆至pCAG表达质粒中（见补充表 1，以下简称pCAG::Meis1）；同时使用组成型表达GFP的质粒（pCAG::GFP）作为对照。随后，将心脏组织分别电穿孔导入仅含pCAG::GFP的质粒，或pCAG::GFP与pCAG::Meis1的组合质粒。

电穿孔后24小时（hpe），心脏仍在跳动，且外观状态良好（图4A；补充视频 1；补充视频2）。为评估电穿孔细胞的存活能力，通过caspase 3的免疫组织化学染色分析细胞凋亡情况。尽管在心脏中检测到少量阳性细胞，但电穿孔细胞主要分布的心肌层和心外膜层均未受到凋亡影响（补充图 1C）。在检测荧光活性时，几乎在心脏全部四个腔室中均观察到嵌合型GFP信号，表明该方案能够有效转染心脏的大多数结构（图4A）。为确定哪些心脏细胞类型被成功电穿孔，对pCAG::GFP电穿孔后的心脏组织进行免疫染色，分别使用心外膜标志物WT1²和心肌层标志物MF20²³进行标记，并利用共聚焦显微镜成像（图4B）。大多数GFP阳性细胞优先分布于心脏的外层区域，该区域与WT1信号高度重合，表明该方法在靶向心外膜细胞方面效率最高（图4B，白色箭头）。

另一方面，将pCAG::Meis1电穿孔或对照（仅pCAG::GFP）的心脏进行解离，并对细胞进行荧光激活细胞分选（FACS），以从整个器官中分离出GFP+细胞，具体步骤如方案第4步所述。从分选后的细胞中提取RNA，并进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）以检测转染细胞中Meis1的表达水平（图4C，补充表 1）。总Meis1基因表达水平使用小鼠看家基因Eef2²⁴的表达水平进行标准化，并采用ΔΔCt法²⁵计算相对基因表达量。与仅转染pCAG::GFP质粒的心脏相比，转染pCAG::Meis1质粒的心脏中Meis1的RNA水平显著上调（图4C）。因此，该结果证明了该技术在过表达目的基因并研究其分子效应方面的潜力。

图4：电穿孔E12.5心脏的分子分析。（A）CAG::GFP电穿孔心脏在电穿孔后24小时的GFP荧光图像。下方图像显示GFP荧光，上方图像为同一心脏的GFP荧光与明场图像的叠加。（B）E12.5电穿孔心脏组织切片的免疫荧光染色。MF20标记心肌细胞，WT1标记心外膜细胞。右侧图像为白色方框区域的放大图。白色箭头指示位于心外膜内的GFP+细胞，该区域大致由白色虚线界定。（C）对电穿孔pCAG::Meis1或pCAG::GFP（对照）的心脏进行RT-qPCR分析。每个点代表由三个心脏合并获得的一个生物学重复样本。总共进行了三次技术重复，包含三个独立的生物学重复。统计分析采用学生t检验（*P < 0.05）。比例尺：200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：心脏电穿孔效率与细胞活力。（A）在电穿孔后24小时或48小时（hpe），两个独立的E12.5胚胎心脏在转染对照质粒pCAG::GFP后GFP的表达情况。GFP信号图像与同一心脏的明场图像叠加显示。（B）在转染对照质粒pCAG::GFP后24 hpe和48 hpe心脏中GFP阳性细胞的定量分析。每个点代表一个独立样本；实线表示均值，误差线表示标准差。两种条件之间未观察到显著差异（非参数t检验；P > 0.9）。（C）E12.5胚胎心脏在电穿孔pCAG::GFP后，经cleaved caspase 3和MF20免疫染色的共聚焦图像。虚线表示心脏的心肌层。右侧图像为白色方框区域的放大图。比例尺：100 µm。请点击此处下载该文件。

补充表1：引物序列汇总。 请点击此处下载该文件。

补充视频 1：转染 pCAG::GFP 后 24 小时的心脏。 该视频记录了一颗在操作后 24 小时用 pCAG::GFP 对照质粒进行电穿孔的心脏。心脏持续跳动，且电穿孔的细胞表达 GFP 信号。 请点击此处下载该视频。

补充视频 2：转染 pCAG::GFP 后 48 小时的心脏。 该视频展示了一颗经电转染 pCAG::GFP 对照质粒后 48 小时的心脏。 请点击此处下载该视频。

讨论

总体而言，本文所述方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个可靠的框架（图4B），Meis1过表达的结果已对此进行了验证（图4C）。通过使用适当的构建体，本方案可用于 transient 地评估特定基因的功能获得（GOF）或功能丧失（LOF）效应。LOF效应可通过转染靶向候选基因的RNA干扰质粒来实现²⁶。基因GOF或LOF的快速评估具有显著优势，特别是考虑到心外膜细胞存在较大的转录组异质性¹²，这使得为逐一评估每个候选基因而构建转基因动物变得不切实际。

由于该方案采用离体（ex vivo）培养，因此可在特定时间窗口内研究心外膜细胞的命运。发育中的心外膜在成年心脏不同区域的形成过程中发挥关键作用^13,27,28；因此，了解其对心脏发育的贡献对于解析先天性心脏畸形的基础机制具有重要意义。尽管本文未深入探讨这一应用，但本方案中概述的指导原则可能对未来的心外膜命运图谱研究具有参考价值

尽管当前方法具有实际应用价值，但仍需承认其存在某些局限性。由于该方法依赖于瞬时转基因技术，质粒表达可能随着时间推移而丢失或减弱，从而限制了本方案用于研究特定发育阶段的时间范围²⁹然而，在本研究中，GFP的过表达在整个电穿孔后培养期间（48 hpe）均得以维持。此外，当前研究可能存在的一些局限性 离体 培养技术限制了该方法在评估晚期胚胎或出生后发育阶段中的适用性，尤其是在以下情况中 离体 电穿孔后的培养变得困难³⁰. 尽管存在更为复杂的方法 离体 胚胎培养存在^31,32它们可能需要使用研究人员较难获得的设备，且无法保证样本的存活。

尽管本实验方案的设计力求尽可能简单以提高可重复性，但仍包含若干对成功至关重要的关键步骤。首先，胚胎解剖必须谨慎且迅速地进行，以尽量减少对心脏的损伤，否则可能影响电穿孔后器官的存活。强烈建议在此步骤中格外小心，并使用最佳的解剖器械。本方案的另一个关键环节是电穿孔操作本身，因为质粒注射不足可能导致不良结果。因此，建议在单个心脏上进行多次注射，且以相对表浅的方式注射可能有助于提高器官存活率。最后，在心脏处理过程中的细胞解离必须严格按方案规定的时间进行，以最大限度地提高细胞活力。

综上所述，鉴定心脏形成过程中的关键基因对于理解先天性心脏病的潜在机制及心脏再生具有重要意义。本文建立的方法可实现对发育中心脏的基因功能获得（GOF）和功能缺失（LOF）效应的快速筛选。尽管存在某些局限性，该方法仍具有较大的拓展潜力，可用于不同发育阶段的研究，或用于追踪胚胎期心外膜细胞的命运。通过本文提供的可视化操作指南，我们旨在为评估发育中心外膜的复杂性与潜能提供一套有价值的工具箱。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#55 镊子	杜蒙特	11295-51
12孔透明平底多孔细胞培养板	BD Falcon	353043
35 mm 台式虎钳	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm细胞筛	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL 离心管	BD Falcon	352070
70 µm细胞筛	康宁	CLS431751
抗GFP多克隆抗体	Invitrogen	A10262	使用1:1000稀释度
抗肌球蛋白4（MF20）单克隆抗体	Invitrogen	14-6503-82	使用1:500稀释度
CD1 野生型小鼠			由中国实验动物中心（CNIC）提供
Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体	细胞信号转导技术	9661	使用1:400稀释度
DAPI	细胞信号传导技术	4083	使用1:1000稀释度
中性蛋白酶/胶原酶	罗氏	10269638001
蒸馏水
DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基	Gibco	10313021
胎牛血清	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	51032720
Leica 体视显微镜 S8AP0	Leica	11524102
Liberase	罗氏	5401119001
显微移液器拉制仪 型号 P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG表达质粒	Addgene	#89689
青霉素-链霉素	Invitrogen	15070-063
35 毫米培养皿 × 10 mm	BD Falcon	351008
60 mm 培养皿 × 15 mm	BD Falcon	353002
酚红	默克	P3532
移液器吸头			来自旧实验室设备的再利用
大鼠血清培养胚胎，雄性大鼠 SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
重组抗威尔姆斯肿瘤蛋白1（WT1）抗体	Abcam	ab89901	使用1:300稀释度
方波电穿孔仪 CUY21SC	Nepa 基因	CUY664-10X15
无菌 PBS			由技术部门提供并灭菌
蔗糖	Millipore	84100
可调间隙镊子电极	Nepa 基因	CUY650P5