利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

摘要

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。

摘要

狂犬病是一种由狂犬病病毒属（Lyssavirus）的狂犬病病毒（RABV）及其他相关的负链RNA病毒（弹状病毒科 Rhabdoviridae）引起的致命性人畜共患病。LN34检测针对狂犬病病毒基因组中高度保守的 leader 区域和核蛋白基因，采用简并引物和含有锁核酸的TaqMan探针，以实现对整个Lyssavirus属病毒RNA的广谱检测。只有在对脑干的完整横切面以及小脑的三个叶进行检查后，方可做出狂犬病阴性判断；然而，任何组织中检测到狂犬病病毒属RNA即可确诊为狂犬病感染。组织样本采集后在TRIzol试剂中进行匀浆处理，该试剂同时可灭活病毒。RNA提取采用基于离心柱的商用提取试剂盒完成。在洁净环境中配制预混液，并分装至96孔板中，随后加入样本RNA。在临床检测中，每个样本需通过实时逆转录PCR（real-time RT-PCR）进行三重平行检测以确定是否存在狂犬病病毒属RNA，同时单次检测宿主β-actin mRNA。在提取和实时RT-PCR步骤中均需包含阳性和阴性对照。数据分析需手动调整阈值，以标准化不同仪器运行间的Ct值。阳性结果的判定标准为广谱狂犬病病毒属检测中出现典型的扩增曲线（Ct ≤ 35）；阴性结果的判定标准为广谱狂犬病病毒属检测中无典型扩增（Ct > 35），且宿主β-actin mRNA被成功检出（Ct ≤ 33）。若Ct值超出上述范围，或检测对照出现异常，则该次实验运行无效，或导致样本结果无法判读。必须严格遵循本实验方案，以确保检测具有高灵敏度和特异性。任何操作步骤的修改均可能影响检测性能，导致假阳性、假阴性或无法解释的结果。

引言

本方案描述了从样本采集到结果解读，使用LN34泛型狂犬病毒实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法进行狂犬病诊断检测的完整流程。该流程分为三个部分：与LN34检测相关的脑组织样本采集（第1部分）、使用Direct-zol RNA Miniprep试剂盒（Zymo Research R2051）进行的手动柱式RNA提取（第2部分），以及使用AgPath-ID One-Step RT-PCR试剂盒（ThermoFisher Scientific AM1005）建立LN34实时RT-PCR检测体系（第3部分）。RNA提取和RT-PCR步骤可使用其他产品完成，但所用试剂盒在使用前必须经过验证，以确保狂犬病毒RNA能够被有效提取并正确扩增。

第1节描述了用于LN34实时RT-PCR检测的合适脑组织的采集。不包括动物尸检、断头及脑组织取出的操作说明。样本可能含有传染性病原体。应遵循《微生物和生物医学实验室生物安全手册》第6版¹中详述的生物安全程序，以降低风险。在完成灭活之前，应将样本视为具有传染性。病毒灭活及检测方法验证应在各实验室根据本机构的标准进行。实验室在实施新的诊断检测时，应遵循本机构规定的标准安全与质量操作规程。

根据已知的狂犬病病毒感染传播机制，脑干和小脑是进行狂犬病诊断的最佳组织，世界卫生组织和世界动物卫生组织均推荐将这些组织用于狂犬病检测^2,3,4,5。由于病毒扩散可能是单侧性的（图1），尤其是在较大的动物中，因此应检查脑干的完整横切面以及小脑的三个叶，以排除狂犬病。对于未达到上述最低标准的样本，实验室可能因样本不足而拒收，或选择出于监测或确诊目的进行检测。如果未收到所需组织，但实验室仍决定检测该样本，则阴性结果应被视为对该动物无法得出明确结论，因为其他组织中病毒RNA的存在可能延迟出现、丰度较低、间歇性存在或根本不存在。在此情况下，需要采集符合要求的样本或进行额外检测，才能排除狂犬病。然而，在任何组织中检测到丽沙病毒RNA均为狂犬病感染的确诊依据^3,6。可用于狂犬病病毒RNA检测以支持确诊或监测（但不能用于排除诊断）的样本示例包括大脑皮层、海马体、脊髓、降解样本、皮肤、唾液和角膜。每个样本送达实验室后，应对其状态进行定性评估。冷藏可使样本保持至少72小时，但不应长期使用。反复冻融可能降低检测灵敏度，应避免超过五次冻融循环。如果组织状况导致无法准确识别脑部结构，则应判定该样本为不合格。对于不合格标本，仍可进行检测以支持确诊（但不能用于排除诊断）。阳性结果应如实报告；而不合格组织上的阴性或不确定结果应报告为“不确定”，以防止被误读为阴性诊断。

本方案基于已发表的实验流程^7,8,9 改进而来，包含针对狂犬病病毒属基因组 leader 区域和核蛋白编码序列的更新引物。探针靶向一段短而高度保守的序列，并采用锁核酸（locked nucleotides）以实现广谱检测。该检测方法可在不同浓度下检测多种狂犬病病毒属的 RNA⁸。本方案展示了进行 LN34 实时 PCR 检测的实验室操作步骤，但对狂犬病病毒属 RNA 的准确且灵敏的检测还依赖于其他未在本方案中详述的要素，例如样本储存、记录管理、人员培训与能力评估、结果追踪、结果解读、质量保证、实验室安全措施以及问题排查。由于 PCR 检测具有高灵敏度，易发生交叉污染。通过遵循良好的实验室规范可避免交叉污染，例如频繁更换手套、一次只处理一个样本、在样本之间使用有效的去污剂对工作台面进行消毒，以及保持管盖封闭并将样本与 PCR 试剂分开。通过采用单向工作流程并分离扩增前与扩增后操作区域，可有效分离 PCR 试剂与样本。例如，应在与样本处理区域物理分离的位置配制 PCR 主混合液。应频繁更换手套，以避免样本、碎屑或阳性对照 RNA 污染 PCR 试剂。在加入主混合液后，应将 PCR 板或管转移至另一个独立区域，用于添加样本和对照 RNA。重要的是，不得在样本或主混合液制备区域操作 PCR 产物。

进行诊断检测时，动手实践和经验积累无可替代。所有新员工均应接受培训，检测人员应至少每年接受一次能力评估，评估需遵循相关实验室主任的要求。任何关于异常结果或检测失败的观察均应立即记录、调查并纠正。每一批新到的试剂都应使用已知Ct值的样本（如阳性对照或存档样本）进行验证。所有设备均应按照制造商建议进行常规维护，并在任何维护或维修后验证检测性能。应监测相关设备的温度，确保冰箱和冷冻柜的温度保持在诊断检测所用试剂可接受的温度范围之内。

操作步骤的修改可能影响检测性能，并可能导致假阳性、假阴性或无法解读的结果。应严格遵循本建议，以确保检测具有高灵敏度和特异性。实验室若希望对本方案进行修改，应在修改前与美国疾病控制与预防中心（CDC）协商，并对修改后的方法进行验证和确认。

方案

尸体脑组织样本通过痘病毒和狂犬病部门（美国佐治亚州亚特兰大市疾病控制与预防中心；CDC）的常规监测或诊断活动获得。

1. 采用LN34泛丽沙病毒实时RT-PCR检测法对动物进行死后狂犬病诊断时的脑组织采集

注意：样本可能含有传染性病原体。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）（厚橡胶手套或其他防割手套、实验服、防水围裙、外科口罩、靴子、防护袖套和面罩），并遵守样本使用、储存和处置的相关安全规定。所有在接触、检测、制备或对丽沙病毒属病毒或已知及可能感染的标本开展研究活动之前人员，均须完成暴露前狂犬病疫苗接种，并定期进行血清学检测，必要时接受加强免疫^2,3,4,6,10。

1. 为每个样本标记一个样本采集管，并贴上 accession 标签。向每个样本采集管中加入 1 mL TRIzol 试剂或其他匀浆缓冲液，以及适量 MagNA Lyser 珠（下文简称"陶瓷珠"）。添加陶瓷珠时，需小心地将珠子从原管倒入样本采集管中。每管陶瓷珠通常可满足 2–5 个样本的使用需求，每个样本至少需使用 20 颗直径为 1.4 mm 的陶瓷珠。
   警告：TRIzol 试剂（下文简称"匀浆缓冲液"）为危险化学品，与酸或漂白剂接触会释放有毒气体；操作时应确保通风良好；更多信息请参阅安全数据表。若使用者以其他匀浆缓冲液替代 TRIzol 试剂或 TRI 试剂，则需进行额外验证。在本方案中，TRIzol 兼具样本匀浆/裂解缓冲液、丽沙病毒灭活缓冲液及 RNA 稳定缓冲液的功能。若使用其他匀浆缓冲液，需通过受控的平行对照实验验证其提取效率、灭活效果及 RNA 稳定性。
2. 使用季铵盐类化合物（QAC）消毒剂对工作台面清洁并消毒 2 分钟，并铺设带塑料衬里的吸水垫。仅将首个样本所需的试剂和耗材放入 II 级生物安全柜（BSC）中，且该安全柜应具备将有害气体排至室外的功能。
   注意：请参照制造商说明，了解稀释后 QAC 的储存时限 。确保带塑料衬里的垫子不会阻塞生物安全柜的气流。若气流受阻，则不应使用垫子。
3. 使用洁净的一次性手术刀采集包含脑干和小脑完整横截面的组织。
   注意：组织操作过程中应避免产生气溶胶或空气传播颗粒。虽然无需强制使用通风橱或生物安全柜，但建议使用带排气功能的生物安全柜，因其可额外防护气味、烟雾、体外寄生虫及骨碎片。
   警告：使用可能感染丽沙病毒的材料时操作手术刀具有危险性，使用者应采取适当的安全防护措施。建议使用一次性镊子。
   1. 对于小型动物（如蝙蝠），可采集整个脑干和小脑。
   2. 对于大型动物，应采集脑干的完整横截面以及小脑三个叶的代表性组织。
   3. 可选：若需进行直接荧光抗体（DFA）检测，此时应制备脑组织压片。DFA 检测后剩余的组织可用于 RNA 提取及 LN34 检测。
      注意：若样本中已加入 TRIzol，则不能再用于基于抗原的检测方法或病毒分离。
4. 准备样本以进行匀浆和 RNA 提取。
   注意：组织用量过多可能影响 RNA 提取效率和病毒灭活效果。组织体积不应超过所用匀浆缓冲液体积的约 1/10。若使用更多组织，应相应增加匀浆缓冲液的体积，以确保 RNA 提取的有效性和成功率。
   1. 对于小型动物，将所需全部组织放入含有匀浆缓冲液和珠子的采集管中进行提取。每 1 mL 匀浆缓冲液中样本质量不得超过 100 mg；对于较大样本，应增加匀浆缓冲液体积或使用多个采集管，以维持样本与缓冲液 1:10 的比例。
   2. 对于大型动物，应先将组织充分剪碎并匀浆，再取代表性部分转移至预装有匀浆缓冲液和珠子的采集管中。每 1 mL 匀浆缓冲液中样本质量不得超过 100 mg；对于较大样本，应增加匀浆缓冲液体积或使用多个采集管，以维持样本与缓冲液 1:10 的比例。
      1. 方案一（珠磨仪）：使用珠磨仪、1 mL 缓冲液和陶瓷珠对组织进行匀浆。可能需要使用多个 2 mL 或更大体积的采集管。
      2. 方案一（珠磨仪）：使用 QAC 消毒剂（1:256）对工作站、设备及样本管外壁进行清洁和消毒，静置 2 分钟。
      3. 方案一（珠磨仪）：在生物安全柜内，将匀浆后的样本装入离心机转子。在台式微量离心机中以 10,000–16,000 × g 离心 2 分钟。在生物安全柜内取出转子。
      4. 方案一（珠磨仪）：静置 2 分钟。
      5. 方案一（珠磨仪）：将 120 µL 匀浆液转移至预装有 1 mL 匀浆缓冲液的采集管中。
         警告：匀浆过程可能产生气溶胶，应在生物安全柜内操作。
      6. 方案二（手术刀）：使用一次性手术刀将所需组织充分剪碎，用拭子涂抹并转移至预装有匀浆缓冲液和珠子的采集管中。每 1 mL 匀浆缓冲液中样本质量不得超过 100 mg；对于较大样本，应增加匀浆缓冲液体积或使用多个采集管，以维持样本与缓冲液 1:10 的比例。
         警告：使用可能感染丽沙病毒的材料时操作手术刀具有危险性，使用者应采取适当的安全防护措施。
5. 将剩余组织收集至原始容器或贴有 accession 标签的新空容器中。保存该组织以备重新检测或进一步表征所需。
6. 使用 QAC 消毒剂（1:256）对工作站、设备及样本管外壁进行清洁和消毒，静置 2 分钟。
7. 对所有剩余样本重复步骤 1.2–1.5。
8. 使用微型珠磨仪对样本匀浆至少 60 秒。目视检查采集管。若仍有较大组织块，应再进行一次 60 秒的珠磨处理。若在上述步骤 1.4.2.1 中组织已完全匀浆，则此步骤可省略。
   注意：确保组织充分匀浆至关重要。匀浆不完全将降低 RNA 产量。
9. 室温（RT）静置至少 5 分钟。
10. 使用 QAC 消毒剂（1:256）对工作站、设备及样本管外壁进行清洁和消毒。
    注意：此时样本已视为无感染性，可移出狂犬病实验室。
11. 应立即对匀浆缓冲液中的样本进行 RNA 提取处理，或在室温（20 °C 至 25 °C）下短期保存数天，或在冷藏（4 °C 至 8 °C）条件下保存数天，或在 -16 °C 及更低温度下长期保存。

2. 使用 RNA MiniPrep 试剂盒提取 RNA 的实验方案

1. 在生物安全柜（BSC）内设置工作区域。
   1. 开始操作前，使用70%乙醇清洁BSC工作台面，以去除灰尘或其他环境污染物。根据制造商建议，可进一步使用季铵盐类消毒剂（QAC，1:256稀释）、RNase AWAY或RNaseZap进行表面去污处理。
   2. 在BSC内铺设带塑料衬里的吸水工作垫，并将试剂、耗材和样本放入其中。
      注意：确保带塑料衬里的垫子不会阻塞BSC的气流。若气流受阻，则不应使用垫子。
   3. 将所有收集管整齐放置于洁净的微量离心管架中。针对每个非蝙蝠脑组织样本，预先在1.5 mL微量离心管中加入300 µL 100%乙醇；对于组织量较少的样本（如蝙蝠脑样本、非脑组织样本或已降解样本），则为每个样本预先在1.5 mL微量离心管中加入600 µL 100%乙醇。
2. 样本准备
   1. 将在第1步中准备的所有样本集中放置于BSC内的试管架中。在检测前将冷冻样本解冻。
   2. 解冻一个提取对照样本。
      注意：建议选择不含狂犬病病毒属（lyssavirus）RNA的样本；该样本应已预先检测过，并具有β-肌动蛋白（beta-actin）检测预期的Ct值范围。例如，预分装的组织培养细胞，或先前确认为阴性的狂犬病病例样本（人或动物来源）。
3. 将所有样本在台式微量离心机中以10,000–16,000 × g 离心2分钟。
4. 将上清液转移至含有100%乙醇的新无菌微量离心管中。确保上清液澄清，无明显脂质或固体组织残留。避免收集脂质和固体组织。
   1. 对于非蝙蝠脑组织样本：转移300 µL上清液。
   2. 对于组织量较少的样本（蝙蝠脑样本、非脑组织样本或已降解样本）：转移600 µL上清液。
   3. 将剩余的匀浆液储存于带螺旋盖的微量离心管中，保存温度≤-16 °C。
5. 用移液器反复吹打10次，充分混匀。
6. 对每个样本，将600 µL乙醇-上清液混合液转移至置于收集管中的离心柱中。
7. 以10,000–16,000 × g 离心至液体完全通过柱体（约1分钟），弃去穿流液。
8. 若某样本的乙醇-匀浆缓冲液混合物体积超过600 µL，则重复此步骤。
9. 将每个离心柱转移至新的收集管中。
10. 向每个离心柱中加入400 µL RNA预洗缓冲液，并在10,000–16,000 × g 下离心30秒。
11. 弃去穿流液，并将每个离心柱放回原收集管中。
12. 重复步骤2.10–2.11。
13. 向每个离心柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液，在10,000–16,000 × g 下离心2分钟。确保洗涤缓冲液已完全通过每个离心柱。
14. 小心将每个离心柱转移至无RNase的收集管中。
15. 弃去穿流液及步骤2.13中的收集管。
16. 直接向每个离心柱的膜中央加入50 µL无DNase/RNase的水，以洗脱RNA。
    注意：移液枪头切勿接触离心柱膜表面。
17. 室温孵育30秒后，在10,000–16,000 × g 下离心1分钟。
18. 小心将RNA转移至新的带螺旋盖、平底、已贴样本编号标签的微量离心管中。立即将提取的RNA置于冰上用于后续检测。长期储存应置于-70 °C或更低温度。
    注意：在较高温度下储存或反复冻融可能导致RNA降解，影响诊断结果。

3. LN34 泛狂犬病毒实时逆转录 PCR 检测方案

1. 准备试剂。
   1. 人工阳性对照
      1. 若使用美国疾病控制与预防中心（CDC）⁸制备的人工阳性对照RNA，请按照包装说明进行储存、重悬和分装。若已有单次使用量的阳性对照RNA分装品，则跳过此步骤。
         注：工作浓度的阳性对照RNA应在模板添加区域处理，不得与主混合液配制区域重叠。阳性对照RNA的扩增循环阈值（Ct）应在针对特定批次确定的预期范围内。不同运行之间，阳性对照RNA在LN34检测中的Ct值差异不应超过±1.5个Ct值。
      2. 使用前，将单次使用量的分装品从≤ -70 °C储存条件下取出，并置于冰或冰块上解冻。避免反复冻融，且不得长时间在冷藏温度下保存分装品，应予以丢弃。
         注：应在LN34检测中以三复孔形式运行阳性对照；人工阳性对照⁸在β-肌动蛋白（beta-actin）检测中不会扩增。
   2. 提取对照与样本：使用前，将新提取的样本置于冰或冰块上，或立即从≤ -70 °C储存条件下在冰或冰块上解冻。
      注：RNA应在专用于样本或模板添加的区域进行解冻和处理，该区域应与主混合液配制区、PCR产物操作区或大量病毒材料操作区（例如阳性对照制备、病毒扩增）相互分离。
2. 在主混合液配制区域准备主混合液试剂。
   1. 单重LN34 RT-PCR检测的主混合液配制
      注：用户可选择以单重（步骤3.2.1）或多重（步骤3.2.2）形式检测样本。无需同时执行3.2.1和3.3.2。主混合液配制、引物与探针分装以及无模板对照试剂应在洁净区域进行解冻和操作，该区域应与样本处理、解剖、PCR及其他病毒材料操作区域分开。可通过独立房间或单向样本流的柜式系统实现此要求。
      1. 根据表1和表2所示，配制工作浓度的引物与探针混合液。若已有工作稀释浓度的引物与探针分装品，则跳过此步骤。
      2. 将引物与探针分装为1.5 mL储存液和50 µL工作液，并避光保存于≤ -16°C。若已有工作稀释浓度的引物与探针分装品，则跳过此步骤。
         注：建议执行步骤3.2.1.2。
      3. 在主混合液配制区域，将一步法RT-PCR缓冲液、无模板对照、引物与探针从≤ -16 °C储存条件下置于冰或冰块上解冻。
         注：试剂应在有效期内使用，或在性能未出现下降前使用，以先到者为准。
      4. 使用前，短暂涡旋并离心所有缓冲液、引物与探针。
      5. 将一步法RT-PCR酶置于冰或冰块上，直至使用。
      6. RNA样本
         注：应尽可能使用新提取的RNA，因反复冻融可能影响检测性能。
      7. 使用前，将RNA样本置于冰或冰块上保存。
      8. 将任何冷冻的RNA样本在冰或冰块上解冻。
      9. 为每项检测（LN34和βA）标记一个微量离心管。
      10. 确定每项检测需设置的反应数（N）。
      11. 通过将样本数乘以3，加上6个对照反应孔，并额外增加10%的反应数以补偿移液过程中的体积损失，计算LN34检测的反应总数。（例如，10个样本：(10 × 3) + 6 = 36个反应；额外反应数：(36 × 0.1) + 36 = 3.6 + 36 = 39.6，向上取整为40个反应）
          注：在临床检测中，建议所有样本在LN34检测中以三复孔形式进行。在监测用途中，每个样本可进行双复孔检测。建议在初次建立检测方法时采用三复孔，以确保复孔间变异小且操作技术良好。
      12. 通过将样本数加上4个对照反应孔，并额外增加10%的反应数以补偿移液过程中的体积损失，计算βA检测的反应总数。
      13. 根据表2确定LN34和βA主混合液中各试剂的体积。
      14. 使用96孔板图，为每个样本在LN34检测中分配三复孔，在βA检测中分配单孔。
      15. 短暂涡旋并使用台式微量离心机离心30秒，使液体沉至管底后，向每个指定的LN34孔中加入23 µL LN34检测主混合液。避免产生气泡。
      16. 短暂涡旋并使用台式微量离心机离心30秒，使液体沉至管底后，向每个标记的βA孔中加入23 µL βA检测主混合液。
      17. 通过移液向每个无模板对照（NTC）孔中加入2 µL PCR级水，以设置NTC反应。
      18. 覆盖孔板并转移至模板添加区域。
      19. 短暂涡旋并离心含有RNA样本的离心管。
      20. 从第一个样本中吸取2 µL提取的RNA，加入该样本对应的所有标记孔中。避免产生气泡。
      21. 通过目视确认RNA已吸入移液器吸头中。
      22. 沿孔壁移液，以确保样本加入正确的孔中。
      23. 尽可能避免将含有RNA的移液器吸头在开放孔上方挥动。
      24. 对剩余样本和阳性对照RNA重复步骤3.2.10。
      25. 加入所有样本和对照后，将光学粘性封膜覆盖于孔板上。注意完全覆盖所有孔并确保密封。
      26. 在台式离心机中，于室温下以500 × g离心1分钟，或使用类似沙拉脱水机的板式离心机。
      27. 将密封的孔板放入已校准用于FAM和VIC/HEX报告染料的实时PCR仪中，并设置为表3所示的循环参数。
   2. 为LN34多重（LN34M）检测配制主混合液。
      1. 根据表2，标记一个微量离心管为LN34M。
      2. 确定每项检测需设置的反应数（N）。
      3. 通过将样本数乘以3，加上6个对照反应孔，并额外增加10%的反应数以补偿移液过程中的体积损失，计算LN34M检测的反应总数。（例如，10个样本：(10 × 3) + 6 = 36个反应；额外反应数：(36 × 0.1) + 36 = 3.6 + 36 = 39.6，向上取整为40个反应）
      4. 选择25 µL或12.5 µL体系。根据表2确定LN34M主混合液中各试剂的体积。
      5. 使用96孔板图，为每个样本在LN34M检测中分配三复孔。
      6. 为LN34M检测配制试剂。在加入主混合液前，短暂涡旋并离心管子，使液体沉至管底，然后向每个指定孔中加入23 µL（25 µL反应体系）或10.5 µL（12.5 µL反应体系）主混合液。避免产生气泡。
      7. 通过移液向每个NTC孔中加入2 µL PCR级水，以设置NTC反应。
      8. 覆盖孔板并转移至模板添加区域。
      9. 短暂涡旋并离心含有RNA样本的离心管，使液体沉至管底。
      10. 从第一个样本中吸取2 µL提取的RNA，加入该样本对应的所有标记孔中。避免产生气泡。
      11. 通过目视确认RNA已吸入移液器吸头中。
      12. 沿孔壁移液，以确保样本加入正确的孔中。
      13. 尽可能避免将含有RNA的移液器吸头在开放孔上方挥动。
      14. 对剩余样本和阳性对照RNA重复步骤3.3.8。
      15. 加入最后一个样本/对照后，将光学粘性封膜覆盖于孔板上，确保所有孔均被完全覆盖并密封。
      16. 在台式离心机中，于室温下以500 × g离心1分钟，或使用类似沙拉脱水机的板式离心机。
      17. 将密封的孔板放入已校准用于FAM和VIC/HEX报告染料的实时PCR仪中，并设置为表3所示的循环参数。将被动参比染料设为ROX，并在标准模式下运行（不得使用快速模式）
          注：此设置仅适用于本方案中提及的仪器，且需使用含ROX作为被动染料的一步法RT-PCR试剂。其他仪器需采用不同方法确定最佳运行参数。为获得最佳性能，请按照制造商要求进行常规仪器维护。

4. 结果解读

1. 使用0.2作为LN34/FAM的阈值，0.05作为βA/HEX/VIC的阈值，设置自动基线和手动阈值计算。
   注意：此设置仅适用于本方案中提到的仪器，并要求使用含有ROX作为被动染料的一步法RT-PCR试剂。其他仪器需要采用不同的方法来计算基线和阈值。
2. 如果所有对照均按预期结果运行（见表5），则依据表4中的指导判断诊断结果。
3. 通过查看扩增曲线图确认所有Ct或Cq值。
4. 按建议对任何异常结果进行进一步调查。

5. 样本保留与储存

1. 所有样品在检测完成并报告结果前均应保存在 -16 °C 或更低温度下冷冻。保留原始组织，以便在出现异常检测结果时确认结果或鉴定宿主动物的物种。
2. 使用唯一的样品编号；所有试管、报告和文件均需标注完整的唯一样品编号。
3. 短期保留中间样品，以备需要重复检测时使用。
4. 根据需要保留具有代表性的阳性样品，用于对照、流行病学分型及其他用途。
5. RNA 长期保存应置于 ≤-70 °C 条件下。

结果

在 ABI ViiA7 实时荧光定量 PCR 仪上成功运行 LN34 检测的代表性图像如图 2所示。以对数刻度显示结果可便于观察 Ct 值，即扩增曲线与阈值线相交的点（图 2A、C）。当以线性刻度显示时，成功扩增的结果呈现为S型（或“S”形）曲线（图 2B、D），而阴性结果则表现为一条直线且无上升趋势。建议同时在对数和线性刻度下查看结果，以识别可能的异常或错误。在多组分荧光图中，典型的阳性与阴性结果分别如图 2E、F所示，其中可观察到探针标记染料（LN34 使用 FAM，βA 使用 VIC/HEX）相对于反应缓冲液中被动参比染料（ROX）的荧光信号水平。

异常结果的示例如图3所示。通过比较成功运行的图表（图2）与异常图表（图3），可识别出非典型运行情况及仪器问题。图3A显示信号穿过阈值，为LN34产生了一个Ct值，但扩增曲线极为非典型，呈线性上升趋势。多组分图（图3B）也显示出波浪状线条，不符合阳性样本的典型特征。此示例强调了查看扩增曲线图的重要性，而不仅仅是复制Ct值。务必确保所有样本的扩增曲线形态正常。建议同时查看多组分图，以确认不存在任何异常。有时，在未发生扩增的情况下，杂乱的基线信号也可能生成Ct值。如果扩增信号呈线性，建议调整基线，观察曲线是否消失。若出现任何异常信号，应重复整个实验运行。若问题持续存在，建议对实时荧光定量PCR仪进行清洁，并运行空白对照板。如有条件，可通过琼脂糖凝胶电泳和/或测序分析PCR产物，以排查异常结果。但不建议将凝胶电泳或测序结果用于诊断判断。

既往研究表明，LN34 检测在重复样本、检测运行、操作人员和实验室之间均表现出较低的变异性⁷。如果同一标本的重复检测之间出现高变异性（>±1.5 Ct 差异），应对该 RNA 重新检测。高变异性可能由移液器问题、实验室操作不规范、移液错误或实时荧光定量 PCR 仪故障引起。若在多个样本或多次检测运行中反复出现高变异性，可能提示存在系统性问题。对于 RNA 含量较低、接近阳性样本检测阈值（Ct 35）的样本，其重复检测间的 Ct 值可能表现出更高的变异性。如持续出现变异性高、结果不一致或检测失败的情况，建议咨询美国疾病控制与预防中心（CDC）并进行故障排查。

基于PCR的检测方法具有高灵敏度，因此 inherently 易受污染。严格遵守良好的实验室规范是减少交叉污染的最佳方式。了解如何识别潜在污染非常重要。如果在一次检测运行中，无模板对照（NTC）和可疑阴性样本孔均产生相似的Ct值，则应怀疑试剂污染。应使用新的PCR试剂（缓冲液、水、引物和酶）分装 aliquots 以及相同的RNA重新进行检测。如果所有样本和提取对照均产生相似的CT值，但NTC为阴性，则应调查提取试剂是否污染，并使用新试剂重新进行提取。为降低污染风险并避免丢弃大量昂贵试剂，建议将试剂分成小份 aliquots 使用。样本间的交叉污染较难识别。若怀疑样本被污染，应从原始组织重新开始采集样本。在某些情况下，对病毒RNA进行测序可确认污染，特别是当污染RNA与预期病毒变异株差异较大时（例如实验室中使用的对照病毒）。同时处理的两个样本若测序结果完全相同，可能提示污染；但如果预期序列本身就非常相似（例如同一县采集的相同变异株），则测序结果可能无法提供明确信息。若怀疑样本被阳性对照RNA污染，可将LN34检测的扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，以区分丽沙病毒RNA（165 bp）与阳性对照RNA（99 bp）。阳性对照RNA所用模板序列来自美国疾病控制与预防中心（CDC）⁸。

对于其他病原体，实验室人员可能习惯于手动设置阈值，以消除“噪声”，例如 图4 中以青色显示的微弱扩增信号。然而，这种做法在狂犬病诊断中并不推荐，因为可能导致假阴性结果，造成严重后果，毕竟狂犬病的致死率几乎高达100%。切勿手动调整阈值，将微弱或延迟扩增的样本结果判读为阴性。此类样本必须重新提取核酸和/或重新检测，以排除狂犬病的可能性。

图1：通过直接荧光抗体检测法显示感染驴体内狂犬病病毒抗原单侧扩散的视野。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：LN34检测成功运行后的扩增曲线及多组分图。 (A-D) 结果数据绘制在 (A,C) 对数尺度和 (B,D）LN34 和 βA 检测的线性范围。图示 A 和 B 显示两个样本（粉色和青色）与阳性对照（黄色）的LN34结果。在图中 B，有一条平坦的绿色线条表示运行中的另一个阴性样本。在图A中，绿色线条未显示任何扩增，以断开的线段表示。LN34检测的阈值手动设置为0.2，由红色水平线表示。C,DβA 检测两项样本（红色和青色）的结果。βA 检测的阈值手动设置为 0.05。E,F多组分图显示了每个循环中FAM（LN34）、VIC（βA）和ROX（AgPath-ID缓冲液中存在的被动染料）的荧光值（RFU）。ROX水平应在所有循环中保持平稳。图中展示了典型的阳性样本结果 E；该样本的FAM荧光从第18个循环开始呈S形曲线增长。典型阴性样本如图中所示 F，其中FAM水平在所有循环中与ROX水平保持平行。数据来自ABI ViiA7实时PCR仪。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：在ViiA7实时PCR仪上运行LN34检测时观察到的罕见且非典型信号的代表性图像。（A-F）由于孔污染导致的扩增（A、C、E）和多组分（B、D、F）图谱。FAM荧光信号的线性上升（A、C）和波动状起伏（B、D）并不反映真实的扩增，依据是曲线的形态以及荧光变化的幅度。尽管在图A和B所示的重复孔中产生了Ct值，图A至D很可能代表阴性样本。图E和F显示了一种异常的波动信号，在多组分图中更易观察到。此类信号应进一步调查，可能提示仪器存在问题，尽管本实验中所有对照均表现正常。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：来自两个疑似狂犬病样本的LN34实时反转录PCR扩增曲线，展示两种设定阈值的方法。（A）LN34的阈值设定为0.2（建议所有实验均采用此设定）。（B）手动为每次实验设定不同的阈值，以屏蔽被判定为“噪音”的信号（晚期扩增信号）。由于漏检真正阳性结果可能导致严重后果，因此不推荐在狂犬病检测中使用图B所示的方法。晚期扩增可能提示弱阳性样本、PCR抑制或阳性样本提取失败，也可能提示交叉污染。金色样本（由黑色箭头指示）在检测的临界值处产生Ct值，不应视为阴性。对于出现晚期扩增的样本，应重新提取核酸并重新检测。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：在LN34lys（单重LN34）和LN34M（LN34与βA多重）实时RT-PCR检测中所用的引物和探针序列及其浓度。 LN34探针在5ʹ端标记有FAM荧光染料，在3ʹ端标记有黑洞淬灭剂（BHQ1）。βA探针在5ʹ端标记有HEX荧光染料，在3ʹ端标记有黑洞淬灭剂（BHQ1）。锁核酸修饰碱基在序列中以碱基前的加号（+）表示。请点击此处下载该表格。

表2：LN34lys、Actin3和LN34M检测的实验设置。 引物和探针的名称、序列及浓度见表1。LN34_F1对应于ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAA⁷。请点击此处下载该表格。

表3：ABI仪器的循环参数。重要提示：务必在标准模式下运行，而非快速模式。应选择ROX作为被动参比染料。请点击此处下载该表格。

表4：单重（上方，蓝色表格）和多重（下方，红色表格）格式下LN34实时RT-PCR结果判读算法。 只要LN34结果为阳性，无论βA结果为阴性或不确定，均应判为阳性。若未检测到LN34扩增子，则只有当βA的Ct值小于或等于表中列出的Ct值判定阈值时，方可判为阴性。βA的Ct值可反映被测样本的质量，并提示是否存在可能的抑制效应。原始临床标本中核酸浓度较低可能影响βA扩增曲线，导致无法识别出扩增信号。除上述因素外，未能检测到β-actin的其他可能原因还包括：RNA提取效率低（如RNA丢失或PCR抑制物残留）、实验操作或加样技术不当、样本类型或质量不佳，以及试剂或仪器故障。请点击此处下载该表格。

表5：LN34检测对照组的预期操作及常见结果解读。 三项对照（狂犬病阳性对照RNA、狂犬病阴性提取对照和无模板对照）均需产生预期结果，检测运行方可通过。若阳性对照或无模板对照失败，可能提示移液错误、试剂或仪器故障，此时整个实验运行（包括所有检测的RNA样本）必须重复。若提取对照失败，可能提示提取过程中存在问题，例如试剂失效、移液错误或交叉污染，所有样本的提取步骤必须重新进行。对于经验丰富的实验室人员而言，对照失败应属罕见情况。请点击此处下载该表格。

讨论

一次成功的LN34检测运行必须包含阳性对照、提取对照和无模板对照，且这些对照在每次检测运行中均需表现正常，否则该次运行必须作废并重新进行。所有三个LN34阳性对照重复反应均应在规定的范围内跨越阈值，否则应重复实验。先前文献中描述的阳性对照RNA^7,8在βA检测中不会发生扩增。无模板对照反应在LN34或βA检测中均不应出现跨越阈值线的扩增曲线。提取对照在LN34检测中不应出现扩增。若在无模板对照或提取对照中观察到意外扩增，可能提示存在污染，需作废本次运行并对所有样本重新进行检测（见表5）。用户可考虑增加其他对照，例如无处理对照或无样本提取对照，以监测提取试剂是否受到宿主βA的污染。

由于狂犬病的致死率接近100%，因此建议对任何微弱或异常的扩增信号进行进一步调查，即使未产生Ct值。阴性样本或NTC（无模板对照）反应不应出现任何扩增，荧光曲线在多组分视图中应表现为一条与ROX荧光平行的平直线。若观察到扩增曲线，尤其是在多个重复样本中出现，可能提示存在交叉污染或弱阳性结果。对于阳性样本，所有重复样本均应出现扩增，方可判定为有效的阳性结果。如果在任一检测中仅有部分重复样本出现扩增，则应对该样本重新检测。此外，任何产生高度变异结果的样本（重复样本间的Ct值差异> ±1.5）均应视为无效，并需重新检测。若问题持续存在，应对样本重新进行核酸提取。

从正确采集并妥善保存的脑干和小脑组织中提取的狂犬病阳性样本，在LN34检测中预期Ct值应低于35个循环。所有不确定结果的样本必须使用LN34实时RT-PCR重新检测。如果重复检测后样本仍为不确定结果，且所有对照均表现正常，则建议重新提取RNA。病毒RNA含量较低的样本（LN34 Ct > 35）可能提示存在某些问题，例如污染、病毒载量低、PCR抑制或提取失败。应从原始组织中采集新鲜的脑组织样本，重新进行RNA提取，并再次检测。同样，βA检测中Ct值 > 33（单重反应）、37（LN34M）或无扩增，可能表明RNA提取失败。对此类样本应重复提取RNA，然后对LN34和肌动蛋白（actin）均重新检测。如果样本在多次重复检测后仍产生不确定结果，应采用第二种方法进行检测，例如直接荧光抗体检测（DFA，也称FAT）、DRIT或病毒分离。若持续出现结果不一致或不确定结果，请咨询狂犬病参考实验室以进行确证检测。

如果RNA提取物中存在抑制剂，PCR检测可能会产生假阴性结果。若怀疑存在抑制作用，或某个样本的βA对照反应出现抑制现象（例如Ct值>33或Ct值>37），应对提取的RNA进行两种或更多稀释度（例如，用无核酸酶水稀释1:10和1:100）检测，以稀释可能存在的PCR抑制物。对于难以处理的样本，可通过不添加水的方式将RT-PCR反应中的RNA加样量增加至8.5 µL。这可能揭示出更强的抑制作用（与2 µL RNA加样量相比，Ct值延迟）或原始样本中RNA含量较低（使用8.5 µL RNA加样量时Ct值早于2 µL加样量的情况）。

LN34 检测无法区分丽沙病毒或确定狂犬病病毒变异株。LN34 检测扩增子可用于低分辨率的狂犬病病毒变异株分型或丽沙病毒种类的鉴定¹¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7500 Fast	Applied Biosystems	N/A	未经验证不得替换
7500 Fast Dx	Applied Biosystems	N/A	未经验证不得替换
ABI ViiA 7	Applied Biosystems	N/A	未经验证不得替换
AgPath-ID 一步法 RT-PCR 试剂盒	ThermoFisher Scientific	AM1005	未经验证不得替换
Beadbug6	Benchmark Scientific	D1036
Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒	Zymo Research	R2052
MagNA Lyser 绿色珠子	Roche	3358941001
微量离心机	Eppendorf	5425 R
光学 96 孔反应板	ThermoFisher Scientific	4346907
光学粘合盖膜	ThermoFisher Scientific	4311971	替代品：封口帽
聚酯纤维头采样拭子	BD BBL 聚酯纤维头采样拭子	220690
QuantStudio 6Flex	Applied Biosystems	4485691	未经验证不得替换
季铵盐类消毒剂（1:256）	LYSOL	WBB56939	未经验证不得替换
RNase AWAY	ThermoFisher Scientific	7002PK
RNaseZap	ThermoFisher Scientific	AM9780
一次性手术刀，带安全装置的手术刀	Integra Miltex	4-510
无菌聚丙烯微量离心管（1.5 mL），无核酸酶	Sarstedt	72.692.405
无菌聚丙烯微量离心管（2 mL），无核酸酶	Sarstedt	72.694.600
TRIzol 试剂	ThermoFisher Scientific	15596026	未经验证不得替换