本文介绍了PyOKR，一种半自动化的定量分析方法，可直接测量由二维图像运动引起的视觉反应所产生的眼动。基于Python的用户界面和分析算法使得眼动追踪参数的定量测量通量更高、结果更准确，优于以往的方法。
本文内容
摘要
摘要
研究视觉刺激引起的行为反应是理解视觉系统功能的关键组成部分。其中一种显著的反应是视动反射（OKR），这是一种高度保守的先天性行为，对于视网膜上图像的稳定至关重要。OKR能够可靠地反映图像追踪能力，已被广泛用于研究不同遗传背景动物的视觉系统神经回路与功能。OKR包含两个阶段：首先是慢速追踪相，即眼球跟随刺激移动至视野边缘；随后是补偿性的快速扫视相，使眼球在眼眶内复位。以往用于量化追踪增益的方法虽然可靠，但耗时费力，且可能带有主观性或依赖人为设定。为了更快速、可重复地量化眼球追踪能力，我们开发了一种新颖的 半自动化分析程序PyOKR，该程序可量化二维眼球运动对任意方向刺激的响应，并可适配于各类视频眼动记录设备。该方法提供自动化的信号滤波、慢速追踪阶段的选取、垂直与水平眼动矢量的建模、相对于刺激速度的眼动增益量化，并将结果数据整理为可用于统计分析和图形比较的电子表格格式。这一定量且流程化的分析管道可通过PyPI导入便捷获取，为OKR反应提供了快速而直接的测量手段，从而促进视觉行为反应的研究。
引言
图像稳定依赖于精确的眼动反应，以补偿在自身运动过程中产生的全局视流。这种稳定主要由两种运动反应驱动：视动反射（OKR）和前庭-眼反射（VOR）1,2,3。视网膜上缓慢的全局运动可诱发视动反射（OKR），从而引起眼球向相应方向的反射性转动，以稳定图像1,2。这一运动被称为慢相，其间被称为快相的补偿性扫视所中断，即眼球快速向相反方向复位，以启动下一次慢相。本文中，我们将这些快相扫视定义为眼追踪运动（ETMs）。前庭-眼反射（VOR）依赖前庭系统诱发眼球运动以补偿头部运动3，而视动反射（OKR）则由视网膜中ON细胞的放电启动，并将信号传递至中脑的辅助视系统（AOS）4,5。由于其直接依赖于视网膜回路，视动反射（OKR）在科研和临床实践中常被用于评估视觉追踪能力6,7。
OKR 已被广泛研究，作为评估基本视觉功能2,6,8、DSGC 发育9,10,11,12、眼动反应13以及不同遗传背景间生理差异7的工具。OKR 的评估通常在头部固定的动物中进行，通过呈现运动刺激来诱发反应14。眼动反应通常使用多种视频工具记录，眼动追踪信号以水平和垂直方向的 OKR 波形形式采集9。为了量化追踪能力，已有两种主要指标被描述：追踪增益（眼球运动速度相对于刺激运动速度的比值）和 ETM 频率（在特定时间窗口内快速相扫视的次数）。历史上，增益的计算被用于直接测量眼球的角速度以评估追踪能力；然而，这些计算过程耗时费力，且可能因视频眼动图采集方法及后续量化方式的不同而产生任意性结果。为了实现更快速的 OKR 评估，ETM 频率计数已被用作衡量追踪敏锐度的替代方法7。尽管该方法能较准确地估计追踪能力，但它依赖于间接指标来量化慢相反应，并引入了多种偏差，包括扫视判断中的观察者偏差、对特定时间段内扫视反应时间一致性的依赖，以及无法评估慢相反应幅度的问题。
为解决当前眼动追踪（OKR）评估方法存在的问题，并实现对OKR参数的高通量深度量化，我们开发了一种新的分析方法来量化OKR波形。该方法采用一个基于Python的易用软件平台，名为"PyOKR"。利用该软件，可更深入地研究OKR慢相反应的建模与量化，并实现更多参数化分析。该软件能够对多种视觉刺激引发的反应进行易于获取且可重复的定量评估，同时支持针对水平与垂直运动的二维视觉追踪分析。
方案
在约翰斯·霍普金斯大学医学院（JHUSOM）进行的所有动物实验均经该校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）进行的所有实验均遵循由UCSF机构动物护理和使用项目批准的协议。
1. 行为数据采集
- 使用选定的视频眼动图方法记录OKR眼动，以生成波形数据（即眼睛注视角度在球坐标系下的时间序列）。
注：约翰·霍普金斯大学医学院（JHUSOM）采集的代表性数据采用头杆植入手术结合视频眼动图方法获得，具体方法如前所述9,13（图1）。加州大学旧金山分校（UCSF）采集的代表性数据也通过头杆植入手术和视频眼动图方法获得，具体方法如前文所述10（图7）。- 记录刺激和记录参数：记录帧率、刺激速度和方向，以及各刺激时段之间和之后的时间长度。对于正弦刺激，还需记录刺激波形的振幅和频率。
- 将采集的波形数据导出为包含水平和垂直方向（方位角和仰角）波形数据的.CSV文件。
- 将波形数据整理为制表符分隔的.CSV文件，包含两列，分别为水平方向数据（epxWave）和垂直方向数据（epyWave）。
2. 分析软件的安装
- 下载并安装 Python。
- 对于图形界面操作，通过 Anaconda 安装 Spyder。
- 为确保图形在 Spyder 中正常显示，请进入 工具 > 首选项 > Ipython 控制台 > 图形 > 图形后端，将 内联 设置为 自动。
- 创建一个包含 Python 的新 Anaconda 环境。
- 通过 PyPi 使用 pip install PyOKR 安装 PyOKR，以获取最新版本及其依赖包（补充代码文件 1 和 补充代码文件 2）。
- 如果使用的是 Windows 计算机，请运行 from PyOKR import OKR_win as o，然后运行 o.run()。
- 如果使用的是 Mac 计算机，请运行 from PyOKR import OKR_osx as o，然后运行 o.run()。
3. 波浪数据的分析
- 分析初始化与文件导入
- 运行 o.run() 在 .py 脚本中打开用户界面。
- 下 文件，使用该功能 打开 或命令 Ctrl+O [iOS 命令] 打开一个浏览器，以便用户选择所需的波形文件。
- 在……下方 文件，使用按钮 导出文件夹 或命令 Ctrl+E 打开文件夹浏览器，以选择用于导出最终分析结果的输出文件夹。
- 在“输出文件”中输入最终分析文件的名称，建议格式如下： 动物基因型_动物编号_分析.
- 使用命令为单个动物设置程序 设置受试者 在……下方 文件 或命令 Ctrl+S 用于初始化单个动物的数据集。
- 定义波形文件参数
- 开始设置刺激参数时，在下方定义方向性 选择刺激方向 通过选择四个基本方向之一。对于正弦刺激，选择一个包含 （水平） 或 （垂直） 相应地，以正弦波的初始传播方向定义 cardinal 方向。
- 设置刺激类型 选择刺激类型 或 单向的, 振荡的，或 斜位.
- 设定方向性后，导入自有的刺激位置数据集（导入自定义刺激向量数据）或根据参数自动生成一个载体（根据参数生成刺激向量）。如果导入刺激向量，请继续执行3.2.3.1，然后跳至步骤3.3。如果生成刺激向量，请继续执行后续步骤。
- 若导入自定义的向量数据，请以与步骤 3.2.1 中所述相同的格式导入刺激的距离值（即，描述刺激在每次相邻采集帧之间移动距离的时间序列）。此外，应将整个数据集作为一个时段进行分析，而非将其分割为多个独立时段，因为截至 PyOKR v1.1.2 版本，尚未提供对导入的刺激值进行子集划分的功能。
- 在下方 刺激参数设置用于数据采集的刺激参数。
- 设置给定试验开始（头部）和结束（尾部）无刺激的时间长度 头部 和 尾部.
- 设置刺激呈现的时间长度、刺激结束后无刺激的时间长度，以及单次试验中总的周期数 时间段长度, 刺激后时长，以及 训练轮数分别。
- 对于单向和斜向刺激，以度/秒为单位设置刺激速度 水平速度 和 垂直速度.
- 设置采集相机的捕获速率 捕获帧率.
- 对于正弦刺激，生成用于模拟振荡刺激的正弦波 频率 和 振幅.
- 参数化后，根据上述输入的刺激信息构建相应的模型 从参数生成刺激向量.
- 使用输入刺激选择特定时段 选择训练周期 扫描整个波形文件。
- 监督选择追踪阶段
- 为了识别追踪速度较慢的区域，自动选择快速相扫视 初步调整 通过点击任一选项 未过滤数据 或 过滤后的数据，该方法将根据最大速度变化标记潜在的眼跳。
- 下方 未过滤数据，确认扫视眼动被准确选中，表现为一个蓝色圆点。如果自动选择不准确，需手动移除相应点 左键（LMB） 或使用点工具添加点 右键鼠标按钮（RMB）当快速相扫视被充分选择后，保存这些点 鼠标中键（MMB） 并关闭图表。
- 如果需要自动过滤，请设置一个 Z分数阈值 并点击 过滤后的数据 自动过滤扫视眼动。如有必要，采用步骤3.3.2中所述相同的手动监督方法去除任何噪声。
- 在正确选择扫视后，按压 点调整 选择要移除的区域。通过与步骤 3.3.2 中所述类似的控制方案调整顶部和底部的点。使用 LMB 或 RMB 并使用编辑底部（红色）点 Shift+鼠标左键单击 或 Shift+鼠标右键当点被正确放置后，使用 MMB 保存这些点。
注意：如果使用 Mac，底部和顶部触点的调节位于两个独立的按钮上，其控制方式与步骤 3.3.2 中所述相同。
- 慢速追踪相位分析
- 使用以下方法设置多项式模型的阶数 设置多项式阶数 用于定义将拟合到各个慢相的多项式模型。
注意：对于单向或斜向刺激，默认值为1，因为需要线性来计算跟踪增益。对于正弦刺激，需要更高阶数来建模波形曲线，默认值为15。 - 要分析轨迹，请选择 最终分析 以生成慢相模型（图2) 用于所选的慢相（参见 图2A- D）并计算该时间段内的平均距离、速度和跟踪增益（图2E).
- 要查看所选区域的二维（2D）或三维（3D）图，请选择 查看二维图 或 查看 3D 图，分别。
- 选择 添加训练周期 保存步骤 3.4.2 中采集的数值。要查看某只动物的所有已添加数值以及采集试验的平均值，请选择 查看当前数据集.
- 添加一个训练周期后，遍历文件的其余部分 选择训练周期，按照步骤 3.3.1 至 3.4.4 进行。
- 当一个波形文件完成分析后，通过打开其他新文件、设置相应参数并进行相应分析，对同一只动物的所有其他文件重复此过程。通过重复步骤3.2.1–3.4.5对每个文件进行处理，生成包含该动物全部波形数据的最终数据集。
- 使用以下方法设置多项式模型的阶数 设置多项式阶数 用于定义将拟合到各个慢相的多项式模型。
- 数据最终导出
- 在完成特定动物的所有方向或刺激的数据分析后，通过以下方式导出数据集： 导出数据.
注意：原始数据集将根据以下内容导出 输出文件 名称并沿设定的路径保存 输出文件夹 包含各个时间段数据的 CSV 文件，以及每个刺激参数的总体平均值。 - 导出单个动物数据后，使用 Ctrl+S 重新初始化数据集，然后重复所有先前步骤以分析下一个动物。
- 如有需要，可使用以下命令重新整理针对多只动物收集的全部输出数据，以便于分析 排序数据 在……之下 分析 标签
注意：此功能将编译并排序输出文件夹中存储的所有已分析动物文件的平均值，以便更方便地生成图表并进行统计比较。排序依赖于文件的命名方式（自v1.1.2版本起）。请为每个文件使用步骤3.1.4中推荐的命名方案（例如， WT_123_分析).
- 在完成特定动物的所有方向或刺激的数据分析后，通过以下方式导出数据集： 导出数据.
结果
为验证上述分析方法，我们对来自野生型小鼠以及具有已知追踪缺陷的条件性基因敲除突变体小鼠的波动追踪数据进行了OKR追踪增益的定量分析。此外，为了检验本分析方法的广泛适用性，我们还分析了采用不同视频眼动记录方法获取的另一群野生型小鼠（n = 13）的追踪信号。自动扫视过滤功能显著促进了OKR数据的处理与分析（图3）。利用来自单向刺激和正弦刺激的记录数据（图1D），我们计算了野生型动物对单向刺激在四个正交方向上的OKR追踪增益（图2F），以及对水平和垂直方向正弦刺激的追踪增益（图4）。在所有野生型小鼠中，均一致观察到对单向和正弦刺激的追踪能力随刺激方向而变化的现象：水平方向的反应强度相当且显著高于垂直方向的追踪增益，这与已有报道一致2。此外，使用两种不同的视频眼动记录方法，均在野生型小鼠中观察到向上与向下反应之间追踪增益的不对称性，这也与先前报道相符2,10。与已发表的OKR反应特征相比，本软件计算所得追踪增益的相对大小和一致性表明，该软件准确反映了动物的实际追踪能力。除单向增益计算外，还可同时建模水平和垂直方向的眼动（图5），从而实现对特定刺激下眼球运动的三维重建。这一功能为未来研究水平与垂直方向交叉耦合反应提供了额外的量化手段9。
为了验证该软件在识别不同实验条件下显著行为变化方面的实用性，我们重新分析了已发表的数据9，以确认此前通过手动计数快相扫视所评估的垂直追踪缺陷，在本研究所提出的方法中同样能够通过追踪增益反映出来。先前的研究表明，在视网膜中通过Protocadherin 9-Cre（Pcdh9-Cre）介导的条件性敲除，使转录因子T-box Transcription Factor 5（Tbx5）发生遗传失活，会导致向上调谐的ON型方向选择性节细胞（up-oDSGCs）特异性丧失，并且Tbx5 Flox/Flox（Tbx5f/f）；Pcdh9-Cre突变小鼠表现出垂直性视动性眼球震颤（OKR）追踪能力的特异性缺失9。采用本文所述方法进行定量分析显示，Tbx5f/f；Pcdh9-Cre小鼠的水平追踪增益保持正常（图6A），与此前报道的结果以及通过手动计数快相扫视（ETMs）获得的数据相似（图2F）；然而，这些小鼠在垂直追踪方面表现出显著缺陷，对向上和向下刺激的反应增益均接近于零（图6B、C）。此外，对正弦刺激响应的分析进一步证实，Tbx5条件性敲除（cKO）小鼠的水平追踪增益更高，而垂直追踪能力则显著降低（图6D–F）。利用PyOKR对这一已有描述的表型进行再分析，展示了该新方法的精确性和灵敏度，使其能够对不同遗传背景小鼠的OKR反应进行定量比较。
最后，我们分析了在加州大学旧金山分校（UCSF）采集的野生型小鼠垂直视动性眼震（OKR）轨迹，以验证该软件应用程序在不同视频眼动记录方法和刺激参数下的适用性。UCSF的数据是利用半球形投影系统采集的，该系统通过将波长为405 nm的投影仪图像反射到固定头部动物周围的半球面上，向小鼠呈现移动光栅10（图7A）。以每秒10度的速度向小鼠呈现单向垂直光栅，并在60秒的时间段内记录OKR反应（图7B、C）。通过PyOKR对垂直轨迹进行定量分析，并将向上反应与向下反应进行比较（图7D）。结果表明，向上反应显著强于向下反应，这与预期一致10；然而，与约翰斯·霍普金斯大学医学院（JHUSOM）记录的轨迹相比，追踪增益略有降低（图2F）。此外，通过PyOKR分析了正弦运动刺激下的反应量化结果（图7E），计算出的增益反映出对正弦移动刺激的垂直反应存在显著不对称性（图7F）。JHUSOM与UCSF采集的增益值之间的差异可归因于刺激参数的不同，包括刺激速度、类型和波长的差异；然而，我们对采用不同采集方法获得的数据进行分析时所观察到的整体一致性表明，本研究所描述的PyOKR软件可轻松适应于JHUSOM的OKR数据采集系统之外的其他OKR记录，且不受视频眼动记录方法的限制。这些结果证明，本文所述的软件平台具有准确性，可广泛应用于眼动反应的研究，从而实现不同组别动物之间的精确量化比较，进一步推动视觉图像稳定神经环路的研究。
图 1：OKR 反应数据的采集。（A）用于行为刺激的 OKR 虚拟环境装置，如前所述9,13。四台显示器围绕一只头部固定的动物（1），显示持续移动的棋盘格刺激图案（2）。该虚拟转鼓可呈现四个正交方向的单向运动以及振荡正弦刺激。小鼠的左眼由红外光（IR）照射，并通过摄像头（3）记录其眼球运动，以获取视觉系统响应的眼动追踪数据。（B）眼动追踪分析通过捕捉瞳孔及由红外光产生的角膜反射实现。对虚拟转鼓刺激下眼动反应的数据采集与计算方法如前所述9,13。（C）眼球矢量在垂直方向（Y 波）和水平方向（X 波）运动的示意图。（D）眼球对单向上移和后移运动，以及垂直和水平正弦运动的追踪反应示例轨迹。请点击此处查看该图的高清版本。
图2单向视觉反应的追踪分析 (A-D慢速追踪阶段的识别与选择，用于增益分析。图中显示了对前进方向视觉刺激的单向追踪样本轨迹A），反向（B），向上（C）和向下（D）运动与小鼠眼睛的关系。通过添加第3步中描述的红色和绿色点来去除扫视，从而识别慢相，所选的慢相以黄色高亮显示。多项式回归以线条形式叠加在轨迹上。E) 样本痕迹的定量分析A-D) 按照 PyOKR 检测结果进行组织。对于每条轨迹，均计算总的 XY 方向速度及其相应的增益，不考虑运动方向性。在单向反应中，该总速度通常反映眼球在某一特定方向上的个体速度；然而，在正弦波反应中，该值反映的是眼球的平均总体速度。水平和垂直速度分量被分别分解，以显示各自方向上的速度。增益则根据所呈现的刺激速度进行计算。F野生型动物（n = 13）在四个基本方向上的计算追踪增益与其相应的ETM定量结果比较。数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.0001. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：自动滤除扫视眼动有助于OKR数据的处理与分析。（A-D）对图2A-D中记录轨迹的自动滤除可去除扫视眼动，仅保留慢相运动，方法为消除快速的速度变化并将各慢相阶段拼接起来。最终斜率代表给定时间段内的总体眼球运动。（E）基于PyOKR输出整理的滤波后样本数据的增益量化结果。（F）未滤波与滤波后样本眼动轨迹增益值的比较显示无显著差异。数据以均值±标准差表示。采用Mann-Whitney U检验对未滤波与滤波后的结果进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：对振荡性视觉刺激的追踪增益推导。（A,B）垂直（A）和水平（B）眼动反应可依据定义的振荡刺激参数进行建模。选中的区域以黄色标出，并在轨迹上方叠加了多项式近似曲线。在轨迹后方以橙色正弦波形式呈现刺激模型，以便参考每个时间点对应的刺激状态。（C）野生型正弦反应的增益计算结果（n = 7）反映出水平与垂直追踪能力之间的不对称性。数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多重比较分析。**p<0.01，***p<0.005。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：眼球追踪的方向性可分解为水平和垂直分量进行建模。 （A）眼球追踪波形对向上刺激的垂直分量。（B）眼球追踪波形对向上刺激的水平分量。（C）眼球在垂直和水平方向上的整体运动轨迹。（D）对向下运动响应的眼球运动矢量随时间变化的三维模型。原始轨迹数据以红色显示，轨迹的回归模型以蓝色显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 小鼠的OKR分析显示单向垂直追踪增益存在显著缺陷。（A）Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 动物在水平追踪增益方面未表现出显著变化。（B、C）Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 动物在垂直反应增益方面表现出显著降低：向上（B）和向下（C）。（D,E）Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 动物对水平（D）和垂直（E）振荡刺激的正弦反应。（F）Tbx5f/f; Pcdh9-Cre 振荡反应的量化结果显示，水平追踪增益显著增加，但垂直反应下降。数据以均值 ± 标准差表示。采用 Mann-Whitney U 检验进行数据分析。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：PyOKR 在其他视频眼动记录方法所获取数据中的应用。 （A）用于OKR虚拟鼓刺激的装置，如文献10所述。波长为405 nm的DLP投影仪通过凸面镜将图像反射至半球面上，形成环绕动物视野的虚拟鼓。眼动通过位于半球外部的近红外（NIR）相机进行测量。对头部固定的动物呈现单向和正弦条纹光栅，方向为垂直方向。（B,C）识别并选取上向（B）和下向（C）追踪相位进行定量分析。慢相部分以黄色高亮显示。（D）利用本文所述方法计算野生型动物（n=5）垂直追踪的追踪增益。观察到追踪能力的不对称性，下向追踪显著降低。（E）对正弦刺激的振荡反应建模，用于量化野生型动物（n=8）的追踪增益。慢相部分以黄色高亮显示。（F）正弦增益的定量分析显示，下向追踪增益低于上向增益。数据以均值±标准差表示。采用Mann-Whitney U检验进行数据分析。*p<0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充代码文件 1：PyOKR Windows 请点击此处下载该文件。
补充代码文件 2：PyOKR Mac 请点击此处下载该文件。
讨论
PyOKR 在研究反映于眼动中的视觉反应方面具有多项优势，包括准确性、易用性以及数据采集的灵活性，此外还能够整合参数化设置和可变的刺激速度。
直接评估眼动追踪增益可对眼动进行精确表征，相较于传统的快速相扫视（ETMs）人工计数方法，是一种更为直接的定量指标。尽管扫视计数具有一定用途，但它仅能间接评估实际的追踪运动。PyOKR 软件平台能够直接量化追踪速度，并综合考虑其他参数 ，包括扫视幅度和慢相持续时间。此外，快速相扫视计数依赖于在固定时间段内评估扫视频率，因此要求每条轨迹几乎无噪声，包括排除动物应激引起的随机扫视。这些因素导致大量采集到的轨迹数据无法使用，因而需要更长的数据采集时间才能准确评估眼动追踪性能。然而，本文所述软件通过直接量化给定轨迹中的各个慢相阶段，并沿轨迹在瞬时时间点计算增益，解决了这一问题。其实现方式是将眼球运动速度与特定时刻刺激物的运动速度进行比较。由于分析不再以扫视频率作为决定性参数，用户可在监督下轻松去除噪声，从而降低噪声对分析质量的影响。这使得更多采集的数据可用于分析， 在分析这些数据时具有更高的统计效能，提高了量化眼动追踪及表征单只小鼠和不同小鼠群体OKR参数时的准确性与可重复性。已有研究采用基于Z分数法检测眼动速度快速变化的自动化扫视滤波方法来表征追踪增益10。为将该滤波方法整合至软件中，我们纳入了此类速度滤波功能，并增加了阈值参数化设置和手动扫视监督等工具，以减少该方法可能产生的误差。若分析使用原始轨迹而非自动滤波，则通过高斯核密度估计对轨迹速度进行分析，识别由扫视、眨眼或小鼠不适引起的眼动快速变化。该方法可自动选择用于分割的区域，并最终在用户手动监督下实现剔除。手动监督提高了对噪声轨迹的容忍度，使用户能够快速纠正快速眼动变化中的假阳性或假阴性标记。此外，由于 PyOKR 采用多项式近似来建模特定方向上的总体眼动，单个数据点的噪声得以平滑处理，从而使轨迹速度的评估对轨迹中的噪声具有一定的容错能力。仅当整条轨迹数据质量极差或数据采集过程中校准不当的情况下，软件才可能无法生成准确的分析结果。综上所述，通过整合用户监督、滤波处理和瞬时增益计算工具， 本文所述的 PyOKR 软件应用能够以高于以往方法的精度和更直接的度量生成眼动追踪增益结果。
PyOKR 还具备多种功能，可让用户根据自身需求自定义 OKR 分析。通过输入刺激参数以及原始刺激向量，用户能够精确定义任意所需的刺激类型。这些刺激可能包括单向、正弦或斜向刺激，软件均可利用这些信息为相应的视觉反应生成准确的追踪增益。借助该方法的刺激参数化设计，无论输入何种刺激，均可在每一帧可靠地高精度计算瞬时增益。尽管本文未分析斜向刺激数据，但可通过分解的 XY 速度向量重建斜向角度，从而准确计算斜向刺激的增益。通过对刺激设置进行灵活的参数化配置，本工具可广泛适用于对任意视觉刺激所引发的眼动追踪波形分析。此外，与以往方法相比，该软件可实现更高通量且更可重复的定量分析。传统方式中筛选 OKR 追踪波形耗时且劳动强度大，而 PyOKR 简洁的用户界面能够以远高于以往的速度快速筛查大量波形数据。这不仅加快了波形定量分析的速度，还能揭示更多 OKR 参数，包括眼球运动速度的直接定量、眼球运动的方向向量分量，以及运动向量水平和垂直分量相对于刺激的瞬时增益。此外，由于本方法可自动识别扫视眼动并计算追踪速度，因此与手动 ETM 计数或自动波形滤波等其他定量方法相比，显著降低了实验人员在数据分析中的主观偏差风险，后者可能产生假阴性结果。同时，该工具可生成大量行为学数据，并自动汇总，便于后续简化分析。通过 PyOKR 提供的数据导出与排序功能，可对多个动物在不同条件下的追踪数据进行自动处理，实现有序的数据存储以及快速的统计分析。对于在同一记录会话中采用多种实验条件的研究（例如神经环路操控或视觉反应实验），我们建议将数据采集为独立的波形文件或分段时段（epoch），以便根据该单次记录会话中提取的不同自变量保存独立的数据集。例如，在实验范式中测试不同正弦波频率引起的反应差异时，建议将不同参数保存为不同的波形文件以分别分析，如 WT_1_Freq0.1Analysis、WT_1_Freq0.2Analysis 和 WT_1_Freq0.3Analysis。在当前版本中，一旦时段完成分析，尚无法在数据集中选择特定的单个时段数值，但如有需要，未来版本可增加此功能。
最后，我们的方法可适用于多种视频眼动记录采集方法，并提供了一个稳健的分析平台，可轻松根据实验室的具体需求进行定制。通过对野生型和现有突变体的OKR数据，以及使用不同方法和刺激采集的野生型OKR数据进行分析，我们证明了该分析工具能够：a）以高准确度和高通量量化来自任意方向刺激的OKR追踪反应；b）识别由基因扰动引起的视觉系统行为差异；c）评估来自不同视频眼动记录方法的视觉追踪数据。本分析平台的易用性和广泛的适应性将促进对OKR反应的进一步研究，并有助于在眼动反应背景下表征神经回路组装与动态的行为学研究。
为了获得准确的测量结果以及后续有用的数据分析，数据采集需要经过多个步骤。我们建议在多个实验阶段中收集视动反射（OKR）数据，以使动物适应行为测试装置，并减少动物应激对行为反应的影响；然而，过度记录可能导致视动反射反应的增强13，因此在设计测试方案时需格外谨慎。在视动反射数据采集过程中，视频眼动仪设备的正确校准对于准确定量至关重要，因为所分析数据的质量直接取决于处理后的轨迹质量。重要的是，必须使用Spyder集成开发环境（IDE）以通过Matplotlib实现图形监控。鉴于本平台的可访问性和框架设计，所有必要的工具均已提供，可供其他研究者扩展软件功能，并将该平台定制用于不同的行为实验范式。
综上所述，本文介绍了一种新的、易于获取且多功能的工具，可用于比现有方法更深入、更定量地分析视动反应（OKR）行为。PyOKR 可供初学者级别的 Python 用户轻松使用，内置成熟的分析流程和界面，能够快速、准确地分析 OKR 波形，提高分析的严谨性和可重复性。该软件具有良好的适应性，为用户提供了灵活的框架，可根据其特定需求和数据采集流程进行便捷定制。我们预期，这种定量方法将推动对眼动反应的研究，进一步加深我们对驱动视觉系统行为的神经环路发育与功能的理解。
致谢
本工作得到了以下资助：R01 EY032095（ALK）、VSTP 博士前奖学金 5T32 EY7143-27（JK）、F31 EY-033225（SCH）、R01 EY035028（FAD 和 ALK）以及 R01 EY-029772（FAD）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 664 | |
| Igor Pro | WaveMetrics | RRID: SCR_000325 | |
| MATLAB | MathWorks | RRID: SCR_001622 | |
| 视动反射记录室 - JHUSOM | 定制构建 | N/A | 如 Al-Khindi 等（2022）所述9 和Kodama等人（2016）13 |
| 视动反射记录室 - UCSF | 定制构建 | N/A | 如Harris和Dunn（2015）所述10 |
| Python | Python 软件基金会 | RRID: SCR_008394 | |
| Tbx5 flox/+ 小鼠 | B. Bruneau 惠赠 | N/A | 如 Al-Khindi 等（2022）所述9 |
| Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd | MMRRC | MMRRC 货号 # 036084-UCD；RRID: MMRRC_036084-UCD |
参考文献
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