PyOKR:一种量化光动反射追踪能力的半自动方法

图像稳定功能依赖于精确的动眼神经反应来补偿自我运动过程中发生的整体光流。这种稳定主要由两种运动反应驱动:视动反射 （OKR） 和前庭眼反射 （VOR）^1,2,3。穿过视网膜的缓慢整体运动会引起 OKR，从而引起相应方向的反射性眼睛旋转以稳定图像 ^1,2。这种运动称为慢期，被代偿性扫视打断，称为快期，其中眼睛向相反方向快速重置，以允许新的慢期。在这里，我们将这些快速阶段扫视定义为眼动追踪运动 （ETM）。VOR 依靠前庭系统引发眼球运动以补偿头部运动³，而 OKR 是通过 ON 的触发和随后向中脑中的辅助视系统 （AOS） 发出信号而在视网膜中启动^{的 4,5}。由于直接依赖视网膜回路，OKR 在研究和临床环境中经常用于确定视觉跟踪能力 ^6,7。

OKR 已作为评估基本视觉能力 ^2,6,8、DSGC 发育 9、^10、11、12、动眼神经反应¹³ 和遗传背景之间的生理差异 7 的工具进行了广泛研究。在受到移动刺激的头部固定动物中评估^{OKR 14}。动眼神经反应通常使用各种视频工具捕获，眼动追踪运动被捕获为水平和垂直方向的 OKR 波形⁹。为了量化跟踪能力，已经描述了两个主要指标:跟踪增益（眼睛相对于刺激速度的速度）和 ETM 频率（在给定时间范围内快速相位扫视的数量）。增益的计算历来用于直接测量眼睛的角速度以估计跟踪能力;然而，这些计算是劳动密集型的，可以根据视频眼图采集方法和随后的量化任意推导出来。为了更快速地评估 OKR，ETM 频率计数已用作测量跟踪敏锐度⁷ 的替代方法。尽管这提供了相当准确的跟踪能力估计，但这种方法依赖于间接度量来量化慢速相位响应，并引入了许多偏差。这些因素包括观察者在扫视测定中的偏差，在设定的时期内依赖于时间一致的扫视反应，以及无法评估慢期反应的幅度。

为了用当前的 OKR 评估方法解决这些问题，并实现 OKR 参数的高吞吐量深度量化，我们开发了一种新的分析方法来量化 OKR 波形。我们的方法使用一个名为"PyOKR"的基于 Python 的可访问软件平台。使用该软件，可以更深入地研究 OKR 慢相位响应的建模和量化，并增加参数化。该软件提供可访问且可重复的对无数视觉刺激反应的定量评估，以及响应水平和垂直运动的二维视觉跟踪。

在约翰霍普金斯大学医学院 （JHUSOM） 进行的所有动物实验均已获得 JHUSOM 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。在加州大学旧金山分校 （UCSF） 进行的所有实验均按照 UCSF 机构动物护理和使用计划批准的方案进行。

1. 行为数据收集

1. 使用所选的视频眼球摄影方法记录 OKR 眼球运动，以生成波形数据（即球面坐标中眼睛注视角度的时间序列）。
   注意:在 JHUSOM 收集的代表性数据是使用头柱植入手术和视频眼球造影获得的，如前所述 ^9,13（图 1）。从 UCSF 收集的代表性数据是通过头柱植入手术和视频眼球造影方法获得的，如前面的¹⁰ 所述（图 7）。
   1. 记下刺激和记录参数:记录帧速率、刺激速度和方向，以及刺激 epoch 之间和之后的时间长度。对于正弦刺激，还要注意刺激波的振幅和频率。
2. 将收集的波次数据导出为 .包含水平和垂直（方位角和仰角）波数据的 CSV 文件。
   1. 将波次数据组织为制表符分隔的 。CSV 文件，其中两列包含水平数据 （epxWave） 和垂直数据 （epyWave）。

2. 安装分析软件

1. 下载并安装 Python。
   1. 对于图形监督，请通过 Anaconda 安装 Spyder。
   2. 要确保图形在 Spyder 中正常运行，请转到 Ipython 控制台> Tools > Preferences，>图形>图形后端。将 Inline （内联） 设置为 Automatic （自动）。
2. 使用 Python 创建新的 Anaconda 环境。
3. 通过 PyPi 安装 PyOKR，使用 pip install PyOKR 安装最新版本以及包依赖项（补充编码文件 1 和 补充编码文件 2）
4. 如果使用的是 Windows 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_win as o，然后运行 o.run（）。
5. 如果使用的是 Mac 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_osx as o，然后运行 o.run（）。

3. 波浪数据分析

1. 初始化分析和文件导入
   1. 在 .py 脚本中运行 o.run（） 以打开用户界面。
   2. 在 "文件"下，使用函数 Open 或命令 Ctrl+O [iOS 命令] 打开一个浏览器，允许用户选择所需的波形文件。
   3. 在 文件下，使用 导出文件夹 按钮或命令 Ctrl+E 打开文件夹浏览器，该浏览器将允许选择将最终分析导出到的输出文件夹。
   4. 在 Output file （输出文件） 下以推荐的格式输入最终分析文件名，例如 AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis。
   5. 使用命令 File 下的 Set Subject 或命令 Ctrl+S 为单个动物设置程序，以初始化单个动物的数据集。
2. 波形文件参数的定义
   1. 要开始设置激励参数，请在 Select stimulus direction （选择激励方向 ） 下通过选择四个基本方向之一来定义方向性。对于正弦刺激，请相应地选择一个包含 （Horizontal） 或 （Vertical） 的刺激，其中主方向定义正弦波的初始方向。
   2. 将 Select stimulus type （选择激励类型 ） 下的 stimulus type （激励类型） 设置为 Unidirectional（单向）、 Oscillatory （振荡） 或 Oblique（倾斜）。
   3. 设置方向性后，导入自己的刺激位置数据集 （Import own stimulus vector data） 或根据参数自动生成向量 （Generate stimulus vector from parameters）。如果导入刺激向量，请继续 3.2.3.1，然后跳至步骤 3.3。如果生成刺激向量，请继续执行后续步骤。
      1. 如果导入自己的矢量数据，请以步骤 3.2.1 中描述的相同格式导入刺激的距离值（即，描述刺激在每个相邻采集帧之间移动多远的时间序列）。此外，将整个数据集作为一个 epoch 进行分析，而不是将其拆分为单独的 epoch，因为从 PyOKR v1.1.2 开始，尚未添加对导入的刺激值进行子集化的功能。
   4. 在 Stimulus parameters （刺激参数） 下，设置用于数据收集的刺激的参数。
      1. 使用 Head 和 Tail 设置给定试验的开始 （head） 和结束 （tail） 无刺激的时间长度。
      2. 设置显示刺激的时间量、之后无刺激的时间量以及给定试验中的总纪元数，分别具有 Length of epoch、 Length of post-stimulus 和 Number of epochs。
      3. 对于单向和倾斜刺激，使用 Horizontal Speed 和 Vertical Speed 设置刺激速度（以度/秒为单位）。
      4. 使用 Capture frame rate 设置采集相机的采集速率。
      5. 对于正弦刺激，生成正弦波，以使用 Frequency 和 Amplitude 对振荡刺激进行建模。
   5. 参数化后，使用 Generate stimulus vector from parameters 从上面输入的刺激信息中制作合适的模型。
   6. 使用 Select epoch 为输入的刺激选择给定的 epoch 以扫描总波文件。
3. 跟踪阶段的监督选择
   1. 要识别慢速跟踪区域，请单击"未筛选的数据"或"筛选的数据"，使用"初步调整"自动选择快速相位眼跳，这将根据最大速度变化标记潜在的眼跳。
   2. 在 Unfiltered Data （未筛选的数据） 下，确认已使用蓝点准确选择扫视。如果自动选择不准确，请使用 鼠标左键 （LMB） 手动删除点，或使用 鼠标右键 （RMB） 添加点。当充分选择快速相位扫视时，使用 鼠标中键 （MMB） 保存点并关闭图形。
   3. 如果需要自动筛选，请设置 Z 分数阈值 ，然后单击 筛选的数据 以自动筛选扫视。如有必要，请使用步骤 3.3.2 中描述的相同手动监督来消除任何噪音。
   4. 正确选择眼跳后，按 Point Adjustment（点调整 ）选择要删除的区域。通过前面的步骤 3.3.2 中描述的类似控制方案来更改顶部和底部。使用 LMB 或 RMB 编辑顶部（绿色）点，使用 Shift+LMB 或 Shift+RMB 编辑底部（红色）点。正确放置点后，使用 MMB 保存点。
      注意:如果使用 Mac，则底部和顶部点调整位于两个单独的按钮中，并遵循与步骤 3.3.2 中描述的相同的控制方案。
4. 慢速跟踪阶段分析
   1. 使用 Set Polynomial Order 设置多项式模型的顺序，以定义将拟合到各个慢速相位的多项式模型。
      注意:对于单向或倾斜刺激，默认值为 1，因为线性度是计算跟踪增益所必需的。对于正弦刺激，需要更高的阶数来模拟波的曲线，默认值为 15。
   2. 要分析迹线，请选择 Final Analysis 为选定的慢相生成慢相模型（图 2）（参见图 2A-D），并计算整个时期的平均距离、速度和跟踪增益（图 2E）。
   3. 要查看所选区域的二维 （2D） 或三维 （3D） 图形，请分别选择 "查看 2D 图形 "或 "查看 3D 图形"。
   4. 选择 Add epoch 以保存在步骤 3.4.2 中生成的收集值。要查看给定动物的所有添加值以及收集的试验的平均值，请选择 View current dataset （查看当前数据集）。
   5. 添加纪元后，按照步骤 3.3.1 到 3.4.4 使用 Select epoch 循环浏览文件的其余部分。
   6. 完全分析波形文件后，通过打开新文件、设置适当的参数并相应地分析它们，对给定动物的所有其他文件重复此过程。通过对每个文件重复步骤 3.2.1-3.4.5，生成包含给定动物的所有波数据的最终数据集。
5. 数据的最终导出
   1. 完成给定动物的数据分析后，分析了所有方向或刺激，通过 Export data 导出数据集。
      注意:原始数据集将根据 输出文件名 导出，并沿 输出文件夹 设置的路径保存为 CSV，其中包含单个 epoch 数据以及每个刺激参数的总平均值。
   2. 导出单个动物后，使用 Ctrl+S 重新初始化数据集，然后重复前面的所有步骤以分析新动物。
   3. 如果需要，使用"分析"选项卡下的命令"对数据进行排序"重新组织为多只动物收集的所有输出数据，以便于分析。
      注意:此函数将编译和排序存储在输出文件夹中的所有分析动物文件的所有平均值，以便更轻松地生成图表和统计比较。排序依赖于 v1.1.2 及以上的文件命名。对每个文件使用步骤 3.1.4 中所述的推荐命名方案（例如， WT_123_Analysis）。

为了验证上述分析方法，我们量化了从野生型小鼠和具有已知跟踪缺陷的条件敲除突变体收集的波迹的 OKR 跟踪增益。此外，为了测试我们分析方法的更广泛适用性，我们分析了来自不同视频眼影采集方法获得的单独野生型小鼠队列的痕迹。扫视的自动过滤有助于 OKR 数据处理和分析（图 3）。使用来自单向和正弦刺激的记录（图 1D），我们计算了野生型动物 （n = 13） 在四个基本方向（图 2F）上对单向刺激的 OKR 跟踪增益，并跟踪响应水平和垂直正弦刺激的增益（图 4）。在所有野生型小鼠中，始终观察到单向和正弦刺激的跟踪能力相对于刺激方向的差异，具有同样稳健的水平响应，表现出明显高于垂直响应的跟踪增益，如前所述2。此外，使用两种视频眼球摄影收集方法在野生型小鼠中也观察到向上和向下响应之间的不对称跟踪增益，如之前报道的那样 2,10。与已发布的 OKR 响应特征相比，跟踪增益的相对幅度和一致性表明，使用该软件计算的跟踪增益准确反映了跟踪能力。除了单向增益计算外，还可以同时对水平和垂直眼球运动进行建模（图 5），从而允许响应给定刺激对眼球运动进行三维重建。这提供了额外的量化能力，对于未来研究交叉耦合水平和垂直响应非常有用9。

为了验证该软件在不同实验条件下识别显着行为变化的效用，我们重新分析了我们发布的数据9 ，以确认在该研究中通过手动计算快速相位扫视评估的垂直跟踪缺陷反映在使用此处介绍的方法跟踪增益中。以前的工作表明，通过使用原钙粘蛋白 9-Cre （Pcdh9-Cre） 的条件敲除转录因子 T-box 转录因子 5 （Tbx5） 在视网膜中的基因失活导致向上调谐的 ON 方向选择性神经节细胞 （up-oDSGCs） 的特异性丢失，以及 Tbx5 Flox/Flox （Tbx5f/f） ;Pcdh9-Cre 突变体表现出垂直 OKR 追踪的特异性丢失9。使用此处描述的方法进行定量分析表明，Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物保持正常的水平跟踪增益（图 6A），类似于前面描述的，并通过手动计数快速阶段扫视 （ETM） 获得的（图 2F）;然而，这些小鼠显示出垂直追踪的显着损失，对向上和向下刺激的响应增益几乎为零（图 6B，C）。此外，正弦反应分析证实 Tbx5 cKO 动物表现出更大的水平跟踪增益，同时显示垂直跟踪显着降低（图 6D-F）。使用 PyOKR 对先前描述的表型进行重新分析证明了这种新方法的精确性和敏感性，该方法允许对不同遗传菌株的小鼠的 OKR 反应进行定量比较。

最后，我们分析了在 UCSF 收集的野生型垂直 OKR 轨迹，以验证软件应用程序在不同视频眼影方法和刺激参数下的效用。来自 UCSF 的数据是使用半球投影系统收集的，其中移动光栅通过 405 nm 波长投影仪的反射呈现给小鼠，投射到头部固定动物周围的半球上10 （图 7A）。以每秒 10 度的速度向小鼠展示单向垂直格栅，并在 60 秒的间隔内记录 OKR 响应（图 7B、C）。通过 PyOKR 定量分析垂直轨迹，并将向上响应与向下响应进行比较（图 7D）。正如预期的那样，向上的反应明显强于向下的反应10;然而，与 JHUSOM 记录的跟踪相比，跟踪增益略有降低（图 2F）。此外，通过 PyOKR 分析了正弦响应的量化（图 7E），并且对正弦移动刺激的垂直响应的显着不对称性反映在计算的增益中（图 7F）。在 JHUSOM 和 UCSF 收集的增益值之间的差异可归因于刺激参数之间的差异，包括不同的刺激速度、类型和波长;然而，我们在分析使用每种收集方法获得的数据时观察到的总体一致性表明，我们的 PyOKR 可以很容易地适应我们的 JHUSOM OKR 数据收集系统之外，并应用于其他 OKR 记录，独立于视频眼图方法。这些结果表明，此处描述的软件平台是准确的，通常可以应用于动眼神经反应的研究，允许在属于不同组的动物之间进行精确的定量比较，以进一步研究视觉图像稳定电路。

图 1:OKR 反应数据的收集。（A） 用于行为刺激的 OKR 虚拟竞技场装置，如前所述 9,13。四个监视器围绕着头部固定的动物 （1），显示不断移动的棋盘刺激 （2）。虚拟鼓可以呈现所有四个基本方向的单向运动以及振荡正弦刺激。鼠标的左眼由红外 （IR） 灯照亮，并用摄像头 （3） 进行记录，以记录眼动追踪中反射的视觉系统响应。（B） 通过捕捉瞳孔和红外光产生的角膜反射来分析眼动追踪。如前所述进行数据收集和响应虚拟鼓的眼球运动计算 9,13。（C） 垂直移动 （Y 波） 和水平 （X 波） 的眼矢量示意图。（D） 眼睛对单向向上和向后运动以及垂直和水平正弦运动的跟踪响应的样本轨迹。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:单向视觉响应的跟踪分析。（A-D） 识别和选择用于增益分析的慢速跟踪阶段。单向轨迹示例显示了相对于鼠标眼睛的向前 （A）、向后 （B）、向上 （C） 和向下 （D） 运动的视觉响应。通过添加步骤 3 中描述的红点和绿点来识别慢速阶段以消除扫视，选定的慢速阶段以黄色突出显示。多项式回归作为线条叠加在轨迹上。（E） PyOKR 读数中组织的样本迹线 （A-D） 的定量。对于每条轨迹，无论方向性如何，都会计算总 XY 速度和相应的增益。在单向响应中，这些总速度通常会反映某个方向上的单个速度;但是，对于正弦响应，该值将反映眼的平均整体速度。水平和垂直速度分量被分解以显示每个相应方向的速度。然后根据呈现的刺激速度计算增益。（F） 与相关的 ETM 定量相比，野生型动物 （n = 13） 在四个基本方向上的计算跟踪增益。数据以均值± SD 表示。使用具有多重比较的单因素方差分析分析数据。*p<0.05， **p<0.01，***p<0.005， ****p<0.0001.请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:自动过滤眼跳有助于 OKR 数据处理和分析。（A-D） 自动过滤图 2A-D 中的痕迹，通过消除快速速度变化并将慢速相位拼接在一起，仅去除眼跳和慢速相位运动模型。最终斜率表示给定 epoch 上的总眼球运动。（E） 从 PyOKR 读数中组织的过滤样本数据的增益量化。（F） 未过滤与过滤的样品眼痕之间的增益值比较没有反映出显着差异。数据以均值 ± SD 表示。使用 Mann-Whitney U 检验在未过滤和过滤结果之间分析的数据。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:响应振荡视觉刺激的跟踪增益的推导。 （A，B） 垂直 （A） 和水平 （B） 眼球运动对正弦移动刺激的反应可以相对于定义的振荡刺激参数进行建模。所选区域标记为黄色，多项式近似值覆盖在迹线顶部。刺激的模型表示为轨迹后面的橙色正弦波，以便参考每个点的刺激内容。（C） 野生型正弦响应 （n = 7） 的增益计算反映了水平和垂直跟踪能力之间的不对称响应。数据以均值± SD 表示。使用具有多重比较的单因素方差分析分析数据。**p<0.01，***p<0.005. 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5: 方向跟踪可以用它的水平和垂直分量来建模。 （A） 眼动追踪波对向上刺激的垂直分量。（B） 眼动追踪波对向上刺激的水平分量。（C） 垂直和水平方向的整体眼轨迹。（D） 眼睛响应向下运动随时间变化的运动矢量的三维模型。原始跟踪数据以红色显示，轨迹的回归模型以蓝色显示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:Tbx5f/f 中的 OKR 分析;Pcdh9-Cre 小鼠在单向垂直跟踪增益方面表现出显着缺陷。（a） Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物的水平跟踪增益没有显着变化。（B，C）Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物的垂直响应:向上 （B） 和向下 （C） 的增益显着降低。（D，E）Tbx5f/f 的正弦反应;Pcdh9-Cre 动物响应水平 （D） 和垂直 （E） 振荡刺激。（f） Tbx5f/f 的定量;Pcdh9-Cre 振荡响应显示水平跟踪增益显著增加，但垂直响应减少。数据以 SD ±平均值表示。使用 Mann-Whitney U 检验分析数据。*p<0.05， **p<0.01， ****p<0.0001.请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:PyOKR 在从替代视频眼影方法获取的数据中的应用。 （A） 用于 OKR 虚拟鼓刺激的装置，如10.405 nm 波长的 DLP 投影仪通过凸面镜反射到半球上，以创建一个环绕动物视野的虚拟鼓。使用位于半球外的 NIR 相机测量眼球运动。单向和正弦条形光栅在垂直方向上向头部固定的动物显示。（B，C）确定并选择向上 （B） 和向下 （C） 跟踪阶段进行定量分析。慢速阶段以黄色突出显示。（D） 使用此处描述的方法通过垂直跟踪野生型动物 （n=5） 计算的跟踪增益。观察到不对称跟踪能力，向下跟踪显着减少。（E） 对正弦刺激的振荡反应建模以量化野生型动物的跟踪增益 （n=8）。慢速阶段以黄色突出显示。（F） 正弦增益的量化显示，与向上增益相比，向下跟踪增益较低。数据以 SD ±平均值表示。使用 Mann-Whitney U 检验分析数据。*第 <0.05 页。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充编码文件 1: PyOKR Windows 请点击这里下载此文件。

补充编码文件 2:PyOKR Mac 请点击这里下载此文件。

作者没有利益冲突。