PyOKR：一种用于量化视动反射追踪能力的半自动化方法

摘要

本文介绍了PyOKR，一种半自动化的定量分析方法，可直接测量由二维图像运动引起的视觉反应所产生的眼动。基于Python的用户界面和分析算法使得眼动追踪参数的定量测量通量更高、结果更准确，优于以往的方法。

摘要

研究视觉刺激引起的行为反应是理解视觉系统功能的关键组成部分。其中一种显著的反应是视动反射（OKR），这是一种高度保守的先天性行为，对于视网膜上图像的稳定至关重要。OKR能够可靠地反映图像追踪能力，已被广泛用于研究不同遗传背景动物的视觉系统神经回路与功能。OKR包含两个阶段：首先是慢速追踪相，即眼球跟随刺激移动至视野边缘；随后是补偿性的快速扫视相，使眼球在眼眶内复位。以往用于量化追踪增益的方法虽然可靠，但耗时费力，且可能带有主观性或依赖人为设定。为了更快速、可重复地量化眼球追踪能力，我们开发了一种新颖的 半自动化分析程序PyOKR，该程序可量化二维眼球运动对任意方向刺激的响应，并可适配于各类视频眼动记录设备。该方法提供自动化的信号滤波、慢速追踪阶段的选取、垂直与水平眼动矢量的建模、相对于刺激速度的眼动增益量化，并将结果数据整理为可用于统计分析和图形比较的电子表格格式。这一定量且流程化的分析管道可通过PyPI导入便捷获取，为OKR反应提供了快速而直接的测量手段，从而促进视觉行为反应的研究。

引言

图像稳定依赖于精确的眼动反应，以补偿在自身运动过程中产生的全局视流。这种稳定主要由两种运动反应驱动：视动反射（OKR）和前庭-眼反射（VOR）^1,2,3。视网膜上缓慢的全局运动可诱发视动反射（OKR），从而引起眼球向相应方向的反射性转动，以稳定图像^1,2。这一运动被称为慢相，其间被称为快相的补偿性扫视所中断，即眼球快速向相反方向复位，以启动下一次慢相。本文中，我们将这些快相扫视定义为眼追踪运动（ETMs）。前庭-眼反射（VOR）依赖前庭系统诱发眼球运动以补偿头部运动³，而视动反射（OKR）则由视网膜中ON细胞的放电启动，并将信号传递至中脑的辅助视系统（AOS）^4,5。由于其直接依赖于视网膜回路，视动反射（OKR）在科研和临床实践中常被用于评估视觉追踪能力^6,7。

OKR 已被广泛研究，作为评估基本....

方案

在约翰斯·霍普金斯大学医学院（JHUSOM）进行的所有动物实验均经该校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）进行的所有实验均遵循由UCSF机构动物护理和使用项目批准的协议。

1. 行为数据采集

1. 使用选定的视频眼动图方法记录OKR眼动，以生成波形数据（即眼睛注视角度在球坐标系下的时间序列）。
   注：约翰·霍普金斯大学医学院（JHUSOM）采集的代表性数据采用头杆植入手术结合视频眼动图方法获得，具体方法如前所述^9,13（图1）。加州大学旧金山分校（UCSF）采集的代表性数据也通过头杆植入手术和视频眼动图方法获得，具体方法如前文所述¹⁰（图7）。
   1. 记录刺激和记录参数：记录帧率、刺激速度和方向，以及各刺激时段之间和之后的时间长度。对于正弦刺激，还需记录刺激波形的振幅和频率。
2. 将采集的波形数据导出为包含水平和垂直方向（方位角和仰角）波形数据的.CSV文件。
   1. 将波形数据整理为制表符分隔的.CSV文件，包含两列，分别为水平方向....

结果

为验证上述分析方法，我们对来自野生型小鼠以及具有已知追踪缺陷的条件性基因敲除突变体小鼠的波动追踪数据进行了OKR追踪增益的定量分析。此外，为了检验本分析方法的广泛适用性，我们还分析了采用不同视频眼动记录方法获取的另一群野生型小鼠（n = 13）的追踪信号。自动扫视过滤功能显著促进了OKR数据的处理与分析（图3）。利用来自单向刺激和正弦刺激的记录数据（图1D），我们计算了野生型动物对单向刺激在四个正交方向上的OKR追踪增益（图2F），以及对水平和垂直方向正弦刺激的追踪增益（图4）。在所有野生型小鼠中，均一致观察到对单向和正弦刺激的追踪能力随刺激方向而变化的现象：水平方向的反应强度相当且显著高于垂直方向的追踪增益，这与已有报道一致²。此外，使用两种不同的视频眼动记录方法，均在野生型小鼠中观察到向上与向下反应之间追踪增益的不对称性，这也与先前报道相符

讨论

PyOKR 在研究反映于眼动中的视觉反应方面具有多项优势，包括准确性、易用性以及数据采集的灵活性，此外还能够整合参数化设置和可变的刺激速度。

直接评估眼动追踪增益可对眼动进行精确表征，相较于传统的快速相扫视（ETMs）人工计数方法，是一种更为直接的定量指标。尽管扫视计数具有一定用途，但它仅能间接评估实际的追踪运动。PyOKR 软件平台能够直接量化追踪速度，并综合考虑其他参数 ，包括扫视幅度和慢相持续时间。此外，快速相扫视计数依赖于在固定时间段内评估扫视频率，因此要求每条轨迹几乎无噪声，包括排除动物应激引起的随机扫视。这些因素导致大量采集到的轨迹数据无法使用，因而需要更长的数据采集时间才能准确评估眼动追踪性能。然而，本文所述软件通过直接量化给定轨迹中的各个慢相阶段，并沿轨迹在瞬时时间点计算增益，解决了这一问题。其实现方式是将眼球运动速度与特定时刻刺激物的运动速度进行比较。由于分析不再以扫视频率作为决定性参数，用户可在监督下轻松去除噪声，从而降低噪声对分析质量的影响。这使得更多采集的数据可用于分析， 在分析这些数据时具有更高的统计效能，提高了量化眼动追踪及表征单只小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J  小鼠	杰克逊实验室	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
视动反射记录室 - JHUSOM	定制构建	N/A	如 Al-Khindi 等（2022）所述9 和Kodama等人（2016）13
视动反射记录室 - UCSF	定制构建	N/A	如Harris和Dunn（2015）所述10
Python	Python 软件基金会	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ 小鼠	B. Bruneau 惠赠	N/A	如 Al-Khindi 等（2022）所述9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC 货号 # 036084-UCD；RRID: MMRRC_036084-UCD