PyOKR:一种量化光动反射追踪能力的半自动方法

摘要

我们在这里描述 PyOKR，这是一种半自动定量分析方法，可直接测量对二维图像运动的视觉反应产生的眼球运动。与以前的方法相比，基于 Python 的用户界面和分析算法可实现更高的吞吐量和更准确的眼动追踪参数定量测量。

摘要

对视觉刺激的行为反应的研究是理解视觉系统功能的关键组成部分。一个值得注意的反应是视动反射 （OKR），这是一种高度保守的先天行为，是视网膜图像稳定所必需的。OKR 提供了强大的图像跟踪读出能力，并已被广泛研究以了解来自不同遗传背景的动物的视觉系统电路和功能。OKR 包括两个阶段:当眼睛跟随刺激到达视觉平面边缘时的慢速跟踪阶段和重置眼睛在眼眶中位置的补偿性快速阶段扫视。以前的跟踪增益量化方法虽然可靠，但需要耗费大量人力，并且可能是主观的或任意推导的。为了获得更快速和可重复的眼动追踪能力量化，我们开发了一种新颖的半自动分析程序 PyOKR，除了适用于任何类型的视频眼动设备外，还可以量化响应任何方向刺激的二维眼动追踪运动。该方法提供自动过滤、慢速跟踪阶段的选择、垂直和水平眼矢量的建模、相对于刺激速度的眼球运动增益的量化，以及将结果数据组织到可用的电子表格中，用于统计和图形比较。这种定量和简化的分析管道可通过 PyPI 导入轻松访问，提供对 OKR 响应的快速直接测量，从而促进视觉行为响应的研究。

引言

图像稳定功能依赖于精确的动眼神经反应来补偿自我运动过程中发生的整体光流。这种稳定主要由两种运动反应驱动:视动反射 （OKR） 和前庭眼反射 （VOR）^1,2,3。穿过视网膜的缓慢整体运动会引起 OKR，从而引起相应方向的反射性眼睛旋转以稳定图像 ^1,2。这种运动称为慢期，被代偿性扫视打断，称为快期，其中眼睛向相反方向快速重置，以允许新的慢期。在这里，我们将这些快速阶段扫视定义为眼动追踪运动 （ETM）。VOR 依靠前庭系统引发眼球运动以补偿头部运动³，而 OKR 是通过 ON 的触发和随后向中脑中的辅助视系统 （AOS） 发出信号而在视网膜中启动^{的 4,5}。由于直接依赖视网膜回路，OKR 在研究和临床环境中经常用于确定视觉跟踪能力 ^6,7。

OKR 已作为评估基本视觉能力 ^2,6,8、DSGC 发育 9、^10、11、12、动眼神经反应¹³ 和遗传背景之间的生理差异 7 的工具进行了广泛研究。在受到移动刺激的头部固定动物中评估^{OKR 14}。动眼神经反应通常使用各种视频工具捕获，眼动追踪运动被捕获为水平和垂直方向的 OKR 波形⁹。为了量化跟踪能力，已经描述了两个主要指标:跟踪增益（眼睛相对于刺激速度的速度）和 ETM 频率（在给定时间范围内快速相位扫视的数量）。增益的计算历来用于直接测量眼睛的角速度以估计跟踪能力;然而，这些计算是劳动密集型的，可以根据视频眼图采集方法和随后的量化任意推导出来。为了更快速地评估 OKR，ETM 频率计数已用作测量跟踪敏锐度⁷ 的替代方法。尽管这提供了相当准确的跟踪能力估计，但这种方法依赖于间接度量来量化慢速相位响应，并引入了许多偏差。这些因素包括观察者在扫视测定中的偏差，在设定的时期内依赖于时间一致的扫视反应，以及无法评估慢期反应的幅度。

为了用当前的 OKR 评估方法解决这些问题，并实现 OKR 参数的高吞吐量深度量化，我们开发了一种新的分析方法来量化 OKR 波形。我们的方法使用一个名为"PyOKR"的基于 Python 的可访问软件平台。使用该软件，可以更深入地研究 OKR 慢相位响应的建模和量化，并增加参数化。该软件提供可访问且可重复的对无数视觉刺激反应的定量评估，以及响应水平和垂直运动的二维视觉跟踪。

方案

在约翰霍普金斯大学医学院 （JHUSOM） 进行的所有动物实验均已获得 JHUSOM 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。在加州大学旧金山分校 （UCSF） 进行的所有实验均按照 UCSF 机构动物护理和使用计划批准的方案进行。

1. 行为数据收集

1. 使用所选的视频眼球摄影方法记录 OKR 眼球运动，以生成波形数据（即球面坐标中眼睛注视角度的时间序列）。
   注意:在 JHUSOM 收集的代表性数据是使用头柱植入手术和视频眼球造影获得的，如前所述 ^9,13（图 1）。从 UCSF 收集的代表性数据是通过头柱植入手术和视频眼球造影方法获得的，如前面的¹⁰ 所述（图 7）。
   1. 记下刺激和记录参数:记录帧速率、刺激速度和方向，以及刺激 epoch 之间和之后的时间长度。对于正弦刺激，还要注意刺激波的振幅和频率。
2. 将收集的波次数据导出为 .包含水平和垂直（方位角和仰角）波数据的 CSV 文件。
   1. 将波次数据组织为制表符分隔的 。CSV 文件，其中两列包含水平数据 （epxWave） 和垂直数据 （epyWave）。

2. 安装分析软件

1. 下载并安装 Python。
   1. 对于图形监督，请通过 Anaconda 安装 Spyder。
   2. 要确保图形在 Spyder 中正常运行，请转到 Ipython 控制台> Tools > Preferences，>图形>图形后端。将 Inline （内联） 设置为 Automatic （自动）。
2. 使用 Python 创建新的 Anaconda 环境。
3. 通过 PyPi 安装 PyOKR，使用 pip install PyOKR 安装最新版本以及包依赖项（补充编码文件 1 和 补充编码文件 2）
4. 如果使用的是 Windows 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_win as o，然后运行 o.run（）。
5. 如果使用的是 Mac 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_osx as o，然后运行 o.run（）。

3. 波浪数据分析

1. 初始化分析和文件导入
   1. 在 .py 脚本中运行 o.run（） 以打开用户界面。
   2. 在 "文件"下，使用函数 Open 或命令 Ctrl+O [iOS 命令] 打开一个浏览器，允许用户选择所需的波形文件。
   3. 在 文件下，使用 导出文件夹 按钮或命令 Ctrl+E 打开文件夹浏览器，该浏览器将允许选择将最终分析导出到的输出文件夹。
   4. 在 Output file （输出文件） 下以推荐的格式输入最终分析文件名，例如 AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis。
   5. 使用命令 File 下的 Set Subject 或命令 Ctrl+S 为单个动物设置程序，以初始化单个动物的数据集。
2. 波形文件参数的定义
   1. 要开始设置激励参数，请在 Select stimulus direction （选择激励方向 ） 下通过选择四个基本方向之一来定义方向性。对于正弦刺激，请相应地选择一个包含 （Horizontal） 或 （Vertical） 的刺激，其中主方向定义正弦波的初始方向。
   2. 将 Select stimulus type （选择激励类型 ） 下的 stimulus type （激励类型） 设置为 Unidirectional（单向）、 Oscillatory （振荡） 或 Oblique（倾斜）。
   3. 设置方向性后，导入自己的刺激位置数据集 （Import own stimulus vector data） 或根据参数自动生成向量 （Generate stimulus vector from parameters）。如果导入刺激向量，请继续 3.2.3.1，然后跳至步骤 3.3。如果生成刺激向量，请继续执行后续步骤。
      1. 如果导入自己的矢量数据，请以步骤 3.2.1 中描述的相同格式导入刺激的距离值（即，描述刺激在每个相邻采集帧之间移动多远的时间序列）。此外，将整个数据集作为一个 epoch 进行分析，而不是将其拆分为单独的 epoch，因为从 PyOKR v1.1.2 开始，尚未添加对导入的刺激值进行子集化的功能。
   4. 在 Stimulus parameters （刺激参数） 下，设置用于数据收集的刺激的参数。
      1. 使用 Head 和 Tail 设置给定试验的开始 （head） 和结束 （tail） 无刺激的时间长度。
      2. 设置显示刺激的时间量、之后无刺激的时间量以及给定试验中的总纪元数，分别具有 Length of epoch、 Length of post-stimulus 和 Number of epochs。
      3. 对于单向和倾斜刺激，使用 Horizontal Speed 和 Vertical Speed 设置刺激速度（以度/秒为单位）。
      4. 使用 Capture frame rate 设置采集相机的采集速率。
      5. 对于正弦刺激，生成正弦波，以使用 Frequency 和 Amplitude 对振荡刺激进行建模。
   5. 参数化后，使用 Generate stimulus vector from parameters 从上面输入的刺激信息中制作合适的模型。
   6. 使用 Select epoch 为输入的刺激选择给定的 epoch 以扫描总波文件。
3. 跟踪阶段的监督选择
   1. 要识别慢速跟踪区域，请单击"未筛选的数据"或"筛选的数据"，使用"初步调整"自动选择快速相位眼跳，这将根据最大速度变化标记潜在的眼跳。
   2. 在 Unfiltered Data （未筛选的数据） 下，确认已使用蓝点准确选择扫视。如果自动选择不准确，请使用 鼠标左键 （LMB） 手动删除点，或使用 鼠标右键 （RMB） 添加点。当充分选择快速相位扫视时，使用 鼠标中键 （MMB） 保存点并关闭图形。
   3. 如果需要自动筛选，请设置 Z 分数阈值 ，然后单击 筛选的数据 以自动筛选扫视。如有必要，请使用步骤 3.3.2 中描述的相同手动监督来消除任何噪音。
   4. 正确选择眼跳后，按 Point Adjustment（点调整 ）选择要删除的区域。通过前面的步骤 3.3.2 中描述的类似控制方案来更改顶部和底部。使用 LMB 或 RMB 编辑顶部（绿色）点，使用 Shift+LMB 或 Shift+RMB 编辑底部（红色）点。正确放置点后，使用 MMB 保存点。
      注意:如果使用 Mac，则底部和顶部点调整位于两个单独的按钮中，并遵循与步骤 3.3.2 中描述的相同的控制方案。
4. 慢速跟踪阶段分析
   1. 使用 Set Polynomial Order 设置多项式模型的顺序，以定义将拟合到各个慢速相位的多项式模型。
      注意:对于单向或倾斜刺激，默认值为 1，因为线性度是计算跟踪增益所必需的。对于正弦刺激，需要更高的阶数来模拟波的曲线，默认值为 15。
   2. 要分析迹线，请选择 Final Analysis 为选定的慢相生成慢相模型（图 2）（参见图 2A-D），并计算整个时期的平均距离、速度和跟踪增益（图 2E）。
   3. 要查看所选区域的二维 （2D） 或三维 （3D） 图形，请分别选择 "查看 2D 图形 "或 "查看 3D 图形"。
   4. 选择 Add epoch 以保存在步骤 3.4.2 中生成的收集值。要查看给定动物的所有添加值以及收集的试验的平均值，请选择 View current dataset （查看当前数据集）。
   5. 添加纪元后，按照步骤 3.3.1 到 3.4.4 使用 Select epoch 循环浏览文件的其余部分。
   6. 完全分析波形文件后，通过打开新文件、设置适当的参数并相应地分析它们，对给定动物的所有其他文件重复此过程。通过对每个文件重复步骤 3.2.1-3.4.5，生成包含给定动物的所有波数据的最终数据集。
5. 数据的最终导出
   1. 完成给定动物的数据分析后，分析了所有方向或刺激，通过 Export data 导出数据集。
      注意:原始数据集将根据 输出文件名 导出，并沿 输出文件夹 设置的路径保存为 CSV，其中包含单个 epoch 数据以及每个刺激参数的总平均值。
   2. 导出单个动物后，使用 Ctrl+S 重新初始化数据集，然后重复前面的所有步骤以分析新动物。
   3. 如果需要，使用"分析"选项卡下的命令"对数据进行排序"重新组织为多只动物收集的所有输出数据，以便于分析。
      注意:此函数将编译和排序存储在输出文件夹中的所有分析动物文件的所有平均值，以便更轻松地生成图表和统计比较。排序依赖于 v1.1.2 及以上的文件命名。对每个文件使用步骤 3.1.4 中所述的推荐命名方案（例如， WT_123_Analysis）。

结果

为了验证上述分析方法，我们量化了从野生型小鼠和具有已知跟踪缺陷的条件敲除突变体收集的波迹的 OKR 跟踪增益。此外，为了测试我们分析方法的更广泛适用性，我们分析了来自不同视频眼影采集方法获得的单独野生型小鼠队列的痕迹。扫视的自动过滤有助于 OKR 数据处理和分析（图 3）。使用来自单向和正弦刺激的记录（图 1D），我们计算了野生型动物 （n = 13） 在四个基本方向（图 2F）上对单向刺激的 OKR 跟踪增益，并跟踪响应水平和垂直正弦刺激的增益（图 4）。在所有野生型小鼠中，始终观察到单向和正弦刺激的跟踪能力相对于刺激方向的差异，具有同样稳健的水平响应，表现出明显高于垂直响应的跟踪增益，如前所述²。此外，使用两种视频眼球摄影收集方法在野生型小鼠中也观察到向上和向下响应之间的不对称跟踪增益，如之前报道的那样 ^2,10。与已发布的 OKR 响应特征相比，跟踪增益的相对幅度和一致性表明，使用该软件计算的跟踪增益准确反映了跟踪能力。除了单向增益计算外，还可以同时对水平和垂直眼球运动进行建模（图 5），从而允许响应给定刺激对眼球运动进行三维重建。这提供了额外的量化能力，对于未来研究交叉耦合水平和垂直响应非常有用⁹。

为了验证该软件在不同实验条件下识别显着行为变化的效用，我们重新分析了我们发布的数据⁹ ，以确认在该研究中通过手动计算快速相位扫视评估的垂直跟踪缺陷反映在使用此处介绍的方法跟踪增益中。以前的工作表明，通过使用原钙粘蛋白 9-Cre （Pcdh9-Cre） 的条件敲除转录因子 T-box 转录因子 5 （Tbx5） 在视网膜中的基因失活导致向上调谐的 ON 方向选择性神经节细胞 （up-oDSGCs） 的特异性丢失，以及 Tbx5 Flox/Flox （Tbx5f/f） ;Pcdh9-Cre 突变体表现出垂直 OKR 追踪的特异性丢失⁹。使用此处描述的方法进行定量分析表明，Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物保持正常的水平跟踪增益（图 6A），类似于前面描述的，并通过手动计数快速阶段扫视 （ETM） 获得的（图 2F）;然而，这些小鼠显示出垂直追踪的显着损失，对向上和向下刺激的响应增益几乎为零（图 6B，C）。此外，正弦反应分析证实 Tbx5 cKO 动物表现出更大的水平跟踪增益，同时显示垂直跟踪显着降低（图 6D-F）。使用 PyOKR 对先前描述的表型进行重新分析证明了这种新方法的精确性和敏感性，该方法允许对不同遗传菌株的小鼠的 OKR 反应进行定量比较。

最后，我们分析了在 UCSF 收集的野生型垂直 OKR 轨迹，以验证软件应用程序在不同视频眼影方法和刺激参数下的效用。来自 UCSF 的数据是使用半球投影系统收集的，其中移动光栅通过 405 nm 波长投影仪的反射呈现给小鼠，投射到头部固定动物周围的半球上¹⁰ （图 7A）。以每秒 10 度的速度向小鼠展示单向垂直格栅，并在 60 秒的间隔内记录 OKR 响应（图 7B、C）。通过 PyOKR 定量分析垂直轨迹，并将向上响应与向下响应进行比较（图 7D）。正如预期的那样，向上的反应明显强于向下的反应¹⁰;然而，与 JHUSOM 记录的跟踪相比，跟踪增益略有降低（图 2F）。此外，通过 PyOKR 分析了正弦响应的量化（图 7E），并且对正弦移动刺激的垂直响应的显着不对称性反映在计算的增益中（图 7F）。在 JHUSOM 和 UCSF 收集的增益值之间的差异可归因于刺激参数之间的差异，包括不同的刺激速度、类型和波长;然而，我们在分析使用每种收集方法获得的数据时观察到的总体一致性表明，我们的 PyOKR 可以很容易地适应我们的 JHUSOM OKR 数据收集系统之外，并应用于其他 OKR 记录，独立于视频眼图方法。这些结果表明，此处描述的软件平台是准确的，通常可以应用于动眼神经反应的研究，允许在属于不同组的动物之间进行精确的定量比较，以进一步研究视觉图像稳定电路。

图 1:OKR 反应数据的收集。（A） 用于行为刺激的 OKR 虚拟竞技场装置，如前所述 ^9,13。四个监视器围绕着头部固定的动物 （1），显示不断移动的棋盘刺激 （2）。虚拟鼓可以呈现所有四个基本方向的单向运动以及振荡正弦刺激。鼠标的左眼由红外 （IR） 灯照亮，并用摄像头 （3） 进行记录，以记录眼动追踪中反射的视觉系统响应。（B） 通过捕捉瞳孔和红外光产生的角膜反射来分析眼动追踪。如前所述进行数据收集和响应虚拟鼓的眼球运动计算 ^9,13。（C） 垂直移动 （Y 波） 和水平 （X 波） 的眼矢量示意图。（D） 眼睛对单向向上和向后运动以及垂直和水平正弦运动的跟踪响应的样本轨迹。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:单向视觉响应的跟踪分析。（A-D） 识别和选择用于增益分析的慢速跟踪阶段。单向轨迹示例显示了相对于鼠标眼睛的向前 （A）、向后 （B）、向上 （C） 和向下 （D） 运动的视觉响应。通过添加步骤 3 中描述的红点和绿点来识别慢速阶段以消除扫视，选定的慢速阶段以黄色突出显示。多项式回归作为线条叠加在轨迹上。（E） PyOKR 读数中组织的样本迹线 （A-D） 的定量。对于每条轨迹，无论方向性如何，都会计算总 XY 速度和相应的增益。在单向响应中，这些总速度通常会反映某个方向上的单个速度;但是，对于正弦响应，该值将反映眼的平均整体速度。水平和垂直速度分量被分解以显示每个相应方向的速度。然后根据呈现的刺激速度计算增益。（F） 与相关的 ETM 定量相比，野生型动物 （n = 13） 在四个基本方向上的计算跟踪增益。数据以均值± SD 表示。使用具有多重比较的单因素方差分析分析数据。*p<0.05， **p<0.01，***p<0.005， ****p<0.0001.请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:自动过滤眼跳有助于 OKR 数据处理和分析。（A-D） 自动过滤图 2A-D 中的痕迹，通过消除快速速度变化并将慢速相位拼接在一起，仅去除眼跳和慢速相位运动模型。最终斜率表示给定 epoch 上的总眼球运动。（E） 从 PyOKR 读数中组织的过滤样本数据的增益量化。（F） 未过滤与过滤的样品眼痕之间的增益值比较没有反映出显着差异。数据以均值 ± SD 表示。使用 Mann-Whitney U 检验在未过滤和过滤结果之间分析的数据。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:响应振荡视觉刺激的跟踪增益的推导。 （A，B） 垂直 （A） 和水平 （B） 眼球运动对正弦移动刺激的反应可以相对于定义的振荡刺激参数进行建模。所选区域标记为黄色，多项式近似值覆盖在迹线顶部。刺激的模型表示为轨迹后面的橙色正弦波，以便参考每个点的刺激内容。（C） 野生型正弦响应 （n = 7） 的增益计算反映了水平和垂直跟踪能力之间的不对称响应。数据以均值± SD 表示。使用具有多重比较的单因素方差分析分析数据。**p<0.01，***p<0.005. 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5: 方向跟踪可以用它的水平和垂直分量来建模。 （A） 眼动追踪波对向上刺激的垂直分量。（B） 眼动追踪波对向上刺激的水平分量。（C） 垂直和水平方向的整体眼轨迹。（D） 眼睛响应向下运动随时间变化的运动矢量的三维模型。原始跟踪数据以红色显示，轨迹的回归模型以蓝色显示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:Tbx5f/f 中的 OKR 分析;Pcdh9-Cre 小鼠在单向垂直跟踪增益方面表现出显着缺陷。（a） Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物的水平跟踪增益没有显着变化。（B，C）Tbx5f/f;Pcdh9-Cre 动物的垂直响应:向上 （B） 和向下 （C） 的增益显着降低。（D，E）Tbx5f/f 的正弦反应;Pcdh9-Cre 动物响应水平 （D） 和垂直 （E） 振荡刺激。（f） Tbx5f/f 的定量;Pcdh9-Cre 振荡响应显示水平跟踪增益显著增加，但垂直响应减少。数据以 SD ±平均值表示。使用 Mann-Whitney U 检验分析数据。*p<0.05， **p<0.01， ****p<0.0001.请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:PyOKR 在从替代视频眼影方法获取的数据中的应用。 （A） 用于 OKR 虚拟鼓刺激的装置，如¹⁰.405 nm 波长的 DLP 投影仪通过凸面镜反射到半球上，以创建一个环绕动物视野的虚拟鼓。使用位于半球外的 NIR 相机测量眼球运动。单向和正弦条形光栅在垂直方向上向头部固定的动物显示。（B，C）确定并选择向上 （B） 和向下 （C） 跟踪阶段进行定量分析。慢速阶段以黄色突出显示。（D） 使用此处描述的方法通过垂直跟踪野生型动物 （n=5） 计算的跟踪增益。观察到不对称跟踪能力，向下跟踪显着减少。（E） 对正弦刺激的振荡反应建模以量化野生型动物的跟踪增益 （n=8）。慢速阶段以黄色突出显示。（F） 正弦增益的量化显示，与向上增益相比，向下跟踪增益较低。数据以 SD ±平均值表示。使用 Mann-Whitney U 检验分析数据。*第 <0.05 页。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充编码文件 1: PyOKR Windows 请点击这里下载此文件。

补充编码文件 2:PyOKR Mac 请点击这里下载此文件。

讨论

PyOKR 为研究眼球运动中反映的视觉反应提供了几个优势。这些功能包括准确性、可访问性和数据收集选项，以及整合参数化和可变刺激速度的能力。

直接眼动追踪增益评估提供了准确的眼动特征，与传统的快速相位眼跳 （ETM） 手动计数相比，这是一个更直接的定量指标。尽管扫视计数很有用，但它提供了对实际跟踪运动的间接评估。PyOKR 软件平台提供跟踪速度的直接量化，同时考虑了包括扫视幅度和慢速相位长度在内的其他参数。此外，快速相位扫视计数依赖于对设定时间段内扫视频率的评估，要求每条轨迹几乎没有噪声，包括动物应激引起的随机扫视。这些因素导致许多收集到的痕迹无法使用，因此增加了大量的数据收集时间，以便准确评估眼动追踪。但是，此处描述的软件通过直接量化给定迹线中的单个慢相并计算沿迹线的瞬时点的增益来解决此问题。它通过将眼球运动的速度与给定点的刺激速度进行比较来实现这一点。由于扫视频率不再是分析的决定参数，因此可以通过用户监督轻松去除噪声，从而减少噪声对分析质量的影响。这允许在分析这些数据时收集更多可用的数据，并在分析这些数据时具有更高的统计能力，在量化眼动追踪和表征单个小鼠和不同小鼠组的 OKR 参数时，可以提高准确性和可重复性。根据通过 Z 分数方法发现的眼速快速变化自动过滤扫视也被用于表征跟踪增益¹⁰。为了将这种过滤方法整合到软件中，我们加入了这种类型的速度过滤，但增加了一些工具，如阈值参数化和手动扫视监督，以减少这种方法产生的潜在误差。如果使用原始轨迹进行分析而不是使用自动过滤，则通过轨迹速度的高斯核密度估计，通过最大速度变化来识别由扫视、眨眼或鼠标痛苦引起的眼球运动的快速变化。这允许自动选择分割区域，并最终根据用户的手动监督进行删除。手动监控提供了更高的对噪声痕迹的容忍度，使用户能够快速纠正假阳性或假阴性标记，以便快速更换眼睛。此外，由于 PyOKR 使用多项式近似来模拟给定方向上的一般眼球运动，因此各个点的噪声被平滑化，从而允许评估轨迹速度，并对轨迹中的噪声有一定的容忍度。只有在整个迹线的数据质量极差或数据收集过程中校准不当的情况下，软件才能生成准确的数据分析。综上所述，通过结合用户监督、滤波和瞬时增益计算工具，此处描述的 PyOKR 软件应用程序生成的跟踪增益比以前的方法准确率高，指标更直接。

PyOKR 还具有许多功能，允许自定义 OKR 分析以满足用户需求。刺激参数的输入以及原始刺激向量允许用户精确定义任何所需的刺激。这些可能包括单向、正弦或倾斜刺激，软件可以使用所有这些刺激为相关的视觉响应生成准确的跟踪增益。通过这种方法的激励参数化，无论输入的激励如何，都可以可靠地、高精度地生成在每一帧计算的瞬时增益。虽然这里没有分析倾斜刺激数据，但可以通过分解的 XY 速度向量来计算准确的增益，以重建倾斜角，从而允许对倾斜刺激进行准确的增益计算。通过刺激设置的可访问参数化，我们的工具广泛适用于响应任何视觉刺激的波追踪。此外，与以前的方法相比，该软件有助于实现更高的通量和可重现的定量。对 OKR 跟踪进行排序既耗时又费力;但是，PyOKR 简化的用户界面能够以比以前更高的速率轻松筛选许多跟踪。这不仅可以实现更快的轨迹量化，还可以揭示其他 OKR 参数，包括眼速的直接量化、眼球运动的方向矢量分量以及运动矢量的水平和垂直分量中相对于刺激的瞬时增益。此外，鉴于我们的方法提供了扫视的自动识别和跟踪速度的计算，与其他可能产生假阴性的量化方法（例如手动 ETM 计数或自动跟踪过滤）相比，数据分析中潜在的实验者偏差大大减少。此外，可以生成并自动编译大量行为数据，以简化下游分析。通过 PyOKR 中提供的数据导出和排序功能，可以自动处理跨多个动物和条件的跟踪数据，以实现有组织的数据存储和快速统计分析。对于在同一记录会话期间采用多种条件的实验，例如电路操纵或视觉响应，我们建议在离散波形文件或子集 epoch 中收集数据，以允许根据从单个记录会话中得出的感兴趣的自变量存储单独的数据集。例如，如果在实验范式中测试对不同正弦波频率的响应差异，我们建议将不同的参数保存到不同的波文件中以进行单独分析，例如 WT_1_Freq0.1Analysis、WT_1_Freq0.2Analysis 和 WT_1_Freq0.3Analysis。在当前版本中，一旦分析了 epoch，就没有在数据集中选择单个 epoch 值的功能，但如有必要，可以在将来添加此功能。

最后，我们的方法适用于多种视频眼图采集方法，并提供了一个强大的分析平台，可以很容易地根据实验室的特定需求进行定制。通过分析野生型和现有突变型 OKR 数据，以及使用不同方法和刺激收集的野生型 OKR 数据，我们在这里表明我们的分析工具能够 a） 以高精度和吞吐量量化来自任何方向刺激的 OKR 跟踪;b） 识别由遗传扰动引起的视觉系统行为差异;c） 评估来自不同视频眼影方法的视觉跟踪数据。我们分析平台的可访问性和一般适应性有助于进一步研究 OKR 反应，并将加强在动眼神经反应背景下表征神经回路组装和动力学的行为研究。

为了获得准确的测量和随后的有用数据分析，数据收集需要几个步骤。我们建议在多个会话中收集 OKR 数据，以使动物适应行为测试设备并减少动物压力对行为反应的影响;但是，过度记录可能会导致 OKR 反应¹³ 的增强，因此建议在设计测试制度时谨慎。在 OKR 数据收集期间，正确校准视频眼影设备对于准确量化至关重要，因为分析数据的质量是处理痕迹的直接函数。重要的是，使用 Spyder IDE 对于通过 Matplotlib 进行图形监督是必要的。鉴于我们平台的可访问性和框架设计，其他人可以使用所有必要的工具来扩展软件的功能并为不同的行为实验范式定制该平台。

总之，我们在这里描述了一种新的、可访问的、多功能的工具，用于比目前使用现有方法更深入、更具定量能力地分析 OKR 行为反应。PyOKR 可供 Python 新手用户轻松使用，并包含已建立的分析管道和接口，用于快速准确地分析 OKR 波，具有更高的严谨性和可重复性。该软件的适应性提供了一个灵活的框架，用户可以轻松定制以适应他们的特定需求和数据收集程序。我们预计这种定量方法将推进动眼神经反应的研究，并进一步了解驱动视觉系统行为的神经回路的发育和功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J  小鼠	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID： SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID： SCR_001622
视动反射记录室 - JHUSOM	定制	N/A	如 Al-Khindi 等人（2022）9 和 Kodama 等人 （2016）所述13
视动反射记录室 - UCSF	定制	N/A	如 Harris 和 Dunn， 201510
>Python	Python 软件基金会	RRID： SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	来自 B. Bruneau 的礼物	N/A	如 Al-Khindi 等人（2022）所述9
Tg（Pcdh9-cre）NP276Gsat/mmucd	MMRRC	MMRRC 股票 # 036084-UCD;RRID： MMRRC_036084-UCD