本研究描述了一种结合磁共振成像（MRI）与低强度脉冲聚焦超声（FUS）的方案，利用颈静脉插管的活体大鼠来监测血脑屏障（BBB）的开放情况。
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摘要
摘要
大脑具有高度选择性的半透性血脑屏障（blood-brain barrier, BBB），可阻止治疗性大分子药物递送至脑组织。将磁共振引导的低强度脉冲聚焦超声（FUS）与微泡预注射相结合，是一种具有前景的无创、无毒的血脑屏障调控技术。磁共振成像（MRI）能够提供优异的软组织对比度，并实现多种定量评估，如血管通透性、灌注情况以及MRI对比剂在时空上的分布。值得注意的是，基于钆类MRI对比剂的增强MRI技术已被证实为检测血脑屏障开放的金标准。本研究概述了一套完整的方法学流程，包括用于监测大鼠模型中血脑屏障开放的MRI扫描方案和动物实验操作。大鼠模型具有可利用颈静脉导管的优势，便于快速给药。采用立体定位引导的临床前FUS换能器，有助于优化和简化动物实验操作及MRI扫描流程。所建立的方法具有良好的可重复性和操作简便性，无需依赖专业的外科手术技能。本研究致力于推动大鼠模型在临床前研究中的流程优化，并促进针对血脑屏障调控的进一步探索，以增强神经系统疾病治疗的干预效果。
引言
血脑屏障（BBB）调控离子、分子和细胞在血管与脑组织之间的移动1。这一功能有助于维持神经元的正常功能和健康，但同时也阻碍了治疗性大分子药物向脑组织的递送。由于血脑屏障通透性有限，可能导致针对脑肿瘤和神经退行性疾病（如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病）的治疗效果降低2。因此，已有多种策略被研究用于绕过血脑屏障，以实现治疗剂的可控递送，这些方法包括对流增强递送、直接颅内注射、渗透压破坏法以及药物设计优化等3,4,5。
然而，这些方法存在固有的局限性，例如侵入性、感染风险、出血风险、异质性以及药物的快速外排。结合微泡注射的低强度脉冲聚焦超声（FUS）是一种有前景的非侵入性技术，可实现局部化且可逆的血脑屏障（BBB）开放。超声与微泡耦合产生的机械效应能够暂时改变血脑屏障的通透性（即血脑屏障开放）6,7。为了进一步推动利用血脑屏障开放的治疗应用，体内小动物实验至关重要。
本研究介绍了用于监测大鼠模型血脑屏障（BBB）开放的磁共振成像（MRI）方案及动物操作流程。该方案采用由商业机构植入颈静脉导管的大鼠模型（参见材料表）。颈静脉导管植入大鼠模型具有快速给药、血流动力学监测以及导管稳定性良好等潜在优势。血脑屏障的开放通过临床前聚焦超声（FUS）系统实现。该系统专为大鼠和小鼠等小型动物模型的血脑屏障开放而设计，包含台式系统、控制计算机、换能器、水脱气装置及配套附件等关键组件。使用该立体定向引导的临床前FUS系统不仅提高了操作精度，还简化了动物实验流程和MRI检测方案，有助于提升整体实验方案的可重复性与简便性。
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方案
本研究中的所有动物实验均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。实验使用雄性Sprague-Dawley大鼠（200–250 g）。大鼠的饲养与护理均遵循美国国立卫生研究院动物照护与使用办公室关于小鼠和大鼠的指导原则。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 动物准备
注意：对于内部操作流程，需将动物转运至准备室，并按如下步骤进行操作：
- 将大鼠单独放入亚克力舱内，使用来自医用氧气罐的氧气混合异氟烷（2%-3%）进行暴露，直至大鼠失去意识（遵循机构批准的实验方案）。
注意：使用异氟烷麻醉可支持长期磁共振成像（MRI）实验方案的实施。 - 将大鼠从舱内取出，使用脱毛膏去除颈部前侧和后侧的毛发。
- 在眼睛表面涂抹润滑眼膏。
- 将大鼠的鼻部置入鼻罩，以维持自主呼吸下的麻醉状态（异氟烷蒸发器浓度设定为2%-2.5%，氧气流量计调节至1-1.5 L/min）。
- 将麻醉后的大鼠置于加热的手术台上，并通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。
注意：MRI实验方案包括对比增强序列，例如T1加权梯度回波成像和T2加权自旋回波成像。这些序列在注射钆（GAD）类对比剂前后均需进行，以评估血脑屏障（BBB）通透性。该过程涉及在大鼠处于MRI扫描仪内时给予GAD对比剂7。为便于操作，使用从大鼠体内留置导管引出的延长导管。该延长装置包括一个导管连接器和一段长度为30 cm的聚乙烯导管。为确保导管通畅并防止泄漏，需用肝素化甘油（250 IU 肝素/1 mL 甘油）冲洗延长导管。
2. 立体定向引导的聚焦超声系统
注意：将动物转移并放置在立体定位聚焦超声（FUS）系统的桌面上。将大鼠的鼻子放入鼻罩中以维持麻醉状态。该FUS系统包括一个函数发生器、一个射频放大器和一个示波器。在设置换能器之前，我们确保所有设备均已正确连接至系统。换能器的安装通过以下步骤完成：
- 将尖头指针置于颅骨上的前囟位置，并记录该位置。前囟的位置可通过在中线上找到人字缝前方9.0 mm处来确定8。人字缝位于双侧鼓膜连线的中点9。
- 在大鼠头部、水耦合袋和换能器（1 MHz频率）上涂抹超声耦合凝胶。确保大鼠皮肤、水耦合袋与换能器之间无气泡存在。
- 将换能器的同轴BNC电缆连接至FUS系统模块的输入端口。
- 在控制计算机上，点击加载以调用预先注册的大鼠图像；随后选择多个焦点位置和声压参数。
- 在控制计算机上，点击治疗模块中的运动测试，以确认换能器可在脉冲周期内于各焦点之间正常移动。
- 设置步骤3中所述的声照射参数。
3. 微泡输注与超声处理
- 激活微泡。
注意：本研究中使用的微泡直径为 1.7 µm，浓度为每毫升 0.2 × 109 个颗粒10。微泡小瓶的激活依据供应商提供的使用说明以及先前发表的报告进行11。- 准备一支带有鲁尔锁头的 5 mL 注射器，并装入 5 mL 无添加剂的 0.9% 氯化钠注射液。
- 取下绿色瓶帽，将注射器通过顺时针旋转连接至带通气孔的分配针（见材料表）。
- 取下针头保护帽，将其置于小瓶橡胶塞的中心位置，并用力下压，直至穿刺针完全插入塞子中。
- 推动推杆，将整个 5 mL 注射器中的液体全部注入小瓶内。
- 用力振荡小瓶 20 秒，使内容物充分混合。当出现均匀的白色乳状液体时，表明已形成六氟化硫脂质微球。
- 为获得所需剂量，将小瓶倒置，缓慢将适量悬浮液抽入一支 5 mL 注射器中。
- 使用输液泵。
注意：采用输注方法12，通过注射泵向大鼠输送微泡。将含有微泡的注射器连接至插入大鼠体内的导管接头，微泡经聚乙烯管输送，输液泵流速设定为 0.66 mL/min。该输注速率可在 3 分钟内从 3 mL 注射器中注入 2 mL 微泡。输注在超声照射开始前 1 分钟启动，并持续整个 2 分钟的超声照射过程。 - 进行超声照射。
注意：本研究中选用的聚焦超声（FUS）脉冲参数如下：（1）靶向区域：左侧海马体；（2）照射点数量：6 个，以覆盖脑内海马体区域；（3）脉冲持续时间：10 ms；（4）脉冲周期：1200 ms；（5）声压：0.65 MPa；（6）聚焦超声系统中“超声照射模式”菜单下的“脉冲模式”；（7）超声照射时间：120 秒。
4. 使用3T临床前扫描仪进行MRI操作流程
- 超声处理后，将动物转移至预临床3T无液氦扫描仪的工作台上。
- 将大鼠置于俯卧位。维持扫描仪内加热垫的温度，并使用气动枕式传感器监测呼吸频率。执行MRI方案以测试多种类型的磁共振成像（见表1）。
- 除增强MRI外，还可结合其他定量成像技术，如扩散加权成像（DWI）、T2* mapping、T1 mapping以及动态对比增强（DCE）MRI，以展示其在多样化成像研究中的潜在实用性。本研究中所使用的MRI方案详见表1。
- 在T1加权MR梯度回波序列之后，注射基于钆（GAD）的MRI对比剂（Gadavist，1 mmol/kg），并采集注射GAD后的图像。
注意：对于体重200 g的大鼠，我们注射了200 µL的MRI对比剂，随后注入200 µL生理盐水以冲洗管路。
5. 大鼠脑的宏观检查
注意：MRI 扫描后，注射 2 mL 伊文思蓝溶液（用磷酸盐缓冲液稀释至 2%），让大鼠休息至少 30 分钟，以使溶液在体内充分扩散和循环。随后，采用过量异氟烷（5%）对大鼠实施安乐死，以便进行脑组织的大体解剖检查（遵循机构批准的实验方案）。为确认动物死亡，需进行足趾穿刺，并观察呼吸是否停止至少 1 分钟。之后进行灌注操作，再对大鼠脑组织进行检查。灌注操作步骤总结如下：
- 使用手术剪进行开胸术，暴露胸腔内器官并观察心脏区域。
- 切开右心房（约 5 mm）。
- 将生理盐水注入左心室，用于灌注。
- 用手术剪剪开颅骨，暴露并显露脑组织。
注意：充分灌注后脑组织应呈现均匀明亮的外观，而持续存在的蓝色区域则表明存在血脑屏障相关性白蛋白渗漏，可通过伊文思蓝检测到。
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结果
本研究介绍了一种利用商用动物聚焦超声（FUS）系统在大鼠模型中监测血脑屏障（BBB）开放的临床前实验方案。FUS系统安装在实验台或大型推车上（图1）。大鼠通过面罩吸入异氟烷与氧气混合气体进行麻醉，并固定在配备换能器支架的框架中。将一个谐振频率为500 kHz的水听器插入中心频率为1.0 MHz的FUS换能器中，用于检测声学空化现象。
如图2所示，FUS系统包含超声设置以及调节靶点位置的功能。应进行“运动测试”，以确保换能器能够在一次脉冲周期内于不同位置之间移动。
当血脑屏障开放时，GAD 和伊文思蓝分子可穿过血脑屏障。T1加权磁共振成像捕捉到由GAD引起的磁共振信号强度变化（图 3A）。灌注完成后，可直接观察到伊文思蓝染色的组织（图 3B).
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讨论
已建立一种利用大鼠颈静脉插管模型进行血脑屏障开放研究的实验方案及动物操作流程。尽管目前已存在多种临床前实验方案，但本方案结合了商用聚焦超声系统与大鼠模型，简化了动物准备工作流程，从而确保实验的可重复性。
在本方案中，微泡的选择依据其稳定性和室温储存能力。其他商用微泡也可作为替代选项。Kotopoulis 等人研究并比较了多种微泡类型在胰腺癌低强度声孔效应中的应用10. 根据 体外 结果表明，本研究中选择的微泡在较低强度下为最优配方，而其他微泡在较高强度下效果更佳。然而，在大鼠模型中打开血脑屏障（BBB）最合适的微泡仍不明确。Vlachos 等13 研究了声压和微泡大小对血脑屏障开放体积以及组织损伤（如血管破裂和水肿）的影响。该建议方案鼓励未来的研究进一步探索并确定在大鼠模型中使用的最适宜微泡和超声参数。
本研究中选择临床前FUS系统，因其具备快速且精确的多点靶向能力。该系统可被编程以自动遍历预定义的焦点，这一特性有...
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披露
作者声明无相关利益冲突。
致谢
本研究部分得到了美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）K99DE032397基金、加州大学旧金山分校（UCSF）部门种子基金（编号：7504831）、加州大学旧金山分校RAP基金（项目负责人：Kazim Narsinh，医学博士）以及德国研究基金会（DFG，GA 3535/1-1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD plastipak | ||
| 20 mL，0.9% 氯化钠 | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| 3 mL 注射器 | BD plastipak | ||
| 5 mL 注射器 | BD plastipak | ||
| 钝针，21 G | SAI infusion technologies | B21-50 | |
| 导管连接器，21 G | SAI infusion technologies | CC-25-25 | |
| 导管封管液 | SAI infusion technologies | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) 甘油 |
| 伊文思蓝 | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| 加乐显 | Bayer | 2068062 | |
| GE 异氟烷蒸发器 | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS 注射泵 | Inovenso | IPS-12 | |
| 异氟烷 USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason 微泡 | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| 雄性 Sprague-Dawley 大鼠（200–250 g） | Charles River Laboratories | ||
| 针头，18 G | BD Precisionglide | ||
| 磷酸盐缓冲液 | Mediatech | 21-030-CVR | |
| 聚乙烯导管 | BD Intramedic | ||
| 用于临床前研究的 3T 无液氦 Bruker Biospin 扫描仪 | Bruker | Biospec3T | |
| 颈静脉插管大鼠 | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 聚焦超声换能器 | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 台式聚焦超声系统 | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, USA | ||
| 带通气孔的分配针头 | B Braun | 4550560 |
参考文献
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