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使用临床前聚焦超声系统监测大鼠血脑屏障开放

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DOI：

10.3791/66793

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2024年9月13日

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1Department of Radiology & Biomedical Imaging, University of California, San Francisco, 2Department of Biomedical Engineering, Kyung Hee University, 3Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco, 4University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Radiation Oncology, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种结合磁共振成像（MRI）与低强度脉冲聚焦超声（FUS）的方案，利用颈静脉插管的活体大鼠来监测血脑屏障（BBB）的开放情况。

摘要

大脑具有高度选择性的半透性血脑屏障（blood-brain barrier, BBB），可阻止治疗性大分子药物递送至脑组织。将磁共振引导的低强度脉冲聚焦超声（FUS）与微泡预注射相结合，是一种具有前景的无创、无毒的血脑屏障调控技术。磁共振成像（MRI）能够提供优异的软组织对比度，并实现多种定量评估，如血管通透性、灌注情况以及MRI对比剂在时空上的分布。值得注意的是，基于钆类MRI对比剂的增强MRI技术已被证实为检测血脑屏障开放的金标准。本研究概述了一套完整的方法学流程，包括用于监测大鼠模型中血脑屏障开放的MRI扫描方案和动物实验操作。大鼠模型具有可利用颈静脉导管的优势，便于快速给药。采用立体定位引导的临床前FUS换能器，有助于优化和简化动物实验操作及MRI扫描流程。所建立的方法具有良好的可重复性和操作简便性，无需依赖专业的外科手术技能。本研究致力于推动大鼠模型在临床前研究中的流程优化，并促进针对血脑屏障调控的进一步探索，以增强神经系统疾病治疗的干预效果。

引言

血脑屏障（BBB）调控离子、分子和细胞在血管与脑组织之间的移动1。这一功能有助于维持神经元的正常功能和健康，但同时也阻碍了治疗性大分子药物向脑组织的递送。由于血脑屏障通透性有限，可能导致针对脑肿瘤和神经退行性疾病（如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病）的治疗效果降低2。因此，已有多种策略被研究用于绕过血脑屏障，以实现治疗剂的可控递送，这些方法包括对流增强递送、直接颅内注射、渗透压破坏法以及药物设计优化等3,4,5。

然而，这些方法存在固有的局限性，例如侵入性、感染风险、出血风险、异质性以及药物的快速外排。结合微泡注射的低强度脉冲聚焦超声（FUS）是一种有前景的非侵入性技术，可实现局部化且可逆的血脑屏障（BBB）开放。超声与微泡耦合产生的机械效应能够暂时改变血脑屏障的通透性（即血脑屏障开放）6,7。为了进一步推动利用血脑屏障开放的治疗应用，体内小动物实验至关重要。

本研究介绍了用于监测大鼠模型血脑屏障（BBB）开放的磁共振成像（MRI）方案及动物操作流程。该方案采用由商业机构植入颈静脉导管的大鼠模型（参见材料表）。颈静脉导管植入大鼠模型具有快速给药、血流动力学监测以及导管稳定性良好等潜在优势。血脑屏障的开放通过临床前聚焦超声（FUS）系统实现。该系统专为大鼠和小鼠等小型动物模型的血脑屏障开放而设计，包含台式系统、控制计算机、换能器、水脱气装置及配套附件等关键组件。使用该立体定向引导的临床前FUS系统不仅提高了操作精度，还简化了动物实验流程和MRI检测方案，有助于提升整体实验方案的可重复性与简便性。

方案

本研究中的所有动物实验均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。实验使用雄性Sprague-Dawley大鼠（200–250 g）。大鼠的饲养与护理均遵循美国国立卫生研究院动物照护与使用办公室关于小鼠和大鼠的指导原则。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 动物准备

注意：对于内部操作流程，需将动物转运至准备室，并按如下步骤进行操作：

  1. 将大鼠单独放入亚克力舱内，使用来自医用氧气罐的氧气混合异氟烷（2%-3%）进行暴露，直至大鼠失去意识（遵循机构批准的实验方案）。
    注意：使用异氟烷麻醉可支持长期磁共振成像（MRI）实验方案的实施。
  2. 将大鼠从舱内取出，使用脱毛膏去除颈部前侧和后侧的毛发。
  3. 在眼睛表面涂抹润滑眼膏。
  4. 将大鼠的鼻部置入鼻罩，以维持自主呼吸下的麻醉状态（异氟烷蒸发器浓度设定为2%-2.5%，氧气流量计调节至1-1.5 L/min）。
  5. 将麻醉后的大鼠置于加热的手术台上，并通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。
    注意：MRI实验方案包括对比增强序列，例如T1加权梯度回波成像和T2加权自旋回波成像。这些序列在注射钆（GAD）类对比剂前后均需进行，以评估血脑屏障（BBB）通透性。该过程涉及在大鼠处于MRI扫描仪内时给予GAD对比剂7。为便于操作，使用从大鼠体内留置导管引出的延长导管。该延长装置包括一个导管连接器和一段长度为30 cm的聚乙烯导管。为确保导管通畅并防止泄漏，需用肝素化甘油（250 IU 肝素/1 mL 甘油）冲洗延长导管。

2. 立体定向引导的聚焦超声系统

注意：将动物转移并放置在立体定位聚焦超声（FUS）系统的桌面上。将大鼠的鼻子放入鼻罩中以维持麻醉状态。该FUS系统包括一个函数发生器、一个射频放大器和一个示波器。在设置换能器之前，我们确保所有设备均已正确连接至系统。换能器的安装通过以下步骤完成：

  1. 将尖头指针置于颅骨上的前囟位置，并记录该位置。前囟的位置可通过在中线上找到人字缝前方9.0 mm处来确定8。人字缝位于双侧鼓膜连线的中点9。
  2. 在大鼠头部、水耦合袋和换能器（1 MHz频率）上涂抹超声耦合凝胶。确保大鼠皮肤、水耦合袋与换能器之间无气泡存在。
  3. 将换能器的同轴BNC电缆连接至FUS系统模块的输入端口。
  4. 在控制计算机上，点击加载以调用预先注册的大鼠图像；随后选择多个焦点位置和声压参数。
  5. 在控制计算机上，点击治疗模块中的运动测试，以确认换能器可在脉冲周期内于各焦点之间正常移动。
  6. 设置步骤3中所述的声照射参数。

3. 微泡输注与超声处理

  1. 激活微泡。
    注意：本研究中使用的微泡直径为 1.7 µm，浓度为每毫升 0.2 × 109 个颗粒10。微泡小瓶的激活依据供应商提供的使用说明以及先前发表的报告进行11。
    1. 准备一支带有鲁尔锁头的 5 mL 注射器，并装入 5 mL 无添加剂的 0.9% 氯化钠注射液。
    2. 取下绿色瓶帽，将注射器通过顺时针旋转连接至带通气孔的分配针（见材料表）。
    3. 取下针头保护帽，将其置于小瓶橡胶塞的中心位置，并用力下压，直至穿刺针完全插入塞子中。
    4. 推动推杆，将整个 5 mL 注射器中的液体全部注入小瓶内。
    5. 用力振荡小瓶 20 秒，使内容物充分混合。当出现均匀的白色乳状液体时，表明已形成六氟化硫脂质微球。
    6. 为获得所需剂量，将小瓶倒置，缓慢将适量悬浮液抽入一支 5 mL 注射器中。
  2. 使用输液泵。
    注意：采用输注方法12，通过注射泵向大鼠输送微泡。将含有微泡的注射器连接至插入大鼠体内的导管接头，微泡经聚乙烯管输送，输液泵流速设定为 0.66 mL/min。该输注速率可在 3 分钟内从 3 mL 注射器中注入 2 mL 微泡。输注在超声照射开始前 1 分钟启动，并持续整个 2 分钟的超声照射过程。
  3. 进行超声照射。
    注意：本研究中选用的聚焦超声（FUS）脉冲参数如下：（1）靶向区域：左侧海马体；（2）照射点数量：6 个，以覆盖脑内海马体区域；（3）脉冲持续时间：10 ms；（4）脉冲周期：1200 ms；（5）声压：0.65 MPa；（6）聚焦超声系统中“超声照射模式”菜单下的“脉冲模式”；（7）超声照射时间：120 秒。

4. 使用3T临床前扫描仪进行MRI操作流程

  1. 超声处理后，将动物转移至预临床3T无液氦扫描仪的工作台上。
  2. 将大鼠置于俯卧位。维持扫描仪内加热垫的温度，并使用气动枕式传感器监测呼吸频率。执行MRI方案以测试多种类型的磁共振成像（见表1）。
  3. 除增强MRI外，还可结合其他定量成像技术，如扩散加权成像（DWI）、T2* mapping、T1 mapping以及动态对比增强（DCE）MRI，以展示其在多样化成像研究中的潜在实用性。本研究中所使用的MRI方案详见表1。
  4. 在T1加权MR梯度回波序列之后，注射基于钆（GAD）的MRI对比剂（Gadavist，1 mmol/kg），并采集注射GAD后的图像。
    注意：对于体重200 g的大鼠，我们注射了200 µL的MRI对比剂，随后注入200 µL生理盐水以冲洗管路。

5. 大鼠脑的宏观检查

注意：MRI 扫描后，注射 2 mL 伊文思蓝溶液（用磷酸盐缓冲液稀释至 2%），让大鼠休息至少 30 分钟，以使溶液在体内充分扩散和循环。随后，采用过量异氟烷（5%）对大鼠实施安乐死，以便进行脑组织的大体解剖检查（遵循机构批准的实验方案）。为确认动物死亡，需进行足趾穿刺，并观察呼吸是否停止至少 1 分钟。之后进行灌注操作，再对大鼠脑组织进行检查。灌注操作步骤总结如下：

  1. 使用手术剪进行开胸术，暴露胸腔内器官并观察心脏区域。
  2. 切开右心房（约 5 mm）。
  3. 将生理盐水注入左心室，用于灌注。
  4. 用手术剪剪开颅骨，暴露并显露脑组织。
    注意：充分灌注后脑组织应呈现均匀明亮的外观，而持续存在的蓝色区域则表明存在血脑屏障相关性白蛋白渗漏，可通过伊文思蓝检测到。

结果

本研究介绍了一种利用商用动物聚焦超声（FUS）系统在大鼠模型中监测血脑屏障（BBB）开放的临床前实验方案。FUS系统安装在实验台或大型推车上（图1）。大鼠通过面罩吸入异氟烷与氧气混合气体进行麻醉，并固定在配备换能器支架的框架中。将一个谐振频率为500 kHz的水听器插入中心频率为1.0 MHz的FUS换能器中，用于检测声学空化现象。

如图2所示，FUS系统包含超声设置以及调节靶点位置的功能。应进行“运动测试”，以确保换能器能够在一次脉冲周期内于不同位置之间移动。

当血脑屏障开放时，GAD 和伊文思蓝分子可穿过血脑屏障。T1加权磁共振成像捕捉到由GAD引起的磁共振信号强度变化（图 3A）。灌注完成后，可直接观察到伊文思蓝染色的组织（图 3B).

通过三只大鼠的实验验证了BBBO的可重复性。图4A展示了超声处理及GAD给药后的T1加权梯度回波图像。在三次实验中，靶区的MR信号强度均显著增强。DCE-MR图像显示，在注射MRI对比剂后7-8分钟，信号强度变化最为显著（图4B）。T1加权梯度回波和T2加权自旋回波序列均清晰显示了血脑屏障开放区域，而在GAD给药前，T1图未观察到明显变化（图4C）。

本研究提出的动物实验与磁共振成像（MRI）方案展示了利用颈静脉插管大鼠模型进行磁共振成像研究的可行性。可将磁共振灌注成像和/或扩散张量成像整合到该方案中，以探索用于检测血脑屏障开放的新型MRI生物标志物。

超声成像实验装置，包括1 MHz换能器、示波器、大鼠固定装置等。
图1：台式临床前FUS系统及大鼠体位定位。（A）台式临床前FUS系统。（B）系统内大鼠的体位定位。（C）1 MHz换能器与水听器，水听器位于FUS换能器中心。（D）换能器及水耦合容器在大鼠头部的定位。请点击此处查看该图的高清版本。

聚焦超声参数显示与磁共振成像定位点用于靶向分析。
图 2：临床前聚焦超声系统软件的用户界面。 临床前聚焦超声系统软件的用户界面可对超声辐照参数和靶点位置进行调整。在启动超声辐照前，应先执行“运动测试”，以确保换能器能够在脉冲周期内顺利在各靶点之间移动。该功能可在不进行超声辐照的情况下，测量换能器在不同靶点间移动所需的时间。请点击此处查看该图的放大版本。

用于比较解剖学分析的冠状面和轴向脑切片，包含真实的 R1、R2 样本。
图 3：血脑屏障开放后 T1 加权增强图像及脑区示意图。（A）钆增强后 T1 加权图像，以及（B）血脑屏障开放后大鼠脑组织照片。（A）中标记的 R1 和 R2 区域对应于（C）中所示部位。请点击此处查看该图的高清版本。

动态对比增强 MRI；大鼠脑成像；信号强度；T1、T2 加权、T1 映射。
图 4：超声处理及 GAD 注射后的 MR 成像。（A）三只大鼠在超声处理并注射 GAD 后的 T1 加权 MR 图像。（B）大鼠 #3 的动态对比增强（DCE）MRI，显示信号强度随时间的变化。GAD 基对比剂在红色箭头所示时间点注入。（C）大鼠 #3 在注射 GAD 对比剂前采集的 T1 加权、T2 加权 MR 图像及 T1 映射图。请点击此处查看该图的高清版本。

2D DWI冠状面 2D冠状面 2D T1 mapping冠状面 2D冠状面 2D冠状面 2D DCE（团注 1）冠状面 2D冠状面 2D
R2* mappingFLASH 前扫描RARE 前扫描FLASH 后扫描RARE 后扫描
序列EPIGRETSEGRETSEGREGRETSE
TR2100 ms500 ms2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms30 ms2000 ms39.3 ms30 ms1500 ms
TE22.1 ms12 个回波；10.29 ms5.1 ms65 ms2.9 ms5.1 ms65 ms
3 - 47 ms
层厚1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm1 mm
视野40 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 4040 x 40
矩阵192192192256192128256192
翻转角（度）906090/1802090/180122045/180
切片数量55555555
采集时间4 分 12 秒3 分 12 秒10 分 38 秒2 分 9 秒1 分 52 秒8 分 23 秒3 分 52 秒1 分 24 秒
选项分段 12，3 个方向，b = 0, 54, 180, 522 s/mm2平均次数 = 2，回波间隔 = 4 ms回波间隔 10.3 ms，RARA 因子 2RARE 因子 10，平均次数 4200 µL 造影剂（Gadavist，1 mmol/kg）RARE 因子 10，平均次数 4
用于 200 g 大鼠，注射前 1 分钟，注射后 7 分钟，注射速率 200 µL/min，200 µL 生理盐水冲洗

表1：在3T MRI扫描仪上进行的临床前MRI方案。

讨论

已建立一种利用大鼠颈静脉插管模型进行血脑屏障开放研究的实验方案及动物操作流程。尽管目前已存在多种临床前实验方案，但本方案结合了商用聚焦超声系统与大鼠模型，简化了动物准备工作流程，从而确保实验的可重复性。

在本方案中，微泡的选择依据其稳定性和室温储存能力。其他商用微泡也可作为替代选项。Kotopoulis 等人研究并比较了多种微泡类型在胰腺癌低强度声孔效应中的应用10. 根据 体外 结果表明，本研究中选择的微泡在较低强度下为最优配方，而其他微泡在较高强度下效果更佳。然而，在大鼠模型中打开血脑屏障（BBB）最合适的微泡仍不明确。Vlachos 等13 研究了声压和微泡大小对血脑屏障开放体积以及组织损伤（如血管破裂和水肿）的影响。该建议方案鼓励未来的研究进一步探索并确定在大鼠模型中使用的最适宜微泡和超声参数。

本研究中选择临床前FUS系统，因其具备快速且精确的多点靶向能力。该系统可被编程以自动遍历预定义的焦点，这一特性有助于对目标组织区域进行区域性超声照射。作为替代方案，也可采用已有的聚焦超声（FUS）换能器，例如Sonic Concepts和ExAblate Neuro提供的设备（见材料表），用于开放血脑屏障14,15。值得注意的是，ExAblate Neuro换能器设计上兼容磁共振成像，可为治疗过程提供实时引导与监测。未来，这些换能器可被整合至本研究建立的实验方案中。

所提出的MRI方案结合了多种MRI序列，以展示其在多种成像研究中的潜在实用性。建议采用增强前和增强后的T1加权梯度回波序列以及T2加权自旋回波序列，以捕捉由血脑屏障渗漏引起的MRI对比剂所致的信号强度变化。用户可选择在成像方案中加入弥散加权成像（DWI）、动态对比增强（DCE）以及T2* mapping。作为使用MRI扫描仪的替代方案，Singh等16提出了采用多普勒超声成像进行病灶定位，以及利用被动声学定位检测微泡空化现象的方法，该空化现象与血脑屏障开放区域相关。因此，该方案有望在全超声系统中实现，提供一种潜在的替代方法。

本研究采用了输注法12，即在超声过程中进行微泡输注。由于该方法可持续向脑部输送微泡，与团注输注相比，可能实现更稳定且一致的血脑屏障（BBB）开放。Lapin 等人12比较了输注法与团注法在实现稳定 BBB 开放方面的效果，发现以 7.2 µL Definity 微泡/kg/min 或更低速率输注时，在不同压力水平下均能实现无损伤的 BBB 开放。然而，该方法可能存在一个潜在局限，即难以长期维持注射器内微泡浓度的稳定性。微泡可能倾向于上浮并聚集在注射器顶部，从而导致实际给予的微泡剂量下降。另一种方法是将微泡通过眶后静脉窦进行团注。未来采用本方案的研究应进一步探索不同微泡输注方式和类型之间的比较，以优化大鼠模型中的 BBB 开放效果。

本研究的局限性在于缺乏对宏观损伤的组织化学验证，例如苏木精和伊红（H&E）或结晶紫染色结果。然而，所提出的方案可用于优化超声和磁共振成像（MRI）参数，以避免脑组织出现宏观损伤。此外，未来的研究可结合组织病理学分析流程，以弥补这一局限性。

披露

作者声明无相关利益冲突。

致谢

本研究部分得到了美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）K99DE032397基金、加州大学旧金山分校（UCSF）部门种子基金（编号：7504831）、加州大学旧金山分校RAP基金（项目负责人：Kazim Narsinh，医学博士）以及德国研究基金会（DFG，GA 3535/1-1）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD plastipak
20 mL，0.9% 氯化钠Hospira, Inc00409-7101-67
3 mL 注射器BD plastipak
5 mL 注射器BD plastipak
钝针，21 GSAI infusion technologiesB21-50
导管连接器，21 GSAI infusion technologiesCC-25-25
导管封管液SAI infusion technologiesSku # HGS-10(500 µ/mL) 甘油
伊文思蓝Sigma aldrichE2129-10g
ExAblate NeuroInsightec Inc., Israel
加乐显Bayer2068062
GE  异氟烷蒸发器 GE Healthcare
IPS-12RS 注射泵InovensoIPS-12
异氟烷 USPVet one501017
Lumason 微泡Bracco Diagnostics IncSKJ709700
雄性 Sprague-Dawley 大鼠（200–250 g） Charles River Laboratories
针头，18 GBD Precisionglide
磷酸盐缓冲液Mediatech21-030-CVR
聚乙烯导管BD Intramedic
用于临床前研究的 3T 无液氦 Bruker Biospin 扫描仪 BrukerBiospec3T
颈静脉插管大鼠Charles River Laboratories
RK-50  聚焦超声换能器FUS InstrumentsTx-50-1000-0
RK-50 台式聚焦超声系统FUS Instruments
Sonic ConceptsSonic Concepts Inc., WA, USA
带通气孔的分配针头 B Braun4550560

参考文献

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