从全血中分离和冷冻保存高活力的人外周血单核细胞:初学者指南

Summary

该方案为收集、储存和解冻外周血单核细胞提供了可访问的指南，适用于下游分析和工作流程，如流式细胞术和 RNA 测序。还演示了等离子和血沉棕黄层收集。

Abstract

外周血单核细胞 （PBMC） 通常用于免疫系统及其对疾病和病原体的反应的生物医学研究。该详细方案描述了从全血细胞中分离、冻存和解冻高质量和高活力 PBMC 的设备、用品和步骤，适用于流式细胞术和 RNA 测序等下游应用。还描述了与 PBMC 平行和同时处理全血血浆和血沉棕黄层的方案。该方案易于遵循，利用密度梯度离心分离 PBMC，并附有耗材、设备和制备步骤清单。该方案适用于具有实验室技术经验的个人，并且可以在临床或研究实验室中实施。由没有实验室经验的操作员使用该方案收集的 PBMC 产生高质量的细胞活力和 RNA 测序。

Introduction

该方案展示了一种从全血中分离外周血单核细胞 （PBMC） 的可行方法和工作流程。该方案特别针对新手研究技术人员、学生和临床实验室工作人员，目的是促进 PBMC 的收集和冷冻保存，而无需事先接受过实验室技术培训。

该方案利用离心法按密度分离全血的成分。全血由四种主要成分组成，按密度递减的顺序列出:红细胞/红细胞（占体积的 ~45%）、白细胞（体积的 <1%）、血小板（体积的 <1%）和血浆（体积的 ~55%）1,2,3,4,5,6。白细胞根据其细胞核特性可细分为两类:圆形或多核⁶。PBMC 定义为具有圆形细胞核的白细胞，由以下细胞类型组成:淋巴细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞）、树突状细胞和单核细胞⁶。多核白细胞包括粒细胞，粒细胞由以下细胞类型组成:中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞⁶。多核白细胞比 PBMC 更致密⁶。全血中每种成分的密度详见表 1。

在该方案中，将全血收集在密度梯度离心管中。这些试管包含密度为 1.077 g/mL 的预填充密度梯度培养基。离心后，密度梯度培养基将致密细胞（包括多核白细胞和红细胞）与 PBMC 和血小板分离（图 1A）^6,7。然后收集 PBMC 和血小板组分，洗涤并离心以去除血小板。收集所得纯化的PBMC并储存在-80°C或液氮中。冻存的 PBMC 可以活解冻并直接用于下游分析，或额外加工以分离特定成分细胞类型。

该方案已针对来自高活性 PBMC 的高质量 RNA 测序进行了优化。在本文中，从门诊患者的 PBMC 中分离和冷冻保存。随后，通过 FACS 从 PBMC 中分离单核细胞，并通过 RNA 测序进行分析。然而，该方案可以广泛适应其他实验需求，例如细胞培养、基因编辑、离体功能研究、单细胞分析、通过流式细胞术或飞行时间细胞术进行表型分析、DNA/RNA 或蛋白质的分离、免疫组织化学载玻片，其中包括 8,9,10,11,12,13,14,15， 16,17,18。

除了从密度梯度离心管中收集 PBMC 外，该方案还回顾了如何使用 EDTA 管通过离心收集血浆和血沉棕黄层。离心后，全血分离成血浆、红细胞和含有白细胞的称为血沉棕黄层的薄界面层（图 1B）⁶。血沉棕黄层通常用于 DNA 提取和随后的基因组分析^19,20。血浆层包含全血的无细胞成分，可用于生物标志物检测^21,22。

Protocol

该研究方案已获得 UCSD 和 KUMC 人类保护计划的批准，并符合赫尔辛基宣言。所有个体都提供了参与和采血的知情同意书。

1. PBMC 的处理和冻存

1. 采血前一天，打印出 表 2 中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。
   注:该方案设计用于收集 6 个密度梯度离心管。每管产生大约 1200 万个 PBMC，其中大约 50% 和 20% 分别是活淋巴细胞和单核细胞。根据实验需求进行相应扩展。请注意，细胞的绝对数量可能因患者或治疗条件而异。
2. 使用标准静脉切开技术，在 6 个密度梯度离心管和 1 个 EDTA 管中收集全血，直至充满，体积约为 6 mL。
   注意:如果需要来自多个患者或治疗条件的样品，收集的试管可以储存长达 4 小时，然后同时处理。
3. 收集后，在室温下以 1,800 x g 离心所有试管 20 分钟。
   注:有关如何操作离心机的演示，请参阅 补充视频 1 。
4. 离心后，小心地打开密度梯度离心管。使用移液管去除并丢弃含有血浆的半透明黄色层。不要干扰密度梯度培养基正上方的朦胧细胞层。谨慎起见，留下多余的血浆而不是丢弃 PBMC。对所有试管重复。
   注:离心含有密度梯度培养基的试管后，血浆和 PBMC 将高于密度梯度培养基;红细胞和粒细胞会沉降到底部。请参阅 图 1A 以获取可视化。
5. 使用新的移液管，将每管中剩余体积的含有细胞和残留血浆的移液轻轻上下移液至密度梯度培养基上方数倍。
6. 重悬后，将重悬的试管内容物移液到贴有标签的 50 mL 锥形管中。对所有试管重复上述步骤。
7. 将溶液 1（RPMI 培养基）倒入 50 mL 试管中，直至达到 50 mL 管线。
8. 根据需要，对每位患者或治疗条件重复步骤 1.4 至 1.7。
   注意:确保不同的样品不混合，并使用新的移液管以避免污染。
9. 在室温下以 300 x g 离心 50 mL 试管 10 分钟。
   注:第 2 节中详述的血浆和血沉棕黄层采集方案可在此期间完成。
10. 丢弃尽可能多的上清液。根据需要点击以去除残留的液滴。
    注:离心后，沉淀含有 PBMC，上清液含有血小板和残留血浆。
11. 将 15 mL 溶液 2 管（RPMI 培养基 + 12.5% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄吡啶醇）倒入含有 PBMC 沉淀的 50 mL 锥形管中。轻轻倒置试管以重悬细胞沉淀。
12. 使用移液管吸出 15 mL 溶液 3（RPMI 培养基 + 11.25% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄吡啶醇 + 10% DMSO）。逐滴加入 50 mL 试管中。
    注:溶液 3 含有 DMSO，在室温下对细胞有毒。在准备好立即处理之前，请勿添加解决方案 3。
13. 轻轻倒置试管 3 次以混合。
14. 使用多次分配移液器用 1 mL PBMC 填充每个预先标记和预冷却的冷冻管。
    注:有关如何操作多分液移液器的演示，请参阅 补充视频 2 。
15. 将冻存管放入预冷的冷冻容器中。然后，将容器移至 -80 °C 冰箱中。
16. 根据需要对每位患者或治疗条件重复步骤 1.9 至 1.13。
17. 将冻存管在冷冻容器内放置至少 12 小时，然后将它们转移到 -80 °C 的贴有标签的储存盒中。
    注:或者，将冷冻冻存管转移到液氮 （<-135 °C） 中进行长期储存。

2. EDTA 管等离子体和血沉棕黄层的加工

1. 在室温下以 1,800 x g 离心 10 分钟。
   注意:离心后，顶层由血浆组成，底层由红细胞组成，界面将是血沉棕黄层。有关可视化，请参见 图 1B 。
2. 使用新的移液管，在不干扰血沉棕黄层的情况下吸取尽可能多的血浆。然后，将 0.5 mL 等分试样分配到预先标记的冻存管中。吸出血沉棕黄层并将其转移到适当标记的冷冻管中。
   注意:一些血浆和红细胞可能会污染血沉棕黄层收集。
3. 根据需要对每个患者或治疗条件重复步骤 2.2。
4. 收集后，将冻存管储存在 -80 °C 冰箱中。
   注:或者，储存在液氮 （<-135 °C） 中长期储存。

3. 解冻 PBMC

1. 解冻前一天，打印出 表 3 中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。
   注:该方案设计用于解冻 1 根含有 1 mL PBMC 的 1.5 mL 试管。每管产生约 200 万个 PBMC，其中约 50% 和 20% 分别为活淋巴细胞和单核细胞。根据实验需求进行相应扩展。请注意，细胞的绝对数量可能因患者或治疗条件而异。
2. 使用干冰从储存中转移冷冻的 PBMC，并在 37 °C 培养箱中解冻 4 分钟，或在最后一次冰晶解冻之前解冻。
   注:如果需要，可以取等分试样进行细胞计数和活力测量，如第 4 节所述。
3. 解冻后，向每个冻存管中加入 1 mL 溶液 4 （PBS + 2 mM EDTA）。然后，将内容物倒入预先标记的 50 mL 试管中，每解冻一根 PBMC 试管，其中含有 10 mL 溶液 4。轻点以去除残留的液滴。
4. 将细胞过滤器放在空的 50 mL 试管上，然后将细胞悬液倒入细胞过滤器中。
   注意:如果需要，轻轻敲击以打破表面张力。
5. 在室温下以 400 x g 离心含有菌株细胞的每管 7 分钟。
6. 离心后，倒出含有 DMSO 的上清液。根据需要点击以去除残留的液滴。
7. 将细胞沉淀重悬于适合下游实验需要的所需培养基中（例如，细胞培养基、流式细胞术抗体混合物等）。

4. 细胞计数和活力

1. 在步骤 3.2 中解冻冷冻的 PBMC 后，立即将 20 μL 细胞移液到 1.5 mL 试管中。加入等体积的 0.4% 台盼蓝溶液，轻轻上下移液 3-4 次以混合。
2. 使用自动细胞计数仪，按照制造商的方案对细胞进行计数并评估活力。确保将稀释因子 2 考虑在内。
   注:如其他地方所述，血细胞计数器可用作评估细胞计数和活力的替代方法²³。

Results

PBMC 收集和冷冻保存后，按照制造商的说明，使用表 4 中列出的试剂通过流式细胞术评估来自 56 个独特样品的解冻 PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力（图 2A-F）。PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均 SD 活力分别为 94 ± 4.0%、98 ± 1.1% 和 93 ± 5.6%（图 2G）。±通过台盼蓝排除法测定活力，平均活力为 88 ± 7.5%，细胞计数为 2.3 x 10⁶ ± 1.9 x 10⁶。流式细胞术分析还表明，活单核细胞占 17 ± 5.9%，淋巴细胞占 53 ± 13.0%。

随后，通过流式细胞术从 59 个独特样品中分离出解冻的 PBMC 中的单核细胞，并提交进行文库制备和 RNA 测序，如其他地方所述²⁴。± SD 总序列计数为 18.0 ± 1630 万，读取比对值为 93 ± 6.3%，GC 含量为 49.6 ± 1.4%（图 3A-B）。在 56 个唯一样本的子集中，SD 唯一映射±读取百分比平均值分别为 88 ± 3.6%。这些参数表明，任何受过实验室培训的操作员都可以使用该方案获得适用于下游应用（包括高质量 RNA 测序）的高活力 PBMC。

元件	密度	引文
血浆	1.022 g/mL 至 1.026 g/mL	1
血小板	<1.061 克/毫升至 >1.070 克/毫升	2
PBMC	<1.077 克/毫升	6
低密度中性粒细胞*	<1.077 克/毫升	3
粒细胞（中性粒细胞*、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞）	>1.077 克/毫升	6
红细胞	1.11 克/毫升	4

表 1:按密度递减的顺序列出的全血成分。

Reagant/材料	用量（每 6 个 CPT 试管和 1 个 EDTA 试管）	提示					警告声明
CPT 管	6	根据患者或样本 ID 进行标记。
EDTA 管	1	根据患者或样本 ID 进行标记。
50 mL 锥形管	2	除了患者或样品 ID 外，还应标记 1 管用于 PBMC，1 管用于废液。
冻存管	39	PBMC 标记 30，EDTA 血浆标记 8，血沉棕黄层标记 1。并非所有冷冻管都可以使用。
Frosty 先生	2	用异丙醇填充至一半，并在 -20°C 下预冷过夜。					异丙醇是一种易燃刺激物。远离火花/火焰。避免吸入，戴手套处理并小心。
Flavopiridol （黄吡啶醇）	100 μL 1000X 储备液	要制备 1000X 黄酮吡啶醇原液，将 5 mg 黄酮吡啶醇悬浮于 1.14 mL DMSO 中，浓度为 10 mM。将 200 μL 分装到单个容器中，然后冷冻。使用时，解冻单个等分试样，并在不含 DNase/RNase 的蒸馏水中以 1:10 稀释，然后用作 1000X 溶液。					Flavopiridol 是一种刺激物。戴手套小心处理。
解决方案 1	50 毫升	RPMI 培养基。 要制备 50 mL 储备液，请使用 50 mL RPMI 培养基。
解决方案 2	15 毫升	RPMI 培养基 + 12.5% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄吡啶醇。 要制备 50 mL 储备液，请使用 25 mL RPMI 培养基 + 25 mL 人血清白蛋白 + 50 μL 1000X 黄吡啶醇。					Flavopiridol 是一种刺激物。戴手套小心处理。
解决方案 3	15 毫升	RPMI 培养基 + 11.25% 人血清白蛋白 + 1 μM 黄酮吡啶醇 + 10% DMSO。 要制备 50 mL 储备液，请使用 22.5 mL RPMI 培养基 + 22.5 mL HSA + 5 mL DMSO + 50 μL 1000X 黄吡啶醇。					黄螺醇是一种刺激物，DMSO 有毒，很容易通过皮肤吸收。戴手套小心处理。

表 2:用于收集和冻存 PBMC 的制备和标记试剂和材料清单。

Reagant/材料	数量（每 1 mL 等分试样的冷冻 PBMC）	提示		警告声明
解决方案 4	10 毫升	PBS + 2 毫米 EDTA 要制备 50 mL 储备溶液，请使用 5 mL 10X PBS + 200 μL 0.5M EDTA + 44.8 mL 不含 DNase/RNase 的蒸馏水
50 mL 锥形管	3	除了患者或样品 ID 外，还标记 1 管用于预过滤的 PBMC，1 管用于过滤后的 PBMC，以及 1 支用于废液的管。在标有预染 PBMC 的试管中加入 9 mL 溶液 4/mL 冷冻 PBMC
1.5 mL 管	1	用于细胞计数;带有患者或样本 ID 的标签
0.4% 台盼蓝溶液	20 微升	用于细胞计数;可以在前一天提前添加到 1.5 mL 试管中。		台盼蓝是一种致癌物。戴手套小心处理。

表 3:用于解冻和计数 PBMC 的准备和标记试剂和材料清单。

试剂/材料	数量（每百万个单元格）
Live-Dead 染色剂	5 微升
人类信任 FcX	5 微升
CD3 抗体	5 微升
CD19 抗体	5 微升
CD56 抗体	5 微升
CD66b 抗体	5 微升
HLA-DR 抗体	5 微升
CD14 抗体	5 微升
CD16 抗体	2.5 微升
核糖核酸蛋白	100 单位

表 4:通过流式细胞术从 PBMC 中分离单核细胞的试剂表。

图 1:通过在密度梯度离心管或 EDTA 管中离心分离的全血成分。 （A） 在密度梯度离心管中离心全血可分离密度梯度培养基上方的血浆、血小板和 PBMC，密度梯度培养基下方可分离多核红细胞和红细胞。（B） 在 EDTA 管中离心全血导致最顶层的血浆、底层的红细胞和界面中的血沉棕黄层分离。使用 Biorender.com 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:通过活/死流染色和流式细胞术评估解冻冻存的 PBMC 的活力。 （A） 碎片（用星号 * 表示）通过前向和侧向散射门控从 PBMC 中排除。（B） 整个 PBMC 的代表性活/死分析 （C） 泛单核细胞被选门为以下 FITC 标记表面抗原的 HLA-DR 阳性和阴性:CD3、CD19、CD56 和 CD66b。（D） 单核细胞的代表性活/死分析。（E） 由以下 FITC 标记的表面抗原门控的淋巴细胞:CD3、CD19、CD56 和 CD 66b。（F） 淋巴细胞的代表性活/死分析。（G） 从 56 个样品中定量的每种细胞类型的活力百分比。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:从冻存的 PBMC 中分选的单核细胞的 RNA 测序质量。 对 56 个独特的样品进行了测序，生成了平均 ±SD 18.0 ± 1630 万个总序列。（A） 比对很高，92.5% ± 6.3% 的序列与参考基因组比对。（B） 这些序列的 GC 含量分别为 49.6 ± 1.4%。使用 FastQC²⁵ 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充视频 1:离心机使用演示 请单击此处下载此文件。

补充视频 2:演示如何操作多分液器移液器。请点击此处下载此文件。

Discussion

该 PBMC 采集和冷冻保存方案已由接受过和未接受过研究实验室培训的个人成功实施。在我们的应用中，从储存的 PBMC 中纯化的高活力单核细胞的 FACS 和 RNA 测序产生了高质量的序列。

该协议的一个主要优势是它的可访问性。方案中介绍的技术利用预先填充有固体密度梯度介质的试管。因此，可以将全血直接收集到试管中，然后立即处理以分离 PBMC。需要相对少量的预制溶液和专用设备，从而促进研究实验室（可能制备试剂）与临床实验室（收集和处理样品）之间的合作。书面和视频协议适用于任何培训级别的操作员。

虽然该方案利用新鲜全血分离 PBMC，因此具有相对较高的预期产量和纯度 >90%，但它可能不适用于需要 >98% 极高纯度的应用^26,27。此外，密度梯度离心管的获得成本可能很高，尤其是在需要收集大量样品的情况下。

PBMC 采集的替代方法包括使用液体密度梯度培养基或免疫磁耗竭^28,29。简而言之，前者包括在肝素化全血下分层预制密度梯度培养基，然后离心。后者利用磁性标记的抗体来标记非 PBMC，然后将其保留在磁性柱中，而未标记的 PBMC 则不受影响地通过。

相对于所提出的方案，由于缺乏密度梯度离心管，使用液体密度梯度介质的成本较低，并且需要的材料要少得多;PBMC 分离可在标准 50 mL 试管中进行⁸.但是，这种技术更复杂，处理时间更长，并且可能面临更高的用户错误风险。必须精确添加肝素以避免过度稀释，并且必须以正确的量仔细分层密度梯度介质，以确保良好的 PBMC 分离²⁶。

相对于所提出的方案，使用免疫磁耗竭可提供更高的产量和纯度，由于缺乏离心而减少了处理，更快的处理时间，并且需要更少的材料 30,31,32。然而，主要缺点是这种方法是所描述的三种方法中最昂贵的，尤其是在大规模时。

虽然此协议很可靠，但某些关键步骤可能需要额外注意。在整个方案中，确保样品未混合并放入适当标记的试管中，尤其是在同时处理多个患者或病症时。对于步骤 1.4，确保没有 PBMC 被丢弃;过量的血浆只会降低 PBMC 的浓度，而 PBMC 的浓度对于维持样品活力和质量不太重要。另外，收集的 PBMC 中存在沉淀物表明密度梯度介质的碎片被移走。在步骤 1.5 中更轻柔地移液以防止此问题。在步骤 1.10 和 3.6 中，确保离心的细胞沉淀未被丢弃。快速工作对于步骤 1.12 和 3.3 至关重要，因为溶液 3 含有 DMSO，它在室温下对细胞有毒³³。同样重要的是要注意，建议将 PBMC 储存在液氮中，而不是在 -80°C 下储存。 在 -80°C 下长期储存与细胞活力降低和基因表达改变有关^34,35。

该协议可根据实验需要进行调整。在解决方案 2 和 3 中添加黄吡啶醇（一种 RNA 聚合酶和 mRNA 合成的抑制剂）旨在防止 RNA 测序³⁶ 的任何处理和应激诱导的伪影。然而，如果需要使用 PBMC 进行功能或 体外 研究，则可以省略黄伏吡啶醇。

从 EDTA 试管中采集的血浆会被螯合剂 EDTA 污染。因此，EDTA 血浆不适用于涉及凝血或钙离子的检测^37,38。如果需要，可以在步骤 1.4 中收集离心后密度梯度培养基管中的血浆层。这些试管含有肝素钠作为抗凝剂，可以通过添加肝素酶³⁹ 来去除。值得注意的是，肝素抑制逆转录酶和 PCR 扩增，使得收集的血浆不适合在不添加肝素阻断剂的情况下进行 PCR 实验⁴⁰。

从 EDTA 管中收集的血沉棕黄层未储存在含有 DMSO 或黄吡啶醇的溶液中。DMSO 在减少冰晶形成和细胞死亡方面很重要⁴¹。黄吡啶醇对抑制 RNA 合成很重要³⁶。因此，血沉棕黄层不适合离 体 和转录组学分析。如果需要，可以使用收集的血沉棕黄层进行步骤 1.6 至 1.15，以最大限度地提高细胞活力并抑制 RNA 合成。

虽然该方案是为 RNA 测序而设计的，但使用该方案收集和冷冻保存的 PBMC 的其他潜在应用包括细胞培养、基因编辑、离体功能研究、单细胞分析、通过流式细胞术或飞行时间细胞术进行表型分析、DNA/RNA 或蛋白质的分离、用于免疫组织化学的载玻片等。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 和微;L 提示	Gilson	F174501	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集，每个患者/治疗条件大约需要 3 个提示
15 mL 管	Biopioneeer	CNT-15	容纳溶液 2/3 PBMC/血浆/血沉棕黄层收集，每个患者/治疗条件需要 2 个提示 PBMC/血浆/血沉棕黄层收集
2 mL 冻存管	Globe Scientific	3012	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集 20 µ 每个患者/治疗条件大约需要 40 个冻存管
;L Tips	Gilson	F174201	用于细胞计数;所需体积取决于所使用的细胞计数方法。每 1 mL 未混合的冷冻 PBMC 需要 1 个吸头解冻
50 mL 锥形管	CEM Corporation	50-187-7683	每个患者/治疗条件需要 2 个用于 PBMC/血浆/血沉棕黄层采集 每 1 mL 未混合的冷冻 PBMC 需要 3 个待解冻
CD14 抗体	Biolegend	325621
CD16 抗体	Biolegend	360723
CD19 抗体	Biolegend	363007
CD3 抗体	Biolegend	300405
CD56 抗体	Biolegend	318303
CD66b 抗体	Biolegend	305103
细胞过滤器	Biopioneeer	DGN258367	每 1 mL 未混合的冷冻 PBMC 需要 1 个才能解冻
CPT 单核细胞制备管	BD Biosciences 362753		每个患者/治疗条件需要 6 个管，用于 PBMC/血浆/血沉棕黄层采集
冷冻冷冻盒	Southern Labware	SB2CC-81	可容纳 81 管 PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 每个患者/治疗条件需要 1
管 冷冻管架	Fisherbrand	05-669-45	最多可容纳 50 个冻存管
DMSO	Invitrogen	15575020	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集
	Invitrogen	10977015	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集 每个患者/治疗条件大约需要 2 mL 用于解冻
每 1 mL 冷冻 PBMC 大约需要 9 mLEDTA管	BD Biosciences 366643		PBMC/血浆/血沉棕黄层采集每个患者/治疗条件需要1
嘌呤醇	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR抗体	Biolegend	307609
人血清白蛋白	GeminiBio	800-120	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集每个患者或治疗条件大约需要 25 mL
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	用于 Frosty
先生标签打印机	Phomemo	M110-WH
活死染色	Biolegend	423105
Frosty	先生 Thermo Scientific	5100-0001	最多可容纳 18 个试管. PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette	Brandtech	705744	PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	用于细胞计数;所需体积取决于所使用的细胞计数方法。
打印机标签	Phomemo	PM-M110-3020	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集，每个患者/治疗条件大约需要 45 个标签 每 1 mL 未混合的冷冻 PBMC 大约需要 5 个标签才能解冻
无 RNase 的 EDTA （0.5 M）	Invitrogen	AM9260G	大约 40 µ每 1 mL 冷冻 PBMC 解冻所需
L RNase-Free PBS （10X）	Invitrogen	AM9625	每 1 mL 冷冻 PBMC 解冻约 1 mL
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 移液管，每位患者或治疗条件大约需要 80 mL PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
移液管	Fisherbrand	13-711-7M	PBMC/血浆/血沉棕黄层采集管架每个患者/治疗条件大约需要 5
	Endicott-Seymour	14-781-15	最多可容纳 80 个 CPT/EDTA 管