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方法文章

从全血中分离并低温保存高活力人外周血单个核细胞：初学者指南

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DOI：

10.3791/66794

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2024年10月25日

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

本文内容

摘要

本方案提供了外周血单个核细胞采集、保存和复苏的简易指南，适用于流式细胞术和RNA测序等后续分析与实验流程。同时演示了血浆和白膜层的收集方法。

摘要

外周血单个核细胞（PBMCs）在免疫系统及其对疾病和病原体反应的生物医学研究中被广泛使用。本详细方案描述了从全血中分离、冷冻保存和复苏高质量且高活力PBMCs所需的设备、试剂和操作步骤，所获得的细胞适用于流式细胞术和RNA测序等下游应用。本方案还同时描述了在处理PBMCs的同时平行分离血浆和白膜层的操作流程。该分步操作方案简单易行，采用密度梯度离心法分离PBMCs，并附有试剂、设备及准备步骤的清单。本方案适用于具备任何实验室技术经验水平的操作人员，可在临床或科研实验室中实施。即使无实验室经验的操作人员按照本方案操作，也能获得细胞活力高、适用于RNA测序的PBMCs。

引言

本方案展示了一种从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）的简便方法和操作流程。该方案特别面向实验技术新手、学生以及临床实验室工作人员，旨在帮助其在无需具备前期实验技术培训背景的情况下，顺利完成PBMCs的采集与冷冻保存。

本方案利用离心法根据密度差异分离全血的各组分。全血主要由四种组分构成，按密度从高到低依次为：红细胞/红血球（约占体积的45%）、白细胞（<1%的体积）、血小板（<1%的体积）和血浆（约占体积的55%）1,2,3,4,5,6。根据细胞核的形态特征，白细胞可分为两类：核呈圆形或分叶状的白细胞6。外周血单个核细胞（PBMCs）定义为具有圆形细胞核的白细胞，主要包括以下细胞类型：淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）、树突状细胞和单核细胞6。具有分叶核的白细胞包括粒细胞，后者又包含以下细胞类型：中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞6。分叶核白细胞的密度高于PBMCs6。全血各组分的密度详见表1。

在本实验方案中，将全血采集至密度梯度离心管中。这些离心管内含有预装的密度梯度介质，其密度为1.077 g/mL。离心后，密度较大的细胞（包括多核白细胞和红细胞）被密度梯度介质与外周血单个核细胞（PBMCs）及血小板分离（图1A）6,7。随后收集PBMC和血小板组分，经洗涤并离心以去除血小板。最终获得的纯化PBMCs被收集后储存于-80 °C或液氮中。冻存的PBMCs可被成功复苏，并直接用于后续分析，或进一步处理以分离特定的细胞亚群。

本方案已针对高活力外周血单个核细胞（PBMC）的高质量RNA测序进行了优化。本文中，PBMCs来自门诊患者，并经分离后冷冻保存。随后，通过荧光激活细胞分选（FACS）从PBMCs中分离单核细胞，并进行RNA测序分析。然而，该方案也可广泛适用于其他实验需求，如细胞培养、基因编辑、离体（ex-vivo）功能研究、单细胞分析、流式细胞术或飞行时间质谱流式细胞术进行表型分析、DNA/RNA或蛋白质的提取、免疫组织化学载片制备等8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。

除了从密度梯度离心管中收集外周血单个核细胞（PBMC）外，本方案还介绍了如何收集血浆和血沉棕黄层 通过 使用EDTA管进行离心。离心后，全血分离为血浆、红细胞以及一层称为白膜层的薄层界面，其中含有白细胞（图1B)6. 淋巴细胞层常用于DNA提取及后续的基因组分析19,20血浆层含有全血中的无细胞成分，可用于生物标志物检测21,22.

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方案

该研究方案已获得加州大学圣地亚哥分校（UCSD）和堪萨斯大学医学中心（KUMC）人类保护项目批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有受试者均知情同意参与研究并提供血液样本。

1. PBMC 的处理与冷冻保存

  1. 在采血前一天，打印出 表2 中列出的材料和试剂清单，并相应地进行准备和标记。
    注意：本方案设计用于收集6根密度梯度离心管。每根管可获得约1200万个外周血单个核细胞（PBMCs），其中约50%和20%分别为活淋巴细胞和单核细胞。请根据实验需求按比例调整。请注意，不同患者或处理条件下细胞的绝对数量可能存在显著差异。
  2. 采用标准静脉穿刺技术，将全血采集至6根密度梯度离心管和1根EDTA管中，直至充满，每管约6 mL体积。
    注意：若需采集多个患者或不同处理条件的样本，收集后的样本管可在4小时内保存，并随后同时处理。
  3. 采集后，在室温下以1,800 × g 离心20分钟。
    注意：操作离心机的方法可参见 补充视频1 的演示。
  4. 离心后，小心打开密度梯度离心管。使用移液管移除并弃去含有血浆的淡黄色透明层。注意不要扰动位于密度梯度介质上方的模糊细胞层。为稳妥起见，宁可残留少量血浆，也不要误弃PBMCs。对所有试管重复此步骤。
    注意：含有密度梯度介质的试管离心后，血浆和PBMCs将位于密度梯度介质上方；红细胞和粒细胞则沉降至底部。具体结构可参见 图1A 的示意图。
  5. 使用新的移液管，在每根试管中密度梯度介质上方，轻轻吹吸含有细胞和残余血浆的剩余液体数次，以充分混匀。
  6. 重悬后，将每根试管中的重悬液转移至已标记的50 mL锥形管中。对所有试管重复此操作。
  7. 将溶液1（RPMI培养基）倒入50 mL管中，直至液面达到50 mL刻度线。
  8. 根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤1.4至1.7 。
    注意：确保不同样本之间不发生混合，并使用新的移液管以避免交叉污染。
  9. 将50 mL管在室温下以300 × g 离心10分钟。
    注意：在此期间可同时完成第2节所述的血浆和白膜层收集方案。
  10. 尽可能弃去上清液。必要时轻敲管壁以去除残留液滴。
    注意：离心后，沉淀物中含有PBMCs，上清液中含有血小板和残余血浆。
  11. 将15 mL溶液2（RPMI培养基 + 12.5%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol）倒入含有PBMC沉淀的50 mL锥形管中。轻轻颠倒混匀，使细胞沉淀重悬。
  12. 用移液管吸取15 mL溶液3（RPMI培养基 + 11.25%人血清白蛋白 + 1 µM Flavopiridol + 10% DMSO），逐滴加入50 mL管中。
    注意：溶液3含有DMSO，在室温下对细胞具有毒性。请确保在即将立即处理时再加入溶液3。
  13. 轻轻颠倒混匀3次。
  14. 使用多通道分液器，将1 mL PBMC悬液分装至每个预先标记并预冷的冻存管中。
    注意：操作多通道分液器的方法可参见 补充视频2 的演示。
  15. 将冻存管放入预冷的冻存盒中，然后将冻存盒转移至-80 °C超低温冰箱中。
  16. 根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤1.9至1.13。
  17. 将冻存管在冻存盒中至少保存12小时，然后转移至-80 °C的标记储存盒中。
    注意：也可将冻存管转移至液氮（<-135 °C）中进行长期保存。

2. EDTA 管中血浆和血沉棕黄层的处理

  1. 在室温下以 1,800 x g 离心 10 分钟。 
    注意：离心后，上层为血浆，下层为红细胞，中间界面为白膜层。白膜层的示意图见图 1B。
  2. 使用新的移液管，尽可能吸取血浆，避免扰动白膜层。然后将 0.5 mL 分装至预先标记的冻存管中。吸取白膜层并转移至相应标记的冻存管中。
    注意：白膜层收集过程中可能混入少量血浆和红细胞。
  3. 根据需要，对每位患者或每种处理条件重复步骤 2.2。
  4. 收集完成后，将冻存管存放于 -80 °C 冰箱中。
    注意：如需长期保存，可选择存放于液氮中（<-135 °C）。

3. 解冻外周血单个核细胞（PBMCs）

  1. 解冻前一天，打印出表3中列出的材料和试剂清单，并相应地准备和标记。
    注意：本方案适用于解冻1个含有1 mL PBMCs的1.5 mL冻存管。每管大约可获得200万个PBMCs，其中约50%和20%分别为活淋巴细胞和单核细胞。请根据实验需求按比例调整。请注意，不同患者或处理条件下细胞的绝对数量可能存在显著差异。
  2. 使用干冰将冷冻保存的PBMCs转移，并在37 °C培养箱中解冻4分钟，或直至最后一颗冰晶即将融化为止。
    注意：如需要，可取部分样品进行细胞计数和活力检测，具体方法见第4节。
  3. 解冻后，向每个冻存管中加入1 mL溶液4（PBS + 2 mM EDTA）。然后将内容物倒入已预先标记的50 mL离心管中，每解冻1管PBMCs对应加入含10 mL溶液4的50 mL管中。轻敲以去除残留液滴。
  4. 将细胞筛置于空的50 mL离心管上，然后将细胞悬液通过细胞筛过滤。
    注意：如有需要，可轻轻敲击以打破表面张力。
  5. 将含有过滤后细胞的每根离心管在室温下以400 × g 离心7分钟。
  6. 离心后，倒去含有DMSO的上清液。根据需要轻敲以去除残留液滴。
  7. 将细胞沉淀重悬于适合后续实验需求的适当培养基中（例如细胞培养基、流式细胞术抗体混合液等）。

4. 细胞计数与活力检测

  1. 在步骤 3.2 中解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMC）后，立即用移液器将 20 µL 细胞转移至 1.5 mL 离心管中。加入等体积的 0.4% 台盼蓝溶液，轻轻吹打 3–4 次以混匀。
  2. 使用自动细胞计数仪，按照制造商的说明书进行细胞计数和活力评估。注意将稀释倍数 2 计入计算。
    注意：如其他文献所述，可使用血细胞计数板作为评估细胞数量和活力的替代方法23。

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结果

在采集外周血单个核细胞（PBMC）并进行冻存后，使用 表4 所列试剂，按照制造商说明书通过流式细胞术评估了56个独立样本解冻后PBMC、单核细胞和淋巴细胞的活力（图2A-F）。PBMC、单核细胞和淋巴细胞的平均活力（±标准差）分别为 94 ± 4.0%、98 ± 1.1% 和 93 ± 5.6%（图2G）。通过台盼蓝排斥法测定的活力平均值为 88 ± 7.5%，细胞计数为 2.3 x 106 ± 1.9 x 106。流式细胞术分析还显示，活单核细胞占总PBMC的 17 ± 5.9%，活淋巴细胞占 53 ± 13.0%。

随后，通过流式细胞术从59个不同样本的冻存外周血单个核细胞（PBMCs）中分选出单核细胞，并按照文献所述方法进行文库构建和RNA测序24。测序获得的总序列数平均值 ± 标准差为18.0 ± ...

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讨论

本PBMC采集与冷冻保存方案已成功应用于有无研究实验室培训背景的人员。在我们的应用中，从保存的PBMC中纯化出高活性的单核细胞，并对其进行FACS和RNA测序，获得了高质量的序列结果。

本方案的一个主要优势在于其易用性。该方案所采用的技术使用预先装有固体密度梯度介质的试管，因此全血可直接采集至试管中，并立即用于分离外周血单个核细胞（PBMC）。所需预制溶液和专用设备较少，便于试剂制备的研究实验室与样本采集和处理的临床实验室之间开展协作。书面及视频操作指南适用于各个培训水平的操作人员。

尽管本实验方案使用新鲜全血来分离外周血单个核细胞（PBMCs），因此预期产量和纯度相对较高，可达>90%，但对于需要极高纯度（>98%）的应用可能并不适用26,27。此外，密度梯度离心管的获取成本可能较高，尤其是在需要收集大量样本的情况下。

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披露

作者无相关财务或非财务利益需要披露。

致谢

我们感谢那些自愿提供知情同意、时间并捐献血样的患者。我们还要感谢堪萨斯大学医学中心的 Dr. Patrick Moriarty、Julie-Ann Dutton 和 Mark McClellen，感谢他们在远程站点合作实施本方案。CY 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1K08HL150271 的研究支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000 µL吸头GilsonF174501每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需3个吸头
15 mL离心管BiopioneeerCNT-15用于盛装溶液2/3
每位患者/处理条件进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个
2 mL冻存管Globe Scientific3012每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需40个冻存管
20 µL吸头GilsonF174201用于细胞计数；所需数量取决于所用细胞计数方法。每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需1个吸头
50 mL锥形管CEM Corporation50-187-7683每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个
每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需3个
CD14抗体Biolegend325621
CD16抗体Biolegend360723
CD19抗体Biolegend363007
CD3抗体Biolegend300405
CD56抗体Biolegend318303
CD66b抗体Biolegend305103
细胞滤筛BiopioneeerDGN258367每1 mL未混合冷冻PBMC解冻需1个
CPT单个核细胞分离管BD Biosciences362753每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需6根管
冻存盒Southern LabwareSB2CC-81可容纳81根管
每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需1个
冻存管架Fisherbrand05-669-45最多可容纳50个冻存管
DMSOInvitrogen15575020每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需2.5 mL
无DNase/RNase蒸馏水Invitrogen10977015每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需2 mL
每1 mL冷冻PBMC解冻约需9 mL
EDTA管BD Biosciences366643每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需1根管
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR抗体Biolegend307609
人血清白蛋白GeminiBio800-120每位患者或处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需25 mL
Human Trustain FcXBiolegend422301
异丙醇Sigma-AldrichW292912-1KG-K用于Mr. Frosty
标签打印机PhomemoM110-WH
活死染色剂Biolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001最多可容纳18根管。
每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集需2个Mr. Frosty
多通道分配移液器Brandtech705110
多通道分配移液器吸头Brandtech705744每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需3个吸头
P1000移液器GilsonF144059M
P20移液器GilsonF144056M用于细胞计数；所需数量取决于所用细胞计数方法。
打印机标签PhomemoPM-M110-3020每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需45个标签
每1 mL未混合冷冻PBMC解冻约需5个标签
无RNase EDTA（0.5 M）InvitrogenAM9260G每1 mL冷冻PBMC解冻约需40 µL
无RNase PBS（10X）InvitrogenAM9625每1 mL冷冻PBMC解冻约需1 mL
RNasinPromegaN2111
RPMI培养基Corning10-040-CV每位患者或处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需80 mL
移液管Fisherbrand13-711-7M每位患者/处理条件下进行PBMC/血浆/白膜层采集约需5个
试管架Endicott-Seymour14-781-15最多可容纳80根CPT/EDTA管

参考文献

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