本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。
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本文内容
摘要
摘要
由于经济和生活方式模式的改变，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的患病率急剧上升，带来了重大的健康挑战。既往研究已探讨了MASLD动物模型和细胞模型的建立，并强调了二者之间的差异。本研究通过诱导MASLD中的脂肪积聚，构建了一种细胞模型。采用不同浓度（0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）的不饱和脂肪酸油酸处理HepG2细胞，以模拟MASLD。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测、油红O染色和脂质含量分析评估该模型的有效性。本研究旨在建立一种操作简便的MASLD细胞模型。CCK-8检测结果显示，HepG2细胞的存活率依赖于油酸浓度，其GI50为1.875 mM。0.5 mM和1 mM组的细胞活力显著低于对照组（P < 0.05）。此外，通过油红O染色和脂质含量分析检测了不同油酸浓度（0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）下HepG2细胞中的脂肪沉积情况。0.25 mM、0.5 mM和1 mM组的脂质含量均显著高于对照组（P < 0.05）。另外，油酸处理组的甘油三酯水平也显著高于对照组（P < 0.05）。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）涵盖一系列疾病，包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌1,2,3,4,5,6，这些均归因于非酒精摄入因素7。MASLD 是由代谢性肝损伤引起的最常见肝病，影响全球近四分之一的人口8,9,10,11,12。尽管 MASLD 的确切发病机制尚未阐明，已有多种理论试图解释其发生发展过程。其中一种主流观点认为，该病的发病机制已从经典的"二次打击"理论转向"多重打击"模型1。这些假说的核心是胰岛素抵抗的作用，其被认为在 MASLD 的....
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方案
注意：有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 细胞培养
- 在含有杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（含10%胎牛血清[FBS]、100单位/毫升青霉素和100 µg/mL链霉素）的培养瓶中培养HepG2细胞。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中维持培养。
2. 油酸对细胞活力的影响，通过细胞计数试剂盒-8测定
- 取特定体积的油酸（OA）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成200 mM的储存液。将溶液于-20 °C保存，以备后续使用。
- 将HepG2细胞以每孔6 × 103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养24 h。将HepG2细胞分为两组：
- 对照组：加入细胞培养基。
- OA处理组：向细胞培养基中加入OA，使其终浓度分别为0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM。
- 初始培养24 h后，弃去各孔上清液，根据分组加入相应处理液，每孔1....
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结果
油酸对细胞活力的影响
HepG2 细胞暴露于不同浓度的油酸（OA）（0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）后，与 0 mM 组相比，0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM 组的细胞存活率均下降。在 0.5 mM（P < 0.05）和 1 mM（P < 0.05）时观察到统计学显著性差异。OA 对细胞活力的影响结果通过 CCK-8 试剂盒测定，如 图 2 所示。经 OA 处理的 HepG2 细胞的 GI50 值计算为 1.875 mM。
油红O染色法观察细胞内脂滴形成
油红O（ORO）染色是一种常用的脂质可视化方法16,17。因此，对经油酸（OA）处理24小时的HepG2细.......
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讨论
代谢相关脂肪性肝病（MASLD）是一种临床病理综合征，其特征是由于酒精及其他已知肝损伤因素以外的原因导致肝细胞内脂肪过度沉积18。MASLD 与获得性代谢应激性肝损伤密切相关，尤其与胰岛素抵抗和遗传易感性相关。为了有效开展针对 MASLD 的药物研究与筛选，选择合适的实验模型至关重要。建立细胞模型在 MASLD 研究中尤为重要，有助于深入理解其病理机制并评估新型药物的作用效果。
本方案描述了一种通过油酸（OA）诱导 HepG2 细胞建立的代谢相关脂肪性肝病（MASLD）体外模型。油红O（ORO）染色和脂质含量分析是构建该模型的关键方法。此外，检测细胞活力及细胞上清液中的总甘油三酯（TG）含量，对于确定合适的OA浓度至关重要。MASLD的诊断标准为肝细胞内储存的甘油三酯超过5%19,20。目前MASLD细胞模型主要依赖于HepG2细胞21,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由2018年内蒙古自治区科学技术厅科技计划项目资助，项目名称为"酸马奶对蒙医药地区性疾病疗效的关键问题研究"。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤膜 | Millex | ||
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.45 µm 滤膜 | 密理博 | ||
| 2 mL 冻存管 | CORNING | 430659 | |
| 25 cm2 细胞培养瓶 | CORNING | 430639 | |
| 6孔细胞培养板 | CORNING | 3516 | |
| 96孔细胞培养板 | CORNING | 3599 | |
| 血细胞计数板 | 上海晶晶生化试剂 & 仪器公司 | 02270113 | |
| 细胞计数试剂盒-8 检测 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | CA1210-1000T | |
| CO2 培养箱 | NUAIRE | NU-5710E | |
| DMSO 二甲基亚砜 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | D8371 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 8122691 | |
| 酶标设备 | Tecan | 火花 | |
| 胎牛血清，经鉴定合格 | Gibco | 10099141 | |
| HepG2细胞系 | 北京华北创联生物科技研究院（BNCC） | 221031 | |
| 人甘油三酯（TG）ELISA 说明书 | 南京嘉诚生物工程研究所 | 20170301 | |
| 用于细胞培养的倒置显微镜 | Leica | DMi1 | |
| 异丙醇 | 天津致远化学试剂有限公司 | 2021030141 | |
| 油红O染色试剂盒，用于培养细胞 | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 | G1262 | |
| 油酸 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502071 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| SPSS 24.0 | 统计学软件 |
参考文献
- Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
- Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean die....
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重印与许可
