方法文章

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

DOI：

10.3791/66810

⸱

2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于经济和生活方式模式的改变，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的患病率急剧上升，带来了重大的健康挑战。既往研究已探讨了MASLD动物模型和细胞模型的建立，并强调了二者之间的差异。本研究通过诱导MASLD中的脂肪积聚，构建了一种细胞模型。采用不同浓度（0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）的不饱和脂肪酸油酸处理HepG2细胞，以模拟MASLD。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测、油红O染色和脂质含量分析评估该模型的有效性。本研究旨在建立一种操作简便的MASLD细胞模型。CCK-8检测结果显示，HepG2细胞的存活率依赖于油酸浓度，其GI50为1.875 mM。0.5 mM和1 mM组的细胞活力显著低于对照组（P < 0.05）。此外，通过油红O染色和脂质含量分析检测了不同油酸浓度（0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）下HepG2细胞中的脂肪沉积情况。0.25 mM、0.5 mM和1 mM组的脂质含量均显著高于对照组（P < 0.05）。另外，油酸处理组的甘油三酯水平也显著高于对照组（P < 0.05）。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）涵盖一系列疾病，包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌1,2,3,4,5,6，这些均归因于非酒精摄入因素7。MASLD 是由代谢性肝损伤引起的最常见肝病，影响全球近四分之一的人口8,9,10,11,12。尽管 MASLD 的确切发病机制尚未阐明，已有多种理论试图解释其发生发展过程。其中一种主流观点认为，该病的发病机制已从经典的"二次打击"理论转向"多重打击"模型1。这些假说的核心是胰岛素抵抗的作用，其被认为在 MASLD 的发病机制中起关键作用13。研究表明，肝细胞中的胰岛素抵抗会导致游离脂肪酸水平升高，进而形成甘油三酯并在肝脏内蓄积14,15。

研究人员已同时使用了这两种方法 体内 和 体外 用于模拟MASLD中脂肪沉积的模型；然而，完全复制其病理机制仍然具有挑战性。尽管存在这一局限性，这些模型在研究MASLD潜在治疗靶点方面已发挥重要作用。然而，建立稳定的MASLD模型至关重要。尽管动物模型有效，但其耗时较长且成本高昂，因此人们日益关注 体外 细胞模型。这些模型通常使用单种或多种游离脂肪酸（如油酸（OA）和棕榈酸）来模拟饮食诱导的代谢相关脂肪性肝病（MASLD）。其中，人肝母细胞瘤细胞系HepG2常被用于建立 体外 MASLD 的细胞模型

油酸（OA）诱导可刺激HepG2细胞产生类似于代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的脂肪沉积，该方法具有成熟的研究基础。本研究旨在展示经0.25 mM OA处理后HepG2细胞的存活率、油红O（ORO）染色结果、脂质含量及甘油三酯（TG）水平。本实验的目的是为代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）模型研究的建立提供进一步证据。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 细胞培养

  1. 在含有杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（含10%胎牛血清[FBS]、100单位/毫升青霉素和100 µg/mL链霉素）的培养瓶中培养HepG2细胞。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中维持培养。

2. 油酸对细胞活力的影响，通过细胞计数试剂盒-8测定

  1. 取特定体积的油酸（OA）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成200 mM的储存液。将溶液于-20 °C保存，以备后续使用。
  2. 将HepG2细胞以每孔6 × 103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养24 h。将HepG2细胞分为两组：
    1. 对照组：加入细胞培养基。
    2. OA处理组：向细胞培养基中加入OA，使其终浓度分别为0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM。
  3. 初始培养24 h后，弃去各孔上清液，根据分组加入相应处理液，每孔100 µL；对照组每孔加入100 µL细胞培养基。继续培养24 h。
    注意：每组设置六个复孔。为防止蒸发，向96孔板外周各孔加入100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
  4. 培养24 h后，每孔加入10 µL细胞计数试剂盒-8（CCK-8），轻轻混匀，避光孵育2 h。将96孔板从培养箱中取出，放入酶标仪中，于450 nm波长处测定吸光度值（A450）。根据OD值计算GI50值。

3. 油红O染色法观察细胞内脂滴形成

  1. 以每孔 5 × 105 个细胞的密度将 HepG2 细胞接种于 6 孔细胞培养板中，并在恒温培养箱中培养 24 小时。有关所述步骤的图示，请参见 图 1。
  2. 细胞培养 24 小时后，向每孔加入含油酸（OA）的细胞培养液 2 mL，使终浓度分别为 0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM。继续培养 24 小时后，吸去各孔中的培养液，用 PBS 洗涤两次。每孔加入 1 mL ORO 固定液，室温孵育 30 分钟。
  3. 按 3:2 的比例混合染色液 A 与染色液 B，配制 ORO 染色液。室温静置 10 分钟后，用 0.45 µm 滤膜过滤一次。将滤过的染色液避光保存于离心管中，待用。
  4. 弃去固定液，用蒸馏水洗涤两次。每孔加入 60% 异丙醇 1 mL，孵育 30 秒。吸去 60% 异丙醇溶液，每孔加入 1 mL 新鲜配制的 ORO 染色液，孵育 20 分钟。弃去 ORO 染色液，每孔加入 60% 异丙醇 1 mL，孵育 30 秒。用蒸馏水洗涤 5 次，以去除多余染料。
  5. 用蒸馏水覆盖细胞，显微镜下观察。采集图像后，吸去培养板中的液体并使其自然干燥。随后每孔加入 2 mL 异丙醇，在摇床上振荡 10 分钟。将溶液转移至新的 96 孔板中，每组 16 孔，每孔加 100 µL。使用酶标仪在 510 nm 波长处测定各孔的吸光度（OD），计算脂质含量（A510）。

4. 不同浓度油酸对HepG2细胞上清液中总甘油三酯的影响

  1. 将试剂盒在室温下平衡 20 分钟，并准备实验所需的板。
  2. 收集细胞上清液，在 1,570 × g 条件下离心 10 分钟。设置标准品孔和待测样品孔。向标准品孔中加入 50 µL 标准品（[S0 → S5] 浓度依次为：0、0.5、1、2、4、8 mmol/L）。除空白孔和标准品孔外，向各样品孔中加入 10 µL 不同样品，随后每孔加入 40 µL 样品稀释液。每孔加入 100 µL 检测抗体-辣根过氧化物酶，用酶标板膜密封后，在 37 °C 恒温箱中孵育 1 小时。
  3. 弃去上清液，用无尘纸吸干，每孔加入 1× 洗涤液洗涤。室温静置 1 分钟。重复洗涤 5 次。
  4. 每孔加入 50 µL 底物 A 和 50 µL 底物 B。轻轻混匀后，于 37 °C 孵育 15 分钟。每孔加入 50 µL 终止液，并在 15 分钟内测定各孔在 450 nm 处的吸光度值（A450）。
  5. 以标准品浓度为横坐标，对应吸光度（OD）值为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线方程，用于计算各样品的浓度值。

5. 统计分析

  1. 确定定量数据中的显著差异。
  2. 计算均值 ± 标准差（SD），并以图形表示数据。认为 P < 0.05 具有统计学显著性。

结果

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油酸对细胞活力的影响
HepG2 细胞暴露于不同浓度的油酸（OA）（0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）后，与 0 mM 组相比，在 0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM 和 1 mM 浓度下细胞存活率均下降。在 0.5 mM（P < 0.05）和 1 mM（P < 0.05）时观察到具有统计学显著性差异。OA 对细胞活力的影响结果通过 CCK-8 试剂盒测定，如 图2所示。经 OA 处理的 HepG2 细胞的 GI50 值计算为 1.875 mM。

油红O染色法观察细胞内脂滴形成
油红O（ORO）染色是一种常用的脂质可视化方法16,17。因此，对经油酸（OA）处理24小时的HepG2细胞进行油红O染色后，在显微镜下观察其脂滴形成情况。如图3和图4所示，经OA处理的细胞中红色染色强度高于未处理细胞。OA处理后，HepG2细胞胞浆中出现红色脂滴，且随着OA浓度升高，脂滴数量和脂质含量均增加（图5）。

不同浓度油酸对HepG2细胞上清液中总甘油三酯的影响
实验结果如图6所示，与对照组相比，用不同浓度油酸（OA）（0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM）处理HepG2细胞后，OA组细胞上清液中的甘油三酯（TG）含量显著升高（P < 0.05）。

油红O染色流程图，HepG2细胞，6孔板和96孔板，OD测定。
图1：油红O染色流程图。 缩写：OA = 油酸；OD = 光密度。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示油酸（0.125–1 mM）对细胞存活率影响的细胞活力柱状图。
图 2：使用细胞计数试剂盒-8检测油酸对细胞活力的影响。 每根柱代表均值 ± 标准差（n = 6）。*P < 0.05。缩写：OA = 油酸（oleic acid）。 请点击此处查看该图的放大版本。

油酸浓度对细胞形态的影响，显微镜图像，剂量反应实验。
图3：多个时间点（3、6、9和12点钟方向）的油红O染色图像。 使用倒置显微镜在40倍放大倍数下观察细胞培养中的脂滴形成。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

经油酸处理的细胞在40倍和80倍下的显微镜图像；放大倍数效应；细胞形态。
图4：通过油红O染色评估油酸对细胞内脂滴的影响。 使用倒置显微镜在40倍放大倍数下观察细胞培养物中的脂滴形成。比例尺 = 250 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

不同油酸浓度（0-1 mM）下ORO实验测定的细胞脂质含量柱状图。
图 5：通过光密度值评估油酸对细胞脂质含量的影响。 相对倍数变化以不同组别的光密度值表示。每根柱代表均值 ± 标准差（n = 16）。*P < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

甘油三酯浓度柱状图，油酸作用，星号标记统计学显著性。
图6：不同浓度油酸对HepG2细胞上清液中总甘油三酯水平的影响。各组甘油三酯水平的相对倍数变化以数值形式表示。每根柱代表均值 ± 标准差（n = 3）。*P < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代谢相关脂肪性肝病（MASLD）是一种临床病理综合征，其特征是由于酒精及其他已知肝损伤因素以外的原因导致肝细胞内脂肪过度沉积18。MASLD 与获得性代谢应激性肝损伤密切相关，尤其与胰岛素抵抗和遗传易感性相关。为了有效开展针对 MASLD 的药物研究与筛选，选择合适的实验模型至关重要。建立细胞模型在 MASLD 研究中尤为重要，有助于深入理解其病理机制并评估新型药物的作用效果。

本方案描述了一种通过油酸（OA）诱导 HepG2 细胞建立的代谢相关脂肪性肝病（MASLD）体外模型。油红O（ORO）染色和脂质含量分析是构建该模型的关键方法。此外，检测细胞活力及细胞上清液中的总甘油三酯（TG）含量，对于确定合适的OA浓度至关重要。MASLD的诊断标准为肝细胞内储存的甘油三酯超过5%19,20。目前MASLD细胞模型主要依赖于HepG2细胞21,22,23,24,25,26,27,28，这类细胞已在国内外多项研究中成功用于构建脂肪性肝变性模型。尽管HepG2细胞来源于肝癌细胞，但其在表型特征上与肝细胞具有诸多相似之处，且易于培养和扩增29,30。CCK-8试剂盒、油红O染色、脂质含量测定以及总TG含量检测等方法，为评估研究对象的细胞活力、脂肪积聚程度及脂质含量提供了简便、客观且合理的技术手段。在此背景下，OA的作用机制与MASLD的发病过程相吻合31，即当能量摄入超过消耗时，多余的能量将以脂质形式储存于体内。

研究人员已利用OA23,28,31,32,33棕榈酸34,35油酸/棕榈酸组合26,36 以复制MASLD模型。棕榈酸和油酸（OA）均会导致肝脏脂肪变性及甘油三酯（TG）的积聚。棕榈酸是人体内含量最丰富的饱和脂肪酸，具有显著的脂毒性，可引起肝细胞内脂质蓄积、细胞内活性氧自由基增加，并导致细胞死亡或坏死37相反，OA会导致更显著的细胞内TG沉积（图6）以及更少的细胞调节作用38因此，研究人员常利用OA诱导的HepG2细胞来建立 体外 MASLD 模型。如方案步骤 2.2.2 所述，在添加油酸（OA）溶液时必须加热，这一点至关重要。本研究基于 HepG2 细胞的脂质沉积进行油红 O（ORO）染色和脂质含量分析，有效支持了相关机制的探索 体外 具有复杂机制的MASLD模型，并减少研究所需的时间和成本。

油红O可轻易与呈液滴状的甘油三酯结合，产生由橙色至红色的染色，表明脂肪的存在，其颜色强度取决于脂质浓度。然而，油红O染色液不稳定，易发生沉淀，因此不适合预先配制。故油红O染色液在实验步骤3.2之后进行配制，并在配制和孵育过程中采取避光措施（实验步骤3.2、3.3）。在实验步骤3.5中，选择多个时间点（3、6、9和12点钟方向）的图像，是本实验的一项关键改进，对提高结果的准确性至关重要。尽管较高浓度的油酸（OA）会影响细胞存活率，从而构成该方法的一项局限性，但已有研究表明，适当浓度的油酸可确保细胞活力。

本研究采用综合方法，利用CCK-8试剂盒、油红O染色、脂质含量分析和总甘油三酯（TG）测定，建立并验证了MASLD模型。CCK-8试剂盒用于评估药物对细胞活力的影响，是关键的验证步骤。未来，该模型在药物筛选和机制研究方面具有广阔前景，有助于阐明MASLD的发病机制并识别潜在的治疗靶点。为进一步确保验证结果的可靠性和质量，将通过蛋白质印迹（western blotting）和定量聚合酶链式反应（qPCR）分析该模型中相关靶蛋白的表达水平。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由2018年内蒙古自治区科学技术厅科技计划项目资助，项目名称为"酸马奶对蒙医药地区性疾病疗效的关键问题研究"。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 滤膜Millex
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
0.45 µm 滤膜密理博
2 mL 冻存管CORNING430659
25 cm2 细胞培养瓶CORNING430639
6孔细胞培养板CORNING3516
96孔细胞培养板CORNING3599
血细胞计数板上海晶晶生化试剂 & 仪器公司02270113
细胞计数试剂盒-8 检测北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 CA1210-1000T
CO2 培养箱NUAIRENU-5710E
 DMSO 二甲基亚砜 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 D8371
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco8122691
酶标设备Tecan火花
胎牛血清，经鉴定合格Gibco10099141
HepG2细胞系北京华北创联生物科技研究院（BNCC）221031
人甘油三酯（TG）ELISA 说明书南京嘉诚生物工程研究所20170301
用于细胞培养的倒置显微镜LeicaDMi1 
异丙醇天津致远化学试剂有限公司2021030141
油红O染色试剂盒，用于培养细胞北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司 G1262
油酸 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502071
青霉素-链霉素Gibco15140122
SPSS 24.0统计学软件

参考文献

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HepG2 O MASLD

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