通过局部弹性蛋白酶联合口服β-氨基丙腈在小鼠中建立高级腹主动脉瘤模型

摘要

本方案介绍了一种系统性的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于肾下主动脉并经饮水给予ß-氨基丙腈，从而在小鼠体内建立晚期腹主动脉瘤模型。

摘要

通过将局部应用弹性蛋白酶的小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型与添加β-氨基丙腈（BAPN）的饮用水相结合，可稳定诱导出具有类似人类AAA特征的真实肾下主动脉瘤。在肾下腹主动脉外膜局部应用弹性蛋白酶，可导致主动脉壁弹性层结构损伤，并启动动脉瘤样扩张。联合给予BAPN（一种赖氨酰氧化酶抑制剂），可通过减少胶原蛋白和弹性蛋白的交联，促进血管壁持续退变。该联合方法可形成显著扩大的AAA，其呈现进行性扩张、管腔内血栓形成，并具备破裂能力。优化手术技术，例如完整环周游离整个肾下主动脉节段，有助于在不同操作者及小鼠解剖结构差异的情况下，实现猪胰弹性蛋白酶的一致且充分的应用，从而标准化手术流程。因此，弹性蛋白酶/BAPN模型是一种改进的小鼠AAA手术诱导方法，更接近人类动脉瘤的病理特征，为研究动脉瘤生长及破裂风险提供了更有价值的实验平台。

引言

动脉瘤被定义为血管的病理性扩张，其直径超过正常血管直径的50%¹尽管腹主动脉瘤（AAA）在老年人群中是一种常见疾病，其发病率约为 >5% 的雄性个体 > 65岁，目前尚无针对腹主动脉瘤（AAA）的定向治疗策略¹目前，腹主动脉瘤的管理仅限于危险因素控制，以及根据主动脉直径或生长速率选择开放手术或腔内血管修复术进行外科治疗²AAA最大的危险是动脉瘤破裂，若不及时治疗则可能致命，而在急诊情况下进行修复手术的死亡风险可高达90%以上。¹.

腹主动脉瘤（AAA）的病理生理机制复杂、多因素参与，且尚未完全阐明³。人类腹主动脉瘤的特征包括主动脉壁真正的动脉瘤样扩张，伴有炎性细胞浸润、管腔内血栓形成，以及持续扩张最终导致破裂^3,4。此外，腹主动脉瘤与高龄相关，男女比例约为9:1，最常发生在肾下腹主动脉⁵。在动物模型中模拟人类腹主动脉瘤的全部特征和行为仍是当前持续面临的挑战⁶。

目前，腹主动脉瘤（AAA）的建模主要在小鼠中进行，通常采用以下三种方法之一诱导动脉瘤：通过皮下植入的渗透压泵输注血管紧张素II（AngII），或直接将氯化钙（CaCl₂）或弹性蛋白酶应用于腹主动脉⁷。在后一种方法中，将猪胰弹性蛋白酶（PPE）应用于肾下腹主动脉的一段，导致血管中膜弹性膜层中的弹性纤维发生酶解性降解。这种结构损伤会削弱主动脉壁，从而引起向外的动脉瘤样扩张。然而，单独使用外用弹性蛋白酶产生的肾下动脉瘤相对较小，且随时间推移无法持续扩大或破裂。最近，Lu 等人对该模型进行了改进，在弹性蛋白酶处理的小鼠中额外给予β-氨基丙腈（BAPN），后者是赖氨酰氧化酶的一种不可逆抑制剂⁸。通过抑制弹性蛋白和胶原纤维的交联，BAPN的补充使弹性蛋白酶损伤的主动脉持续扩张直至破裂。与单纯外用弹性蛋白酶模型相比，弹性蛋白酶/BAPN联合模型的AAA发生率更高，所产生的动脉瘤也更大，并伴有管腔内血栓形成⁸。

在弹性蛋白酶/BAPN 模型中，手术分离的程度以及腹主动脉暴露于弹性蛋白酶的情况可能影响该模型的成功率和可重复性。本文中，我们描述了在完整游离整个肾下腹主动脉节段后，通过联合使用含 BAPN 的饮用水和局部应用弹性蛋白酶于腹主动脉的方法，可提高模型的可重复性，兼顾动物间的解剖学差异，并获得更高的腹主动脉瘤诱导率、更大的动脉瘤尺寸以及更高的破裂发生率。本文将介绍一种标准化的方法，通过局部应用弹性蛋白酶并结合饮用 BAPN 添加水，以稳定诱导小鼠发生进展期腹主动脉瘤。

方案

动物实验方案已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会（M005792）的批准。

1. 动物饲养

1. 将小鼠饲养在标准维持饲料上。使用成年或青年成年小鼠（8–12 周龄）。
   注意：使用成年动物可确保其已达到完全成熟，从而排除主动脉直径变化与动物生长相关的可能性。在本研究中，我们使用了在手术时年龄为 22–24 周的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠。Lu 及其同事未观察到年轻与年老小鼠在动脉瘤反应方面存在显著差异⁸。此外，尽管大多数动脉瘤模型研究使用雄性小鼠，但该模型在雄性和雌性小鼠中均能成功诱导腹主动脉瘤（AAA）⁹。
2. 确定研究持续时间，并将动物分配至治疗组或假手术（对照）组。给予治疗组小鼠含 0.2% BAPN 的饮用水，并通过手术在肾下主动脉局部应用活性弹性蛋白酶。给予对照组小鼠未处理的饮用水，并通过手术在肾下主动脉应用变性弹性蛋白酶。

2. 启用含β-氨基丙腈（BAPN）的饮用水

1. 手术前两天开始，用含0.2% BAPN的饮用水处理小鼠。将BAPN水配制成较大体积，并在避光条件下于4 °C保存，最长可保存28天。给小鼠饮用前，务必确保BAPN水已恢复至室温。
   注意：建议在整个研究期间每隔7天更换一次笼内的BAPN水。

3. 手术当天的材料准备

1. 将外科手套切成 5 mm × 10 mm 的条状，后续用于弹性蛋白酶处理前分离主动脉。通过在手术单中央剪出一个约 1.5 cm × 3 cm 大小的椭圆形开口来制备手术单。将 2 英寸 × 2 英寸的纱布展开并剪成两半，制成约 2.5 cm × 10 cm 的纱布条，后续用于牵拉腹腔内容物。对所有手术器械（见材料表）进行高压灭菌，并按照图 1所示示例设置无菌手术区域。

图1：腹主动脉瘤小鼠模型（经弹性蛋白酶/BAPN处理）术前无菌手术装置示意图。 缩略语：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 准备一个术后恢复笼，将清洁的笼子放在加热灯下，并将生理盐水置于灯旁以预热至体温（37 °C）。确保加热灯位置安全，使恢复笼和生理盐水保持温暖但不超过37 °C。打开水泵，开始通过加热垫循环温水。

4. 手术前动物准备

1. 将小鼠放入诱导室中，使用低流量电子蒸发器以200 mL/min流速给予5%异氟烷进行麻醉。麻醉期间，称量每只小鼠的体重，并皮下注射0.6 mg/kg缓释布托啡诺和20 mg/kg卡洛芬以提供镇痛。使用电动毛发修剪器剪除从下腹部至剑突下方区域的腹部毛发。用纱布或实验室擦拭纸清除多余的毛发。将小鼠放回笼中，至少等待20分钟，待镇痛起效后再进行手术。
2. 自给予镇痛药物至少20分钟后，将小鼠再次放入麻醉诱导室，使用低流量电子蒸发器以200 mL/min流速给予5%异氟烷，直至小鼠进入镇静状态。
3. 将镇静后的小鼠从诱导室中取出，仰卧位放置于手术区域。涂抹眼用凝胶，并用外科胶带固定鼻罩。将吸入异氟烷的浓度降低至维持剂量1–2%，流速调至50 mL/min。使用外科胶带固定小鼠的前肢和后肢。
4. 检查小鼠下腹部以定位膀胱。用拇指、食指和中指轻轻对膀胱施加外部压力以诱导排尿；同时使用一块纱布吸除尿液。
   注意：注意避免污染手术区域。
5. 开始对腹部进行消毒，使用含碘或氯己定的擦洗剂及70%酒精棉签。从腹部中心开始，向外做环形擦拭，重复3次。每次擦拭之间让皮肤短暂干燥。
6. 通过检查足趾夹捏反射缺失来确认麻醉深度是否足够。确保鼻罩和四肢已固定稳妥。将手术巾覆盖在小鼠身上，开口正对已准备好的手术腹部区域。
   注意：切勿拖动手术巾跨越小鼠身体，以防可能的污染。

5. 腹主动脉瘤的手术诱导

1. 进入腹腔：
   1. 洗手并佩戴干净的丁腈手套或无菌外科手套。接触手术区域前，务必用70%乙醇喷洒手套，并揉搓双手直至干燥。
   2. 用钝头镊子在腹部中线处提起皮肤。使用手术刀在腹部中线做纵向切口，长度约2-3 cm。
   3. 用镊子提起腹直肌，以辨认半透明的白线。用剪刀经白线切开进入腹腔，然后沿白线向近端和远端延伸切口。
2. 暴露腹主动脉：
   1. 用温热的生理盐水浸湿一块纱布条和两根棉签。将纱布一端紧密地卷至一半位置，留出较长的尾端，制成腹部卷纱。
   2. 使用皮肤牵开器牵开右侧腹壁。
   3. 使用湿润的棉签，通过轻柔地将小肠和大肠扫向左上腹区域，进行右侧内脏中线旁旋转，以暴露并观察主动脉和下腔静脉（IVC）。使用腹部垫卷将肠管移出视野。 – 将纱布卷起的一端塞入肠管下方，然后将尾端绕过并拉出体外，轻柔包裹肠管。对纱布尾端施加轻柔张力，以使肠管保持在视野外。调整腹部卷垫和皮肤牵开器，以获得最佳的腹膜后器官视野，如图所示。 图2A.
      注意：腹部卷垫有助于保持肠管湿润，并防止其被手术器械意外损伤。操作过程中应确保纱布保持湿润，以防肠管干燥。牵拉肠管时切勿用力过猛，以免导致肠系膜上动脉及肠管血管发生扭曲，进而可能引起缺血性损伤。此外，在初次拨动小肠时，需注意大肠与肝脏下缘之间可能存在一条纤细且半透明的连接结构（肝结肠韧带），若操作不慎，易将其从肝包膜撕脱，导致出血。若牵拉时该韧带张力较大，可用剪刀将其锐性切断。

图2：腹部牵拉及暴露小鼠肾下腹主动脉的最佳手术视野示意图。（A）放置纱布腹卷有助于牵开腹腔内器官，同时使用对侧牵开器以更好地显露腹膜后区域。在麻醉动物体表覆盖无菌手术巾（透明以显示动物方位），以维持无菌环境。（B）腹膜后筋膜（绿色框）位于腹主动脉前方。（C）示例为解剖去除腹膜后筋膜后暴露的肾下腹主动脉。可通过左肾静脉前方横跨处稍远端的腹主动脉与下腔静脉之间的潜在间隙（黄色圆圈）开始，将腹主动脉与下腔静脉分离。缩写：IVC = 下腔静脉。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 肾下腹主动脉的环周解剖与分离：
   1. 确认下腔静脉（IVC）和肾下腹主动脉完全暴露在视野中。首先切开并分离后腹膜（RP）筋膜，以开始暴露腹主动脉（图2B）。辨认沿肾下腹主动脉前壁走行的性腺动脉（睾丸动脉或卵巢动脉）（图2B 和 图3）。使用镊子钝性分离性腺动脉之间的筋膜，并沿纵行方向继续分离，以充分暴露腹主动脉前壁（图2C）。
      注：后腹膜筋膜是一层薄而半透明的结缔组织，内含淋巴管和内脏神经丛。必须通过解剖后腹膜筋膜才能暴露腹主动脉。但切勿深入解剖至主动脉外膜的结缔组织层。若外膜（白色结缔组织）发生撕裂，将暴露出中膜（呈鲜红色），在应用弹性蛋白酶后，该部位很可能导致主动脉破裂。
   2. 接下来，开始将腹主动脉从下腔静脉（IVC）上分离。解剖起始点为下腔静脉与主动脉之间的一个小间隙，该间隙位于左肾静脉跨越主动脉处的下缘稍下方（图2C）。使用镊子尖端轻柔地分开主动脉与下腔静脉之间的结缔组织纤维，并在此水平围绕主动脉进行环周分离。
      注：下腔静脉管壁极薄，且通过一层纤细的纤维结缔组织紧密贴附于主动脉。操作过程中应尽量避免触碰或清理下腔静脉。优先将主动脉右侧从下腔静脉上分离（在解剖主动脉左侧周围肌肉组织之前），有助于使主动脉“远离”下腔静脉。
   3. 继续钝性分离主动脉与下腔静脉之间的解剖平面，向尾侧推进至主动脉分叉处。到达主动脉分叉后，停止进一步向远端解剖。
      注：解剖至肠系膜下动脉（IMA）周围时需格外小心，该动脉通常位于肾下腹主动脉中段附近，并横向跨过下腔静脉走行。
   4. 当主动脉右侧边缘已与下腔静脉完全分离后，返回至左肾静脉水平。将后腹膜筋膜从主动脉左侧外缘剥离，并围绕主动脉进行环周解剖，直至主动脉完全游离。相关后腹膜解剖的解剖结构可参见 图3。
      注：解剖主动脉后方时需特别谨慎，因为腰静脉和腰动脉的位置与数量存在高度个体差异。有关此解剖过程中易出血区域的参考，请参见 图4。
   5. 仔细检查腹主动脉是否已尽可能实现与下腔静脉及周围肌肉组织的环周完全分离，尤其需细致处理由肠系膜下动脉和腰动脉牵连固定的主动脉节段。
   6. 按照 图5A 所示，在主动脉左右两侧边缘放置一条手套条带。应尽可能覆盖更多的下腔静脉表面。
   7. 使用手持卡尺测量主动脉最宽处的直径，并记录三次测量值。测量前后均需用70%乙醇喷洒卡尺尖端。避免卡尺尖端直接接触主动脉，以防污染。
      注：也可采用配备校准相机的显微镜拍摄图像进行测量。

图3：小鼠下腹部、骨盆及腹膜后区血液供应的解剖结构。缩写：R = 右侧；L = 左侧。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：腹膜后间隙分离及肾下腹主动脉环周游离过程中，易发生损伤和出血的高风险部位。 缩略语：L = 左侧；IMA = 肠系膜下动脉。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：在弹性蛋白酶/BAPN 小鼠腹主动脉瘤模型中，应用弹性蛋白酶或假处理后的术中反应。 （A）在应用弹性蛋白酶前，将手套材料沿腹主动脉长度方向覆盖，以保护下腔静脉（IVC）和肠道免受弹性蛋白酶暴露，同时使主动脉充分接触弹性蛋白酶。（B）应用变性弹性蛋白酶后未引起主动脉扩张（蓝色框）。主动脉最大直径在基线时为 0.627 mm，局部应用变性弹性蛋白酶 5 分钟后为 0.607 mm。（C）应用活性弹性蛋白酶处理 5 分钟后引起主动脉扩张。在此示例中，主动脉（绿色）从 0.607 mm 扩张至 0.953 mm，直径增加 57%。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 弹性蛋白酶应用：
   1. 使用棉签轻轻蘸去主动脉上的多余血液或液体。
   2. 接着，将一块 10 mm × 2 mm 的干纱布覆盖在主动脉上。用移液器滴加 5 µL 弹性蛋白酶（或对照用变性弹性蛋白酶）以浸透纱布和主动脉。轻轻地将手套碎片折叠包裹住主动脉。
      注意：为制备假手术组或对照组所用的变性弹性蛋白酶，需将弹性蛋白酶在 100 °C 下煮沸 30 分钟。
   3. 让弹性蛋白酶作用于主动脉 5 分钟。在此孵育期间，如有需要，可适当放松腹部卷垫和皮肤牵开器所施加的张力。
      注意：由于弹性蛋白酶存在批次差异，建议研究者在同一项研究中的所有实验使用同一瓶弹性蛋白酶。每次启用新批次的弹性蛋白酶时，建议进行剂量-反应试验，以确保不会出现过多的早期破裂（发生在 4 周前）。根据弹性蛋白酶的作用反应，其作用时间也可在 4 至 6 分钟之间调整。
   4. 5 分钟后，重新调整肠管牵拉并展开手套碎片。用 1 mL 温热的 0.9% 无菌生理盐水冲洗腹腔，同时小心地将纱布和手套碎片从主动脉上移除。用 10 mm × 10 mm 纱布吸收腹腔内的盐水。重复冲洗腹腔，共进行 3 次，每次 1 mL。
   5. 使用手持式卡尺重新测量弹性蛋白酶处理后主动脉的最大直径，并重复记录 3 次。参见 图 5B、C 以了解假手术组和活性弹性蛋白酶处理后主动脉扩张的示例。
      注意：可利用三次处理前和处理后的测量平均值来计算主动脉直径随处理发生的变化百分比。通常，在弹性蛋白酶处理后立即可见明显的扩张，约为 30–50%，这有助于确认弹性蛋白酶具有活性且主动脉得到了充分处理。使用变性弹性蛋白酶处理时，主动脉直径应无变化，或可能略微减小（可能由于痉挛所致）。
5. 关闭腹腔：
   1. 小心地将腹部卷垫从肠管下方及体内取出。必要时，在肠管表面额外滴加生理盐水，以防取出过程中肠管粘连于卷垫。检查确认肠管呈粉红色且灌注良好。
      注意：无需尝试将肠管复位至其原始解剖位置；此举可能导致肠扭转或内疝等风险。
   2. 使用连续缝合的 5-0 非吸收性单股缝线闭合腹壁筋膜。用 3–4 枚皮肤钉合器关闭皮肤。

6. 术后动物护理

1. 将小鼠放入带有加热灯的恢复笼中。确保笼内温度温暖，但不灼热。
2. 皮下注射 0.5–1 mL 的 0.9% 生理盐水液体推注。
3. 根据机构规程，让小鼠在加温的笼中单独恢复约 20 分钟，直至恢复活动，然后移回饲养笼。
4. 根据机构规程，在术后第 1 天手术后 24 小时给予卡洛芬 20 mg/kg，并持续每日给药 3 天。

7. 主动脉测量与组织采集

1. 使用异氟烷实施安乐死后，进行颈椎脱位，重新打开腹腔。切口向上延伸至胸骨以进入胸腔。切除右心房，并在2分钟内通过左心室灌注10 mL冰冷的1%杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）溶液。切除肺、肝和脾。
   注意：操作时需小心避免损伤肠道；肠道内容物溢出可能影响组织分析。
2. 暴露腹主动脉，按照上述方法测量肾下主动脉的最大直径。继续解剖整个主动脉和心脏。在心脏和主动脉分离后，切断所有动脉分支及髂总动脉，仅在主动脉上保留较短的残端。将心脏和主动脉置于带有对比背景的尺子旁并拍照记录。

8. 数据分析与报告

1. 为减少人为误差，使用手持卡尺测量主动脉直径时，应至少重复测量3次，并以平均值作为最终报告的直径数值。
2. 将腹主动脉瘤（AAA）定义为主动脉健康段直径增加50%。研究结果中须同时包含主动脉的绝对直径值及直径变化的百分比。

结果

使用22至24周龄的雄性和雌性C57BL/6J小鼠进行本研究。腹主动脉下段用5 µL弹性蛋白酶（6.9 mg蛋白/mL，6单位/mg蛋白）或变性弹性蛋白酶处理5分钟。经弹性蛋白酶处理的雄性小鼠在接触酶5分钟后主动脉直径较基线值增加了43.4%，而雌性小鼠主动脉直径增加了33.6%（P = 0.0342）。假手术组小鼠在接触变性弹性蛋白酶5分钟内主动脉直径基本无变化（雄性增加0.5%；雌性减少2.8%）。在12只处理组和6只假手术组小鼠中，无手术相关死亡。28天研究的数据见表1。在经处理的雌性小鼠中，6只中有3只因腹主动脉瘤（AAA）破裂死亡；其中1只死于术后第20天，另2只死于第25天（图6）。经处理的雄性小鼠中未发生AAA破裂。所有经处理的小鼠均成功诱导出AAA（12只中的12只），AAA定义为基线主动脉直径增加>50%或因AAA破裂死亡。在28天时，经处理的雄性小鼠平均AAA直径为2.86 ± 0.31 mm，平均直径变化百分比为257 ± 54%；而存活的经处理雌性小鼠AAA直径为3.60 ± 1.87 mm，平均变化百分比为417 ± 286%（图7）。假手术组小鼠的主动脉直径基本无变化。

图6：在为期28天的弹性蛋白酶/BAPN腹主动脉瘤（AAA）模型中，雄性和雌性C57BL/6小鼠的存活情况。（A）在6只经处理的雌性小鼠中，有3只发生了AAA破裂（1只在第20天，另2只在第25天），而在28天时，6只经处理的雄性小鼠均未发生破裂。（B）因AAA破裂死亡的雌性小鼠在尸检时的代表性图像。AAA破裂表现为较大的腹膜后血肿（左图）以及肾下腹主动脉瘤伴血管壁缺损（右图）。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：弹性蛋白酶/BAPN处理组与假手术组雄性和雌性B6小鼠在第28天的主动脉最大直径。 （A）与假手术组相比，处理组小鼠在第28天的肾下主动脉直径显著增大。（B）弹性蛋白酶与BAPN联合处理可在雄性和雌性B6小鼠中成功诱导形成较大的肾下腹主动脉瘤（AAA）。缩写：BAPN = ß-aminopropionitrile；AAA = abdominal aortic aneurysm。 请点击此处查看该图的放大版本。

			B6 雄性假手术组	B6 雌性假手术组	B6 雄性弹性蛋白酶/BAPN处理组	B6 雌性弹性蛋白酶/BAPN处理组
小鼠数量			3	3	6	6
年龄（周）			22.3 ± 0.0	22.7 ± 0.7	23.1 ± 0.2	23.2 ± 0.2
体重（g；手术时）			36.3 ± 2.5	23.7 ± 1.2	32.8 ± 1.7*	23.7 ± 0.8
治疗前主动脉直径（mm）			0.89 ± 0.02	0.75 ± 0.04	0.81 ± 0.07	0.73 ± 0.09
治疗后主动脉直径（mm）			0.90 ± 0.03	0.73 ± 0.01	1.15 ± 0.03**	0.98 ± 0.12**
治疗5分钟后直径变化百分比（%）			0.5 ± 4.4	-2.8 ± 5.3	43.4 ± 10.2***	33.6 ± 4.5***
腹主动脉瘤发生率（%）			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
28天内腹主动脉瘤破裂数			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
存活至28天			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
28天时最大主动脉直径（mm）			0.85 ± 0.01	0.64 ± 0.01	2.86 ± 0.31*	3.60 ± 1.87**
28天时主动脉直径变化百分比（%）			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

表1：弹性蛋白酶/BAPN 小鼠腹主动脉瘤模型28天实验结果。 数据以均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0001，与同性别假手术组比较，采用单因素方差分析Fischer检验。缩写：BAPN = ß-氨基丙腈；AAA = 腹主动脉瘤。

讨论

深入了解腹主动脉瘤（AAA）复杂的病理生理机制，对于改善主动脉瘤疾病的管理至关重要。尽管目前正积极开发新的策略以提高手术治疗效果，但腹主动脉瘤在老龄化社会中仍十分普遍，动脉瘤破裂仍是美国的主要死亡原因之一¹⁰。因此，针对腹主动脉瘤在检测、预防和治疗策略方面的未满足需求，亟需进一步开展基础性动脉瘤研究¹¹。

能够准确且高效地重现人类腹主动脉瘤（AAA）特征和行为的动物模型，对于动脉瘤病理生理机制的研究以及潜在治疗靶点的发现至关重要。尽管现有的动物模型可以模拟人类疾病中动脉瘤改变的主要方面，但尚无单一模型能够完全代表人类AAA的真实复杂性。目前，小鼠是动物AAA建模中最广泛接受的物种。研究人员应根据各自动脉瘤研究的具体需求，权衡不同小鼠模型的各种优缺点，例如Daugherty等和Busch等综述中详尽描述的内容^12,13。

1990年，Anidjar 等人首次描述了使用弹性蛋白酶在啮齿类动物中诱导腹主动脉瘤（AAA）的方法¹⁴。通过注射泵将猪胰弹性蛋白酶灌注至主动脉，可使血管初始扩张约50%至70%，且扩张节段能良好地表现出与人类腹主动脉瘤相似的病理特征，如中膜退行性变和外膜炎症。然而，经典的灌注模型在技术上可能是最具挑战性的动脉瘤模型，且通常在第二周形成动脉瘤后，其大小会逐渐缩小。2012年，Bhamidipati 等人进一步证明，将弹性蛋白酶应用于外膜也可成功诱导出大小更可重复的类似动脉瘤¹⁵。由于技术难度显著降低，局部应用弹性蛋白酶模型在动脉瘤研究中被广泛采用。Xue 及其同事在方法学论文中进一步讨论了该模型的其他技术细节及其优势¹⁶。

2017年，Lu及其同事开发了小鼠腹主动脉瘤的弹性蛋白酶/BAPN模型⁸。通过给予含0.2% BAPN的饮用水，该模型在很大程度上改进了传统局部应用弹性蛋白酶模型的诸多不足，能够持续诱导动脉瘤扩张直至破裂。在他们2017年的研究中，弹性蛋白酶/BAPN处理组小鼠的腹主动脉瘤形成率显著高于仅使用弹性蛋白酶组（93% vs 65%，P < 0.01），且形成的动脉瘤病变更晚期。在为期100天的研究期间，弹性蛋白酶/BAPN组小鼠的腹主动脉瘤持续扩张至超过基线直径的>800%，并形成管腔内血栓（53.8%），46.2%的小鼠在实验结束前发生自发性破裂。该模型使研究人员能够深入探究随时间推移影响动脉瘤进展和稳定性的各种因素。

Berman 等人通过改变外用弹性蛋白酶的浓度、研究持续时间、BAPN 给药时机以及动物性别的影响，进一步探索了弹性蛋白酶/BAPN 模型⁹。在56天内，使用较高浓度的弹性蛋白酶（5 mg/mL 或 10 mg/mL）5 µL处理，所产生的动脉瘤大于2.5 mg/mL处理组。腔内血栓形成的发病率也依赖于弹性蛋白酶的浓度，在5 mg/mL处理的小鼠中为28.6%，在10 mg/mL处理的小鼠中则为62.5%。他们还证明了弹性蛋白酶/BAPN 模型可在雌性小鼠中诱导形成动脉瘤。尽管仅研究了少量雌性小鼠（n=5），但发现雌性小鼠的动脉瘤更易破裂（5只中有2只），且在56天时显著大于雄性小鼠的腹主动脉瘤（AAA）。

本文旨在提供一种方法，以解决手术建模中最大的局限性之一，即手术操作过程的变异性。由于在解剖程度以及弹性蛋白酶处理腹主动脉的范围方面缺乏明确共识，该模型的结果可能在不同动物、研究者及研究机构之间存在显著差异。我们观察到小鼠之间存在多种解剖学变异，包括腰动脉和腰静脉的数量与大小、肠系膜下动脉（IMA）的位置、左性腺静脉的起始位置等，这些因素在尝试仅处理肾下腹主动脉的特定部分或节段时可能构成限制。本文中，我们证明：从近端左肾动脉至远端主动脉分叉处，对整个肾下腹主动脉进行环周解剖，有助于在存在解剖差异的情况下实现可重复的主动脉暴露程度，同时提高动脉瘤诱导的成功率，并为操作者提供清晰的操作边界。此外，下腔静脉（IVC）体积较大且位置更偏前，往往覆盖了主动脉的大部分区域，若不将其与主动脉分离，则可能影响主动脉被处理的范围。虽然有必要去除后腹膜筋膜以暴露主动脉，但重要的是不应将外膜的结缔组织完全从主动脉上剥离，避免暴露任何中膜层，因为这通常会导致在5分钟弹性蛋白酶孵育期间发生破裂。这一现象可作为该模型中解剖程度的额外内部对照，但在初次采用该模型时可能带来较大的学习难度。操作者还将了解到手术过程中容易损伤并导致难以控制的大出血的高风险区域（图4）。

尽管该模型的操作步骤需要保持一致，但研究持续时间和间隔超声检查的时间可根据研究目的而有所不同。主动脉扩张在应用弹性蛋白酶后立即开始，然而使用该模型的研究通常如本示例实验所示，在术后观察小鼠28天⁷。当研究进展期腹主动脉瘤、长期生长、管腔内血栓形成或破裂时，应考虑延长研究时间。

其他围手术期措施，例如维持动物体温和水合状态，有助于提高动物在接受这种侵入性手术后的存活率。术中使用加热垫以及术后将动物置于温暖的恢复笼中，有助于避免低体温。用于冲洗腹腔的生理盐水应在使用前预热。手术后立即皮下注射一次性的液体剂量，可弥补手术期间无法察觉的体液丢失，并帮助动物在术后即刻恢复阶段维持充分的水合状态。若操作时仔细处理组织，并采用一致且系统化的方法，经验丰富的操作者可在每只小鼠30至45分钟内完成弹性蛋白酶/BAPN模型的制备，并稳定诱导腹主动脉瘤（AAA），且围手术期并发症发生率极低。

我们的结果表明，在应用弹性蛋白酶之前，联合使用BAPN并对肾下主动脉进行环周分离，可诱导形成体积更大、持续扩张的腹主动脉瘤（AAA），且在更短时间内达到更大的直径并出现更高的破裂率。在本实验中，所有接受活性弹性蛋白酶处理的雄性（6只中的6只）和雌性（6只中的6只）小鼠均成功诱导出AAA。弹性蛋白酶暴露5分钟即可使主动脉直径立即增加约30–40%，这一变化有助于确认各处理组中弹性蛋白酶应用的成功性和一致性。与Berman等人的研究类似，我们证明该模型可在雌性小鼠中诱导AAA，且雌性小鼠的破裂反应强于雄性。在28天内，一半的雌性小鼠（6只中的3只）发生破裂，而雄性小鼠无一破裂（0/6），但雌性小鼠的体重低于雄性。与雄性对照组相比，雄性小鼠的AAA直径增加了257%（对照组为-4%），而存活的雌性小鼠直径增加了417%（对照组为-16%）。由于雌性组破裂数量较多，在第28天时，存活的雄性和雌性处理小鼠之间的主动脉直径差异无统计学意义。我们推测，假手术小鼠在研究结束时主动脉直径较小，是因为在初始解剖过程中主动脉会轻微扩张，随后在28天时形成瘢痕组织。

弹性蛋白酶/BAPN 模型存在一定的局限性。主动脉的环周剥离需要精细的外科技术，但有助于提高实验的可重复性以及动脉瘤诱导的程度。与局部应用弹性蛋白酶模型类似，弹性蛋白酶的酶活性也存在批次效应，因此如前所述，在同一实验中对所有动物应使用同一瓶弹性蛋白酶。尽管腹主动脉瘤腔内血栓形成和破裂的发生率随时间延长和动脉瘤严重程度增加而升高，但在该模型中这些情况并非必然发生，也无法完全预测。

综上所述，弹性蛋白酶/BAPN 模型可在雄性和雌性小鼠中诱导出较大且真实的肾下腹主动脉瘤，其随时间推移逐渐扩张，形成管腔内血栓，并可能发生破裂。该小鼠模型的这些优势有助于更好地重现人类动脉瘤的某些行为和特征。尽管该技术操作难度较高，但仔细而彻底地解剖主动脉可增强动脉瘤样改变的反应。目前，弹性蛋白酶/BAPN 方法是一种研究肾下腹主动脉瘤的先进模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 L 麻醉诱导室	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS	麻醉诱导室
0.9% 氯化钠注射液，USP，20 mL	Hospira	NDC 0409-4888-03	生理盐水
3 mL 带 BD PrecisionGlide 针头（22 G × 3/4）的鲁尔锁扣式注射器	BD	REF 309569	注射器，22 G 针头
富马酸氨基丙腈	TCI	A0796	BAPN
富马酸氨基丙腈盐	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Avant Delux 纱布敷料，2" × 2"，4 层	Medline	NON26224	纱布敷料
推剪式剃毛器	Whal Clipper Corporation	8110	毛发修剪器
聚维酮碘外科洗手液（7.5%）	Avrio	NCD 67618-154-16	聚维酮碘外科洗手液
钝头镊子	ROBOZ	RS-5130	钝头镊子
Buprenorphine ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	丁丙诺啡
卡洛芬	Norbrook	NDC 55529-131-11	卡洛芬
CASTROVIEJO 5.75" 直型带锁针持	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo 缝合针持
棉签木棒，6"	Dynarex	No. 4302	棉签木棒
DESMARRES 5.5' 拉钩	ROBOZ	RS-6672	皮肤拉钩
数显卡尺，0–150 mm	World Precision Instruments	501601	数显卡尺
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
猪胰弹性蛋白酶 I 型	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	弹性蛋白酶 >4.0 单位/mg 蛋白质
200 证明乙醇	Decon Labs, Inc	2701	稀释至 70% 的乙醇
眼用润滑膏	Optixcare	14716	眼用润滑膏
Germinator 500 干热灭菌器	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	干珠灭菌器
热疗垫	Adroit Medical Systems	V016	热疗垫
热疗泵	Adroit Medical Systems	HTP-1500	热疗泵
异氟烷，USP	Akorn Animal Health	NCD 59399-106-01	异氟烷
L-10 移液器	Rainin	LTS 0.5-10 uL	移液器
低轮廓麻醉面罩，小号	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	麻醉鼻罩
显微解剖剪	ROBOZ	RS-5619	显微解剖剪
显微镜	Leica	S9i	显微镜
Nii-LED 高强度 LED 照明器，LED 外置光源	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED	外部解剖光源
5-0 单股尼龙线，黑色不可吸收缝线	Oasis	MV-661-V	5-0 尼龙缝线
聚异戊二烯外科手套，GAMMEX 无乳胶 PI 微型，7.5 号	Ansell	20685975	无乳胶外科手套
Reflex 7 mm 不锈钢伤口夹	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	伤口夹
电子天平	Ohaus	Compass CR2200	电子天平
SomnofFlo 配件套装	Kent Scientific Corporation	10-8000-71	电子蒸发器用导管
SomnoFlo 电子蒸发器	Kent Scientific Corporation	SF2992	低流量电子蒸发器
SomnoPath 流量分流器	Kent Scientific Corporation	SP1016	电子蒸发器用流量分流器
SS/45 锐头镊子	ROBOZ	RS-4941	锐头镊子
手术剪	ROBOZ	RS-6010SC	手术剪
血管钳	Dumont	VES 0.35	血管钳