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一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

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DOI：

10.3791/66823

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, 2MOE Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, Institute of Molecular Medicine, College of Future Technology, Peking University, 4Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 5College of Engineering, Peking University, 6Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。

摘要

多能干细胞（PSC）技术已广泛应用于药物发现、疾病建模和再生医学领域。 然而，现有的PSC向功能细胞分化的体系受到严重的细胞系间和批次间变异性的限制。因此，实时精确控制细胞分化过程至关重要。在本方案中，我们描述了一种非侵入性且智能化的策略，通过基于明场图像的机器学习克服细胞分化中的变异性问题。以PSC向心肌细胞分化为例，该方法提供了控制初始PSC状态、早期评估与干预分化条件以及清除误分化细胞污染的详细信息，从而实现PSC向功能细胞稳定且高质量的分化。原则上，该策略可拓展至其他多步骤的细胞分化或重编程体系，以支持细胞制造，并进一步加深我们对细胞命运转变机制的理解。

引言

多能干细胞（PSCs）具有在体外分化为多种细胞类型的显著能力。这些分化的功能性细胞可用于细胞治疗、疾病建模和药物开发，在科研或临床应用中均具有重要价值1,2,3。例如，已有多种方法被开发用于将PSCs分化为心肌细胞（CMs）4,5,6,7。这些CMs可用于药物心脏毒性检测、心脏病建模以及细胞移植治疗8,9,10,11。

然而，从多能干细胞（PSC）向终末分化细胞的转化是一个逐步的过程，分化过程中多个干扰因素可能导致细胞走向不同的命运。不同PSC系的遗传背景和表观遗传标记会影响其向特定谱系分化的潜能12,13,14,15；PSC传代次数以及累积的基因突变也是导致PSC异质性的来源；不同实验人员所采用实验操作的差异也可能导致完全不同的分化结果16,17,18,19,20。因此，目前PSC来源细胞生产中的主要问题之一是细胞系之间及批次之间的不稳定性21,22,23,24,25。PSC分化过程的不稳定性常常导致多次重复实验，耗费大量时间和人力。为解决这一问题，关键在于建立一种策略，以最大限度减少细胞系和批次间的变异性，从而提高分化的稳定性和可重复性。

近年来，高分辨率显微镜和机器学习（ML）技术的进步推动了基于机器学习的定量图像分析在细胞生物学中的应用，使得研究人员能够充分利用细胞成像特征中的宝贵信息26,27,28,29,30,31,32,33,34。在我们之前的研究中，我们提出了一种基于活细胞图像的机器学习策略，用于实时监测并干预多能干细胞（PSC）的分化状态，从而提高PSC分化的稳定性和效率（图1）35。以PSC向心肌细胞分化为例，我们使用随机森林模型评估PSC的初始状态，利用逻辑回归模型预测最优分化条件，并通过基于深度学习的Grad-CAM36和pix2pix37识别成功分化的细胞。机器学习模型通过学习多种明场图像中的形态学特征来识别细胞谱系，这些特征包括面积、周长、凸度、实度、亮度、运动速度，以及由深度卷积神经网络提取的其他隐含特征。基于这些已建立的机器学习模型的推断，我们实现了对PSC初始状态的调控、对分化条件的早期评估与干预，并清除了错误分化的细胞污染，从而对心肌分化过程实现了全面而精确的调控。本文提供了开发该策略的逐步操作方案。

方案

1. 细胞分化与鉴定

  1. 培养试剂和培养板的准备
    1. 通过向48 mL基础培养基中加入2 mL补充剂和0.2%青霉素-链霉素配制PSC培养基。分装补充剂并储存在-20 °C。该培养基可在4 °C保存最多4周。
    2. 通过向500 mL基础培养基中加入1 mL补充剂和0.2%青霉素-链霉素配制PSC制备培养基。使用时，预热培养基供一次性使用，并在4 °C保存最多3周。
    3. 通过向RPMI 1640培养基中加入1× B27补充剂（不含胰岛素）和1%青霉素-链霉素配制CM分化培养基；通过向RPMI 1640培养基中加入1× B27补充剂和1%青霉素-链霉素配制CM维持培养基。这两种培养基可在4 °C保存2周。
    4. 将Matrigel浸入冰中并在4 °C过夜。确保Matrigel完全解冻后，分装为每管1 mL，于-80 °C保存以备后续使用；再将1 mL Matrigel加入49 mL DMEM/F12中（4 °C条件下）配制Matrigel工作液。每孔加入850 µL Matrigel工作液至6孔培养板中，37 °C孵育至少30分钟。对于用于CM分化的96孔培养板，每孔加入35 µL Matrigel工作液。
      注意：Matrigel应始终置于冰上；移液枪头和离心管应在4 °C预冷。Matrigel工作液可在4 °C保存2周。移液时应小心避免产生气泡。
  2. PSC的维持与传代
    1. 将PSC维持在6孔培养板中。在显微镜下确认细胞密度，当融合度达到约70%时准备传代（图2A）。
    2. 使用EDTA消化细胞进行传代。将PSC培养基、PBS和EDTA在37 °C水浴中预热，并向培养基中加入Y27632至终浓度为5 µM。
    3. 用1 mL PBS洗涤PSC，每孔加入1 mL EDTA，于37 °C培养箱中孵育3分钟。
    4. 在细胞尚未从培养板脱落前吸除EDTA，然后用1 mL PSC培养基轻轻吹打孔底3–4次以重悬细胞。
      注意：此操作可省略离心步骤，减少传代过程中的细胞损伤。
    5. 吸除6孔培养板中Matrigel包被孔内的DMEM/F12，每孔加入2 mL新鲜PSC培养基（含Y27632）。按1:6至1:12的传代比例将细胞悬液接种至各孔中。将培养板置于含5% CO2的37 °C培养箱中。
    6. 传代后12至24小时更换PSC培养基（不含Y27632）；此后每天更换培养基并检查细胞状态和融合度。
  3. PSC的心肌分化
    1. 进行CM分化时，将PSC以含Y27632的PSC制备培养基接种至96孔培养板中。进行CM分化时，按照上述相同步骤（步骤1.2.2–1.2.6），将PSC以含Y27632的PSC制备培养基接种至96孔培养板中。
      注意：此阶段可适当延长EDTA处理时间（5分钟或更长），以充分解离PSC，使传代后克隆更小。我们的研究表明，在相同面积内，较小的克隆有利于分化。
    2. 第一阶段：当PSC融合度达到80–90%时，更换为含2–20 µM CHIR99021（CHIR）的CM分化培养基（图2B）。换液时间点定义为第0天。CHIR处理24–48小时后，更换为新鲜的CM分化培养基。
      注意：CHIR是一种GSK3β抑制剂，用于中胚层诱导。不同细胞系和批次间，CM分化的最佳CHIR剂量存在差异。例如，iPS-B1细胞的最佳CHIR剂量为8–10 µM，处理48小时。为收集多样化的明场图像用于训练机器学习模型，本研究中针对每批实验滴定CHIR浓度以获得不同的分化效率。
    3. 第二阶段：在72小时（第3天），更换为添加5 µM IWR1的CM分化培养基，继续培养48小时（至第5天）。随后更换为CM分化培养基，继续培养1–2天（至第6–7天）。此时PSC已分化为心肌前体细胞（CPC）。
    4. 第三阶段：更换为CM维持培养基，并每3天更换一次培养基。在第10天或第12天收获心肌细胞（CM）用于进一步分析。
  4. CM的免疫荧光染色
    1. 在第10天或第12天，用PBS洗涤细胞，并在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定15分钟。用PBS洗涤CM两次，并将培养板在4 °C保存最多约1周。
      注意：多聚甲醛为有毒试剂，具有刺激性气味。操作时应在通风橱中进行，并保护眼睛和手部。
    2. 染色时，在室温下用通透液（含0.1% Triton X-100的PBS）处理细胞15分钟；然后在室温下用封闭液（含3%驴血清和0.1% Triton X-100的PBS）孵育30分钟。
    3. 将样品与心肌肌钙蛋白T（cTnT）一抗（1:300稀释于封闭液中）在4 °C孵育过夜，以鉴定CM。
      1. 回收一抗，用PBS洗涤细胞3次。将样品与二抗在含1%牛血清白蛋白的PBS中于37 °C避光孵育1小时。
        注意：回收的一抗可在1周内重复使用2–3次。
    4. 去除二抗，用PBS洗涤细胞3次。使用Hoechst 33342（PBS中1:1,000稀释）在室温下染核5分钟。用PBS冲洗细胞3次，每孔加入100 µL PBS防止干燥。将培养板置于4 °C避光保存，并在1周内完成荧光图像采集。

2. 分化过程中图像流的采集

  1. 设置用于采集图像的实验设计
    1. 使用支持活细胞培养和成像的自动化显微镜，采集心肌细胞（CM）分化不同阶段的明场图像以及分化结果的cTnT免疫荧光图像（图2A-E）。使用显微镜配套软件设计实验程序并控制显微镜。
    2. 打开软件并创建新的实验设计。选择5倍物镜和2倍管镜进行成像。勾选“拼图”（Tiles）和“Z轴层扫”（Z-stack）选项。
    3. 在“通道”（Channels）菜单中添加TL Brightfield通道用于明场成像；添加AF488和H3342通道用于免疫荧光成像。在“成像设置”（Imaging Setup）菜单中修改光路，以适配外接数字CMOS相机进行成像。
    4. 打开“采集模式”（Acquisition Mode）菜单，设置2 × 2 binning以提高信噪比。
    5. 打开“Z轴层扫”（Z-stack）菜单，选择“中心模型”（Center model）。设置扫描时的切片层数和间隔。为获得分析所需的清晰图像，建议设置3–5层切片，层间间隔为3–6 µm。
    6. 在“导航与拼图”（Navigation & Tiles）窗口中，按载具（Carrier）设置拼图区域，每孔设置25个拼图（5列 × 5行）。在“拼图”（Tiles）菜单中，于“样品载具”（Sample Carrier）选择“Multiwell 96”模板，并设置相邻区域间5%–15%的重叠率。
    7. 若需连续成像，勾选时间序列（Time series）选项，并在时间序列菜单中设置持续时间和时间间隔。若需在I阶段采集图像流，设置持续时间为12小时，无间隔。
  2. 明场与免疫荧光图像的采集
    1. 进行图像采集时，首先将细胞培养板放入样品托盘，并将样品载入显微镜内。选择与实验设计匹配的“Multiwell 96”模板。若样品为活细胞，开启加热系统和CO2泵，以维持适宜的培养条件（37 °C，5% CO2）。
    2. 打开预设的实验项目，并另存为新项目。打开“拼图”（Tiles）菜单，手动校准培养板的位置。在“导航与拼图”（Navigation & Tiles）窗口中选择所需孔位，点击“创建”（Create）以构建这些孔的拼图区域。
    3. 在“拼图”（Tiles）菜单中点击“验证拼图区域”（Verify Tile Regions），运行自动对焦以验证所有孔位。随后，在明场下通过滚动鼠标滚轮手动校正每个孔的对焦。
    4. 在“通道”（Channels）菜单中勾选所需通道，并设置各通道的曝光时间。推荐曝光时间为：明场1.625 ms，H3342为100 ms，AF488为550 ms。执行一次单次快照以检查所有通道的图像质量。
    5. 最后，点击“开始实验”（Start experiment）按钮，等待自动成像完成。通常，完成整块96孔培养板的扫描（96孔，三层，每孔明场下25个拼图）约需1.2小时。在“处理框架”（Processing framework）中选择“图像导出”（Image Export），选择无压缩的TIFF格式或PNG格式，并应用设置。后续分析使用每孔中心区域的9个拼图图像（3 × 3）（图2A-E）。

3. 在分化过程的每个阶段建立基于图像的机器学习策略

  1. 软件准备
    1. 安装 Python 环境，并安装以下包：pytorch (1.9.0)、numpy、scipy、scikit-learn、pandas、visdom、scikit-image、opencv-python 和 matplotlib。
    2. 安装 Jupyter Notebook。
    3. 安装 MATLAB。
    4. 从 https://github.com/zhaoyanglab/ML-for-PSC-differentiation 下载代码和示例数据集。
      注意：机器学习（ML）的性能依赖于数据集的质量以及模型和超参数的选择。示例实现不能保证在所有情况下都达到最优。ML 工程师应根据自身具体需求自定义代码，并调整模型和超参数。
  2. PSC 阶段的机器学习策略：控制初始 PSC 集落状态
    数据集：0 h（CHIR 处理前）的明场图像对与最终分化效率
    模型：随机森林
    1. 准备一个包含 0 h（CHIR 处理前）明场图像和最终 cTnT 荧光图像的数据集。为增加 0 h 明场图像形态特征的多样性，确保数据集包含来自不同细胞系的 PSC 集落，并在传代后的时间段内启动分化。使用阶段 I 的最优 CHIR 条件处理数据集中的孔。
      注意：为确保集落接受最优 CHIR 条件处理，同一批次内的孔可使用滴定浓度的 CHIR 处理。仅将具有高效 CHIR 条件的孔纳入数据集。
    2. 通过从 cTnT 荧光图像计算得到的“分化效率指数”量化每个孔的分化效率，其定义为 图像分析公式中像素强度阈值的数学表达式（其中 静态平衡研究中 I_{i,j} ∈ [0,1] 的数学表达式 表示 W × W 荧光图像中像素位置 (i, j) 处的荧光强度，求和范围为所有强度高于阈值 α 的像素位置，通常设为 0.5）。在每个细胞系内，计算该细胞系所有孔中最大的分化效率指数，并将各孔的分化效率指数除以该最大值进行归一化。
      注意：由于每个细胞系的分化潜能本质上不同，这种归一化将更强调不同细胞系间共享且影响分化结果的集落形态特征。归一化确实使来自不同细胞系的 PSC 集落具有可比性，并减轻了细胞系带来的偏差。
    3. 通过高维特征量化 0 h 明场图像的形态特征，以揭示集落形状的特性。为勾勒明场图像中的集落区域，计算局部熵（半径为 r）；将局部熵大于阈值 σ 的像素识别为被细胞覆盖的区域。使用参数设置 r = 10 像素，σ = 3。切换工作目录至 "./colony_control"；将明场图像、细胞区域的二值图像和 cTnT 荧光图像保存至 "colony_control/image_data/CD00-*/[brightfield|cell_region|ctnt]/S*.png"；运行 Jupyter Notebook "Compute_features.ipynb" 计算与集落面积、周长、实度、凸度、圆形度及质心-轮廓距离等相关的特征。
    4. 将数据集随机划分为训练集和测试集，训练集占总数据的 50% 至 80%。运行 Jupyter Notebook 中的最终模块“Split the dataset”以划分数据集（图 3A）。
    5. 在训练集上训练随机森林回归模型，以从 0 h 明场图像特征预测分化效率。运行 Jupyter Notebook "Machine_learning.ipynb" 进行模型训练与测试。
    6. 在测试集上评估训练好的随机森林模型。使用皮尔逊相关系数确认预测的分化效率与真实值高度相关（图 3B）。
      注意：由于测试集未参与训练阶段，测试集上预测值与真实分化效率的高度一致性表明模型在未见样本上具有良好的泛化能力。
    7. 从训练好的随机森林模型中获取特征重要性，并选择最重要的 8 个特征。通过将特征范围划分为若干区间并计算每个区间内的平均分化效率，可视化这些特征与最终分化效率的关系。运行 Jupyter Notebook "Feature_importance.ipynb" 进行可视化（图 3C）。
      注意：可视化有助于理解 PSC 集落形状的变化如何影响分化。
    8. 将训练好的模型应用于新批次，以实时监测 PSC 集落状态。每小时拍摄一次明场图像，将图像输入训练好的模型，获得预测的分化效率。一旦预测效率超过阈值（例如 50%），即启动分化过程。若预测效率无法达到阈值，则弃用这些样本。
      注意：在 PSC 阶段，PSC 集落的分化潜能会先上升后下降。实时监测使实验人员能够识别启动分化的最有利时间点。
  3. 阶段 I 的机器学习策略：CHIR 剂量的早期评估与调整
    数据集：0–12 h 的明场图像序列对与 CHIR 浓度标签（低/最优/高）
    模型：逻辑回归
    1. 准备一个包含全孔明场图像序列的数据集，图像在 0 h 至 12 h 之间每小时采集一次。记录每个孔的 CHIR 剂量（即 CHIR 浓度与持续时间的组合）。为增加多样性，确保数据集包含不同批次和使用滴定 CHIR 剂量的孔（例如浓度 = 2、4、6、8、10 和 12 µM；持续时间 = 24、36 和 48 h）。切换工作目录至 "./stage_I"；将图像保存为 "./data/image/CD01-*/S*/T*.png"，其中 CD01-*（CD01-1、CD01-2、CD01-3、CD01-4）为批次名称，S*（S1、S2、...、S96）为孔索引，T*.png（T1.png、T2.png、...、T10.png）为图像序列中不同时间步长的预处理明场图像。
    2. 在每个批次中，计算每个孔的 cTnT+ 细胞百分比，即荧光图像中 cTnT+ 细胞数除以总 Hoechst+ 细胞数。对具有相同 CHIR 剂量条件的平行孔的 cTnT+ 细胞百分比取平均。将每个孔的 CHIR 剂量条件和 cTnT+ 细胞百分比保存至 csv 文件 "./data/image/CD01-*/CD01-?_exp_config.csv"。
    3. 在每个批次中，根据以下标准确定每种 CHIR 持续时间下的“低”、“最优”和“高” CHIR 浓度范围。平均 cTnT+ 细胞百分比高于阈值（例如 20%）的 CHIR 浓度被定义为“最优”。超出最优范围的 CHIR 浓度被定义为“低”或“高”。在每种 CHIR 持续时间下，根据对应的 CHIR 浓度将孔标记为“低”、“最优”或“高”。
      注意：经验上，CHIR 浓度与高效孔的持续时间之间存在负相关：CHIR 持续时间越长，最优浓度越低。换句话说，CHIR 浓度的最优性取决于 CHIR 持续时间，因此不同 CHIR 持续时间下的孔标签也不同。
    4. 在每个批次中，针对每种 CHIR 持续时间，计算每个浓度 c 的 ΔCHIR 浓度，以量化其偏离最优的程度。设最优 CHIR 浓度范围为 [c1, c2]，则 ΔCHIR 浓度(c) = c - c1（若 c < c1），0（若 c1 ≤ c ≤ c2），或 c - c2（若 c > c2）。
    5. 提取数据集中图像序列的特征，确保其反映阶段 I 细胞的形态变化。为计算关于局部熵、面积、周长、亮度、光流和分形维度的图像特征，运行
      cd ./data
      python compute_features.py
      cd ..
      注意：为突出形态变化，图像序列中某些特征（如面积、周长和光流）的值可归一化为其初始基线值。
    6. 将数据集随机划分为训练集和测试集。运行 Jupyter Notebook "./data/prepare_dataset.ipynb" 以划分数据集，并将数据集组织为 Dataframe（图 3D）。
    7. 针对每种 CHIR 持续时间，在训练集上使用图像序列特征训练逻辑回归模型，以预测 CHIR 浓度标签（低/最优/高）。在测试集上使用准确率、精确率、召回率、F1 分数和曲线下面积（AUC）评估训练好的逻辑回归模型的分类性能。运行 Jupyter Notebook "machine_learning.ipynb" 进行训练与测试（图 3E）。
    8. 评估模型在 CHIR 剂量评估中的性能。在测试集中，使用偏差分数（Deviation Scores，范围为 -1 至 1）合并具有相同 CHIR 浓度的平行孔的预测标签，其定义为 静态平衡方程：(N_c^high - N_c^low) / N_c；用于稳定性分析，其中 Nc 表示浓度为 c 的孔数，Nc^low 低浓度分析的化学符号，科学记法 和 静态平衡公式 \(N_c^{high}\)，物理方程，教育用途 分别表示被预测为“低”和“高”的孔数。使用皮尔逊相关系数确认预测的偏差分数与每种 CHIR 剂量的真实 ΔCHIR 浓度高度相关。
    9. 进行跨批次验证以测试模型的泛化性能。每轮留一个批次用于测试，其余用于训练。在每个测试批次中，使用皮尔逊相关系数比较预测的偏差分数与真实 ΔCHIR 浓度。运行 Jupyter Notebook "cross_batch_validation.ipynb" 实现跨批次验证（图 3F）。
      注意：对于选定的 CHIR 持续时间 h，使用持续时间 h 下训练的逻辑回归模型对所有浓度为 c 的孔的预测将转换为偏差分数，反映 CHIR 浓度 c 的最优性。偏差分数接近 0 表示浓度 c 在持续时间 h 下被预测为最优，负或正的偏差分数表示剂量不足或过量，可作为后续调整 CHIR 剂量的信号。注意，由于预测在早期（12 h）完成，阶段 I 剩余时间的最终 CHIR 持续时间和浓度仍可调整。
    10. 将训练好的逻辑回归模型应用于新批次以评估 CHIR 剂量。对于给定的 CHIR 浓度，计算该浓度下平行孔的 0–12 h 图像序列特征，将特征输入在不同 CHIR 持续时间下训练的逻辑回归模型，获得每个孔的预测标签。基于模型预测，计算偏差分数以评估不同 CHIR 持续时间下各 CHIR 浓度。
    11. 基于模型的 CHIR 剂量评估，相应地对每个次优 CHIR 浓度下的孔进行挽救，通过在 48 h 前调整其 CHIR 持续时间或浓度至最优。
      1. 调整持续时间：根据模型对最优 CHIR 持续时间的预测，调整这些孔中含 CHIR 培养基更换为 CM 分化培养基的时间点。若错过最优时间点，则弃用这些样本。
      2. 调整浓度：在预设 CHIR 持续时间下，若当前浓度被预测为“低”，直接向培养基中加入高浓度 CHIR 以提高浓度。必要时用 PBS 稀释 DMSO 中的 CHIR（50 mM），加入适量液体并轻轻摇动培养板。若当前浓度被预测为“高”，吸出一定体积的含 CHIR 培养基，并补充等体积的 CM 分化培养基。
        注意：分化的前 48 h 内，细胞会分泌促进生长和分化的因子，因此不要完全更换培养基。此外，分化过程中需保持培养基体积恒定。因此，调整 CHIR 浓度时应确保加入液体体积尽可能小。
  4. 阶段 II 的机器学习策略：识别向心肌细胞分化的 CPC
    数据集：第 6 天的明场图像对与人工标注的向心肌细胞分化的 CPC 掩膜
    模型：ResNeSt38 结合 Grad-CAM36 进行弱监督学习
    1. 准备一个包含第 6 天明场图像的数据集。通过从第 12 天回溯至第 6 天的图像序列中追踪 cTnT+ 细胞，人工标注明场图像中向心肌细胞分化的 CPC。
    2. 将明场图像和对应的人工标注（称为掩膜）裁剪为图像块，每个图像块大小为全孔图像大小的 1/5.5。以重叠方式提取图像块，训练集中相邻图像块重叠 50%，测试集中重叠 75%。将包含 ≥30% 向心肌细胞分化的 CPC 的图像块标记为“阳性”，无此类 CPC 的图像块标记为“阴性”。切换工作目录至 "stage_II"。运行 "./Crop_and_Reconstruct/mask_crop.m" 裁剪图像。运行 "./Crop_and_Reconstruct/classification.m" 为明场图像块分配标签（0：阴性；1：阳性）（图 3G）。
    3. 将标注的图像块随机划分为训练集和测试集。
    4. 训练深度卷积神经网络 ResNeSt38 以分类这些图像块。在测试集上评估训练好的 ResNeSt，确认模型表现出高分类准确率。分别运行 "train.py" 和 "test.py" 进行训练与测试（图 3H）。
    5. 使用 Grad-CAM36 突出显示对 ResNeSt 推断贡献最大的区域，以热图表示。对热图进行二值化（使用阈值，例如最大值的 10%）以获得预测的向心肌细胞分化的 CPC 区域，称为图像识别的 CPC（IR-CPC）区域。
    6. 在测试集上使用准确率、F1 分数、精确率、召回率、特异性及交并比（IoU）比较 IR-CPC 区域与人工标注掩膜。使用皮尔逊相关系数比较 IR-CPC 区域比例与分化效率指数（由最终 cTnT 荧光图像计算得到）。运行 "./Evaluation/index_calculate.m" 和 "./Evaluation/Pearson_correlation.m" 进行性能评估（图 3I）。
    7. 将训练好的模型应用于新批次在阶段 II 识别 CPC。将全孔明场图像裁剪为图像块，将图像块输入训练好的 ResNeSt，获得图像块级别的 IR-CPC 区域，再合并为全孔 IR-CPC 区域。计算 IR-CPC 区域的比例作为最终分化效率的指标。纯化 IR-CPC 以减少细胞污染（如下所述）。
      注意：由于 CPC 识别模型可对最终分化效率进行早期评估，也可作为高通量读出手段，用于筛选促进分化过程的小分子，从而进一步优化分化方案35。
  5. 图像识别 CPC 的区域选择性纯化
    注意：光激活实验基于配备电动载物台的倒置荧光显微镜进行。
    1. 根据训练模型预测的 IR-CPC 区域，弃用无法生成任何 IR-CPC 的孔。为纯化这些向心肌细胞分化的 CPC，使用一种非细胞毒性光可激活探针 Dual-Activatable Cell Tracker 1 (DACT-1) 对非 CPC 进行区域选择性标记39。
    2. 将 DACT-1（10 mM）溶于 DMSO 中，并在 -20 °C 下保存。将第 6 天的细胞在 CM 分化培养基中与 1 µM DACT-1 于 37 °C 孵育 30 分钟。
    3. 在显微镜下观察活细胞，并在 MATLAB 中以多边形选择感兴趣区域（ROI）。在多边形内绘制间距为 20 µm 的平行线，并计算交点坐标。
    4. 根据轨迹线设置电动载物台的移动路径，使载物台以 0.12 mm/s 移动，从而使装配在载物台上的 405 nm 激光线（直径 20 µm）全局扫描 ROI，选择性光激活非 CPC。照射后，使用 561 nm 激光线检测 DACT-1 标记的细胞。
    5. 使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（用 PBS 稀释）在 37 °C 下消化细胞 5–7 分钟，并在培养箱中轻轻摇动培养板 2 分钟。通过 40 µm 细胞筛过滤细胞，并在 500 × g 下离心 3 分钟。将细胞重悬于 0.5% BSA 中，将管置于冰上直至分选。同时准备未照射样本作为分选的阴性对照。
    6. 启动流式细胞分选系统并设置分选软件。选择 561 nm 波长激光，并使用 610/20 带通滤光片进行 DACT1+ 分选。对每个样本，使用多边形门控工具在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）的双变量图中圈选单细胞群体。然后运行阴性对照以确认背景荧光，运行区域选择性照射样本，并绘制 DACT1+ 群体的门控。
    7. 收集分选的细胞并重悬于含 10% FBS 和 5 µM Y27632 的 CM 维持培养基中，将分选细胞接种至 Matrigel 包被的 96 孔板中。
    8. 次日，更换为 CM 维持培养基，并等待收获高纯度心肌细胞。
  6. 阶段 III 的机器学习策略：识别心肌细胞
    数据集：第 12 天的明场图像对与最终 cTnT 荧光图像
    模型：pix2pix37
    1. 准备一个包含心肌细胞明场图像及其对应 cTnT 荧光图像的数据集。为增加多样性，确保数据集包含不同分化效率和细胞系的孔。
    2. 将数据集随机划分为训练集和测试集。切换工作目录至 "stage_III"。将明场图像和对应的 cTnT 荧光图像分别保存至 "./pix2pix/datasets/(CM|CM_new_cell_lines)/A/(train|test)/*.png" 和 ".../B/(train|test)/*.png"。运行以下命令：
      cd pix2pix/datasets
      python combine_A_and_B.py --fold_A ./CM/A --fold_B ./CM/B --fold_AB ./CM/ --no_multiprocessing
      cd ..
    3. 在训练集上训练 pix2pix 模型37。运行以下命令（图 3J）：
      python train.py --dataroot ./datasets/CM --name brightfield2fluorescence --model pix2pix --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 256 --lr 2e-4 --n_epochs 1000 --n_epochs_decay 0 --norm instance --netD n_layers --n_layers_D 1 --batch_size 16 --direction AtoB --save_epoch_freq 100 --dataset_mode aligned --use_resize_conv --seed 1234
    4. 将训练好的 pix2pix 模型应用于测试集。运行以下命令：
      python test.py --dataroot ./datasets/CM --name brightfield2fluorescence --model pix2pix --direction AtoB --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 1536 --use_resize_conv --eval --num_test 1000
    5. 比较模型预测的荧光图像与真实（即实验获得）的荧光图像。在像素层面，使用皮尔逊相关系数比较预测强度与真实强度。此外，在图像层面，使用皮尔逊相关系数比较预测的分化效率指数与真实值。运行 "stage_III/evaluation/pixel_correlation.m" 和 "image_correlation.ipynb" 进行这些比较（图 3K、L）。
    6. 将训练好的模型应用于新批次在阶段 III 识别心肌细胞。将心肌细胞的新明场图像输入训练好的 pix2pix 模型，获得荧光图像和分化效率的 in-silico 预测。
      注意：为减少细胞污染，基于 DACT-1 的光激活细胞分选也可用于纯化模型识别的心肌细胞。

结果

基于明场成像与机器学习（ML），可对整体分化过程进行智能监测与优化。在多能干细胞（PSC）阶段，我们开发了一种机器学习模型，能够根据初始PSC集落的形态学特征预测最终的分化效率，从而确定启动分化的最合适时机（图4A，B）。随机森林模型所预测的分化效率与实际分化效率高度相关（Pearson相关系数 r = 0.76，P < 0.0001）（图4B）。训练后的模型还揭示了对分化过程最为关键的特征。在所有集落形态学特征中，中心-轮廓距离（CCD）的标准差、最小值及最小/最大比值，以及周长、面积、面积/周长比、凸性（convexity）和圆形度（circularity），是重要性权重最高的8项特征。这些特征与最终效率之间的关系表明，具有适中面积且边缘较长、不规则的初始PSC集落往往具有更高的分化效率（图4A），这启发我们通过延长消化液处理时间，获得更小且边界更长、更不规则的集落，以提高分化效率（参见实验方案步骤1.3.1）。基于机器学习的PSC集落监测与优化的细胞传代操作，实现了对初始细胞状态的优化。

在心脏分化第一阶段，我们利用机器学习评估并调整了CHIR（早期心脏分化的诱导剂）的剂量。通过逻辑回归方法，可在0-12小时的延时相差图像基础上早期评估CHIR剂量。当CHIR处理时长设定为24小时时，逻辑回归分类器的准确率达到93.1%，精确度为88.7%，召回率为94.5%，F1得分为91.1%，AUC为97.2%。在不同CHIR剂量条件下，实验中的“偏差评分”（预测结果）与“ΔCHIR浓度”（真实结果）高度相关（Pearson相关系数 r = 0.82，P < 0.0001）（图4C、D），表明机器学习预测能够反映CHIR剂量偏离最优值的程度。通过早期评估CHIR剂量，我们可在48小时之前调整CHIR处理的持续时间或浓度至最优水平，从而及时纠正分化偏差的细胞轨迹，维持心肌细胞高效分化。

我们还构建了机器学习模型，用于从分化第二阶段和第三阶段的明场图像中有效识别心前体细胞（CPCs）和心肌细胞（CMs）（图5A-D）。通过输入活细胞的明场图像，训练好的机器学习模型可预测CPCs和CMs的区域分布，并无创地评估最终的分化效率。在CPC识别方面，ResNeSt和Grad-CAM预测的CPC分割掩膜与人工标注的掩膜基本一致（图5A），平均交并比（IoU）为59.0%。预测的CPC区域比例也可作为最终分化效率的指标（Pearson相关系数 r = 0.88，P < 0.0001）（图5B）。在CM识别方面，pix2pix模型能够生成与真实（实验获得）的cTnT荧光图像高度相似的荧光图像（图5C），预测的与真实的全孔分化效率指数之间具有高度相关性（Pearson相关系数 r = 0.93，P < 0.0001）（图5D）。该方法避免了免疫荧光染色或流式分选对细胞造成的不可逆损伤。基于一种光激活探针（DACT-1），我们成功实现了无需生物标志物的高效区域选择性CPC纯化（图5E、F），从而可在分化过程中实时纯化目标细胞类型。

因此，通过结合活细胞明场成像与机器学习，该方法实现了在整个分化过程中对细胞谱系的实时预测与效率评估，从而调控并稳定PSC分化。

CM 分化流程图：细胞成像、机器学习、反馈、干预过程。
图 1：机器学习辅助的 CM 分化工作流程示意图。 实验人员进行心肌细胞分化，并从显微镜获取延时相差成像的细胞图像；在 CM 分化的各个阶段，图像被输入训练好的机器学习模型进行预测；实验人员利用预测结果作为反馈，实时调节和优化分化方案，以实现稳定且高效的分化。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养显微图像；观察形态、细胞密度；包括荧光Hoechst染色。
图2：细胞图像采集。（A）PSC阶段70%细胞融合度的明场活细胞图像示例。（B）PSC阶段80-90%细胞融合度的明场活细胞图像示例。（C）CPC阶段的明场活细胞图像示例。（D）CM阶段的明场活细胞图像示例。（E）同一视野下免疫荧光染色后的明场与荧光图像示例。（A-E）比例尺 = 250 µm。缩写：PSC = 多能干细胞；CPC = 心脏前体细胞；CM = 心肌细胞；cTnT = 心肌肌钙蛋白T。请点击此处查看该图的放大版本。

数据处理流程图，包含图表、代码和结果表格；编程与软件界面。
图 3：机器学习应用的截图。（A-C）多能干细胞（PSC）阶段机器学习的代表性截图，包括（A）数据集准备、（B）模型性能测试以及（C）特征重要性解释。（D-F）I 阶段机器学习的代表性截图，包括（D）数据集准备和（E,F）模型评估。（G-I）II 阶段机器学习的代表性截图，包括（G）数据集准备、（H）模型训练以及（I）模型评估。（J-L）III 阶段机器学习的代表性截图，包括（J）模型训练和（K,L）模型评估。缩写：ML = machine learning（机器学习）；PSC = pluripotent stem cell（多能干细胞）。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分化指标分析；用于统计评估的柱状图、散点图和热图。
图 4：基于机器学习的心肌细胞分化在多能干细胞阶段及第 I 阶段的代表性结果。（A）多能干细胞阶段特征可视化的结果。展示了分化效率与八个最重要特征之间的关系。特征重要性由训练好的机器学习模型确定。每个特征的取值范围被划分为 20 个区间，对每个区间内孔的分化效率指数进行平均，并以颜色显示。颜色变化的趋势表示每个形态学特征对最终分化效率的影响。这些结果共同表明，适中的面积、更长的周长、更大的中心-轮廓距离变化性、较低的圆形度以及较高的凸度更有利于分化。（B）在多能干细胞阶段通过真实值与预测的分化效率指数之间的相关性分析对机器学习性能进行评估。高相关性表明，多能干细胞集落的分化潜能可通过其形态学特征进行预测。n = 584 个孔。（C）在第 I 阶段通过预测的偏差评分与每个 CHIR 剂量条件下真实 ΔCHIR 浓度之间的相关性分析评估机器学习性能。偏差评分（范围为 -1 至 1）通过机器学习利用 0–12 小时的明场图像流无创预测。ΔCHIR 浓度（…, -4 µM, -2 µM, 0, 2 µM, 4 µM, …）通过最终的分化结果实验测定，用于衡量每种 CHIR 条件下相对于最优条件的实际偏差。预测的偏差评分能高度指示实际的 ΔCHIR 浓度，表明机器学习预测可作为 CHIR 剂量评估与调整的信号。蓝色和红色框分别代表剂量不足和剂量过量的情况。（D）在第 I 阶段使用跨批次验证评估机器学习性能。每轮中，一个批次用于测试，其余用于训练，以检验机器学习模型在新批次上的泛化能力。对预测的偏差评分与真实 ΔCHIR 浓度（在 CHIR 处理时长为 24 小时条件下）进行相关性分析。点的颜色代表不同的测试批次。n = 20 个 CHIR 剂量。本图引自 Yang 等人35。缩写：ML = 机器学习；PSC = 多能干细胞；CHIR = CHIR99021。请点击此处查看该图的放大版本。

心肌细胞分化；cTnT荧光；图像分类；像素相关性；图分析。
图5：基于机器学习的心肌细胞分化在心前体细胞阶段和心肌细胞阶段的代表性结果。（A）阶段II中机器学习识别心前体细胞（CPC）的典型结果。显示的是第12天的真实cTnT荧光图像（左），人工标注的CPC区域（中），以及利用第6天明场图像通过机器学习预测的CPC区域（右）。预测结果与实际实验结果高度相似。比例尺 = 1 mm。（B）通过真实分化效率指数（来自第12天cTnT荧光标记）与预测的CPC区域百分比（来自第6天明场图像）之间的相关性分析，对阶段II中机器学习性能进行评估。高度相关性表明，可在阶段II无创地预测分化效率。真实分化效率指数在0%至100%之间归一化。n = 35孔。（C）阶段III中机器学习识别心肌细胞（CM）的典型结果。显示的是真实cTnT荧光结果（左），预测的cTnT荧光结果（中），以及比较每个像素处预测与真实荧光强度的热图（右）。荧光图像被调整为512 × 512像素，热图中各区间内的数字表示每100个像素的频率计数。大部分像素位于热图的对角线上，表明预测与真实的荧光强度接近。比例尺 = 1 mm。（D）通过真实与预测分化效率指数之间的相关性分析，评估阶段III中机器学习的性能。真实与预测的分化效率指数均在0%至100%之间归一化。n = 36孔。（E）第6天图像识别的CPC纯化效果。经过FACS分选并培养6天后，与DACT-1标记的非CPC及对照组（CTL）细胞相比，未标记的图像识别CPC显示出较高的心肌细胞纯度。比例尺 = 100 µm。（F）通过比较（E）中cTnT+细胞百分比对纯化效果进行定量分析。数据为均值 ± 标准差（SD）。n = 5张图像。* P < 0.05；**** P < 0.0001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Dunnett多重比较检验。本图引自Yang等35。缩写：ML = 机器学习（machine learning）；PSC = 多能干细胞（pluripotent stem cell）；CPC = 心前体细胞（cardiac progenitor cell）；CM = 心肌细胞（cardiomyocyte）；cTnT = 心肌肌钙蛋白T（cardiac Troponin T）。 请点击此处查看该图的放大版本。

观察到的问题可能原因解决方案
机器学习模型在训练集上表现不佳。1. 机器学习模型的训练未能良好收敛。
2. 对于传统机器学习方法，提取的图像特征不足以反映细胞状态和谱系。
3. 对于深度学习方法，所设计神经网络的表征能力不足以完成任务。
4. 任务本身难以学习。		1. 调整超参数，例如增加训练轮数（epochs）并修改学习率。
2. 观察图像以寻找与细胞状态相关的形态学线索，设计符合生物学逻辑的特征。
3. 修改网络结构以提高其复杂性。
4. 检查数据集，确保目标细胞的特征易于识别。若模型无法学习该任务，可尝试在成像线索更清晰的阶段应用机器学习，或设计更简单的任务。
机器学习模型在训练集上表现良好，但在测试集上表现不佳。1. 模型对训练集过拟合。1. 扩充训练数据集并重新训练模型。通过纳入更多细胞系、分化条件和成像条件来提高训练数据的多样性。
对于传统机器学习方法，使用特征选择以减少输入特征数量，可能有助于提升模型的泛化能力。
机器学习模型在新批次或新细胞系上表现不佳。1. 显微镜及成像参数发生变化。
2. 不同细胞系的形态学特征可能存在差异。		1. 确保使用的成像设备与模型训练时一致。
2. 收集来自新细胞系和/或新成像条件的标注数据，重新训练或微调机器学习模型。
基于机器学习指导的分化过程调控未见改善分化结果。1. 机器学习输出结果不准确。
2. 实验试剂或操作流程存在问题。
3. 细胞系本身存在缺陷，缺乏分化能力。		1. 尝试上述提到的故障排查步骤。
2. 检查实验室试剂和实验操作流程。
3. 更换细胞系。
纯化后仍存在细胞类型污染。1. 预测结果不准确。
2. 一些非目标细胞位于纯化区域边缘而被包入。		1. 优化机器学习模型的预测结果。
2. 更保守地使用机器学习预测结果，例如适当缩小CM区域的范围。
纯化后细胞状态较差。1. 激光光毒性。
2. 操作过程缓慢。
3. 消化过程导致细胞损伤。
4. 流式分选过程造成细胞损伤。		1. 通过激光辐照消除非目标细胞，而非照射目标细胞。
2. 加快操作速度。
3. 调整传代方法，例如降低消化酶浓度。
4. 调整分选方法，例如降低分选过程中设定的细胞流速。

表1：故障排除表。

讨论

在此，我们描述了一种详细的实验方案，旨在克服当前多能干细胞（PSC）应用与转化中的主要问题之一——细胞分化过程中的变异性。通过结合活细胞明场成像与机器学习（ML）技术，我们逐步优化了PSC的分化流程，实现了在不同细胞系和批次间稳定高效的分化效果。然而，在上述分化过程中，该方案中的若干关键步骤对分化成败具有决定性影响。由于PSC阶段及第一阶段的细胞状态至关重要，实验人员需特别关注早期细胞形态、第0天的细胞汇合度以及CHIR处理条件。此外，在0–48小时期间调整CHIR剂量时，实验人员应尽量保留原始培养基，并保持细胞培养液体积不变。同时，在成像与纯化过程中需考虑光毒性问题。选择明场成像而非荧光成像可减少细胞损伤；基于此，我们采用紫外光（UV）激活非目标细胞而非目标细胞进行光清除。此外，我们上述基于图像信息的纯化步骤较为繁琐，需经历多次图像预测、区域光激活、流过式清除及传代等操作，因而难以实现大量细胞的高效纯化原位 如果可使用其他区域选择性细胞杀伤装置，则可考虑采用纯化步骤，从而无需细胞传代操作。

然而，在应用机器学习调控分化过程时，也需考虑若干问题。数据集的质量以及模型和超参数的选择对机器学习的性能具有重要影响。我们所采用的具体实现方法并不能保证在所有分化系统和细胞类型中均为最优；因此，经验丰富的机器学习工程师应根据自身需求定制实现方案。在训练和测试机器学习模型时，若测试性能远低于训练性能，则模型可能存在过拟合现象；此时可尝试扩充训练数据集并重新训练模型。若模型即使在训练集上也无法表现良好，则需检查数据集，并确保目标细胞的特征能够被清晰识别，调整超参数也可能有所帮助。此外，在实际场景中应用机器学习模型时，应确保显微镜和成像参数与模型训练期间保持一致，否则训练所得模型的性能将下降。如果成像条件的改变不可避免，则应从新条件下获取带标签的数据，并重新训练或微调机器学习模型。最后，若在机器学习辅助后细胞分化仍不成功，则需考虑诸如PSC细胞系固有的分化倾向或实验试剂批次差异等因素，这些问题可能更为根本，无法通过本策略解决。本文提供了故障排查指南，以帮助识别和解决潜在问题（表1）。

该方法有望应用于其他细胞研究领域。在多能干细胞（PSC）分化过程中普遍存在变异性，例如PSC分化的神经元、肝细胞、胰岛细胞和肠细胞40,41,42,43,44，严重阻碍了细胞的大规模生产。然而，细胞在命运转变过程中通常表现出丰富且多样的形态学特征，这些特征为利用基于图像的机器学习（ML）调控分化过程提供了线索。我们此前已证明该策略在肾祖细胞和肝细胞分化系统中的应用价值35。该方法有望被用于标准化其他细胞命运诱导系统，例如类器官分化、直接转分化或细胞重编程，特别是那些需要多步骤和复杂诱导因子的不稳定系统。

披露

赵阳、张珏、杨晓春、王瑶和陈代超正在为本文报道的PSC分化策略申请专利（202210525166.X）。

致谢

我们感谢孙启石、Yao Wang、夏宇、杨金玉、林畅、岑子默、梁东东、魏蓉、徐泽、席广银、薛刚、叶灿、王立鹏、邹鹏、王世强、Pablo Rivera-Fuentes、Salome Püntener、陈志星、刘毅和张珏为本策略奠定的基础工作。本研究得到国家重大研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFA0800504，2019YFA0110000）和中国载人航天工程空间医学实验项目（HYZHXM01020）资助，项目负责人：Yang Zhao。 图1 使用 BioRender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056稀释后的消化液用于CPC和CM消化
PBS中的4% 多聚甲醛KeyGEN BioTECHKGIHC016
6孔细胞培养板NEST703001
96孔细胞培养板NEST701001
B27添加剂Gibco17504044
不含胰岛素的B27添加剂GibcoA1895601
牛血清白蛋白（BSA）GPC BIOTECHAA904-100G
Celldiscoverer 7Zeiss用于在整个分化过程中以及最终cTnT成像时拍摄明场图像的仪器
CHIR99021SelleckS1263
DMEM/F12Gibco12634010
驴抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记ThermoA-21202二抗
FACSAria IIIBD Biosciences流式细胞分选仪
胎牛血清（FBS）VISTECHSE100-B
Hoechst 33342YEASEN40732ES03
人多能干细胞化学成分明确培养基Cauliscell Inc400105PSC制备培养基的基础培养基
iPS-18TaKaRaY00300
iPS-B1CellapyCA4025106
iPS-FNuwacellRC01001-B
iPS-MNuwacellRC01001-A
IWR1-1-endoSelleckS7086IWR1
Jupyter NotebookN/A版本 6.4.0https://jupyter.org/
MATLABMathWorks版本 R2020a用于科学计算和图像标注的软件
Matrigel基质Corning354230Matrigel
小鼠单克隆IgG1抗cTnT抗体ThermoMA5-12960cTnT一抗
正常驴血清Jackson017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 数字CMOS相机HamamatsuC13440-20CU装配在Celldiscoverer7上的数字相机
PBSNEB21-040-CVR
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 基础培养基CellapyCA1007500-1PSC培养基的基础培养基
Pluripotency Growth Mater 1 添加剂CellapyCA1007500-2PSC培养基的添加剂
PrismGraphpad版本 8/9用于统计分析和绘图的统计软件
PythonN/A版本 3.6用于科学计算的Python 3环境，包含pytorch（1.9.0）、numpy、scipy、pandas、visdom、scikit-learn、scikit-image、opencv-python和matplotlib等软件包，用于科学计算和图像标注。
RPMI 1640Gibco11875176
补充剂 hPSC-CDM（500倍浓缩）Cauliscell Inc00015PSC制备培养基的补充剂
TiENikon一台经改装的倒置荧光显微镜，用于区域选择性纯化
Triton X-100Amresco9002-93-1
Versene溶液Thermo15040066用于PSC消化的EDTA溶液
Y27632SelleckS6390
ZenZeiss版本 3.1Celldiscoverer7的配套软件，用于 图像采集、处理与分析

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