小鼠模型中非固定性下颌骨骨折的微创技术

摘要

本方案介绍了一种全面且高效的下颌骨修复分析方法。我们描述了一种在小鼠模型中建立非稳定型下颌骨骨折的可重复技术，可在组织损伤和骨量丢失最小化的情况下，用于分析软骨内成骨修复过程。

摘要

可在小鼠下颌部位制造非稳定型骨折，从而通过软骨内成骨模式分析骨修复过程。为最准确地反映该过程 体内为避免过度的骨量丢失和软组织损伤，尤其是下颌部位——这一解剖区域具有操作空间有限的特点，建立标准化操作流程十分必要。据我们所知，本文首次描述了一种在小鼠中建立非固定下颌骨骨折的微创操作方案。成年小鼠通过异氟烷麻醉，并在术前皮下注射布托啡诺镇痛。采用下颌下入路，在下颌骨下缘沿其走行方向做皮肤切口。使用骨膜剥离器在下颌支区域沿骨膜下平面剥离并抬起咬肌。利用压电骨切割设备，在基础边缘处持续生理盐水灌注条件下，从下颌基底部至髁突与冠突之间的冠突切迹处实施垂直、完全性骨折，再以剪刀完成下颌支的完全断裂。皮肤切口使用丝线缝合关闭。该非固定下颌骨骨折的详细操作流程可有效减少骨量丢失与软组织损伤，具有操作高效、结果稳定可靠的特点，能够准确反映小鼠模型中软骨内成骨修复过程。

引言

骨修复过程涉及膜内成骨和软骨内成骨两种机制，具体取决于骨折或截骨术后的固定情况。经过稳定固定的骨截骨或骨折修复主要依赖于膜内成骨，而未固定或固定不良的骨折或截骨则通过软骨内成骨方式进行愈合¹。膜内成骨修复的特征是间充质细胞直接分化为成骨细胞并形成新骨；而软骨内成骨修复则首先形成暂时性的软骨模板，该软骨模板随后分化为成骨细胞，进而形成骨痂²。

骨修复依赖于多种组织和细胞间的相互作用，同时也受到部位特异性因素以及作用于骨痂上的力的影响³。下颌骨是一种承受咀嚼力的活动性骨骼，主要由皮质骨构成。下颌骨修复过程受骨折部位和骨折方向的影响。众所周知，肌肉和骨膜损伤可能影响骨愈合，同时导致骨折部位出现显著的骨量丢失^4,5,6。

分析软骨内下颌骨修复需要标准化且可重复的方案，以实现有价值且无偏倚的比较。根据现有文献，仅有少数作者报道了小鼠模型中非固定下颌骨骨折的实验方案^3,7，且多数集中在磨牙水平的前部区域⁸。通过建立该技术，我们旨在避免肌肉和骨膜损伤，并将骨折部位的骨量丢失降至最低，从而在无混杂因素干扰的情况下最佳地分析软骨内成骨修复过程。此外，开发小鼠下颌骨骨折新方法的目的还在于减少此类小型动物手术后常见的疼痛和动物死亡。本研究首次描述了一种在小鼠下颌支水平进行非固定下颌骨骨折的微创方案。该体内实验方案可避免骨折部位过度的肌肉和骨膜损伤或骨量丢失，有助于降低术后疼痛程度及动物死亡风险。

方案

本方案遵循巴黎居里研究所的动物护理指南，并已通过伦理委员会和法国教育部（APAFIS 26995）的审核批准。

1. 动物

1. 确定每组动物数量。我们建议每组使用 12 只动物。确定小鼠的性别和年龄。本方案适用于 6 周龄的 C57BL/6J 小鼠（雄性或雌性）。
2. 在实验操作前至少 1 周，给予动物营养补充凝胶以适应环境。

2. 手术步骤

1. 准备所需材料。将器械进行高压灭菌：剪刀、持针器、镊子、压电骨外科设备的刀头和手柄，以及骨膜剥离器。另准备无菌手套、丝线（4/0）、剃毛刀、棉纱布、10% 聚维酮碘溶液、加热台、异氟烷及用于异氟烷吸入的鼻罩。
2. 按 0.1 mg/kg 剂量配制布托啡诺，并用无菌注射用生理盐水稀释。在手术前 30 分钟，使用 25G 针头进行皮下注射。
3. 准备加热板（37 °C），在其上放置泡沫支撑垫，并用小针或胶带固定鼻罩。
4. 将小鼠放入异氟烷诱导箱中进行麻醉诱导，异氟烷扩散浓度为 4%。通过脚趾夹捏试验检测麻醉深度；若麻醉充分，则无足底反射。
5. 在整个手术过程中，将麻醉后的小鼠仰卧于覆盖无菌巾并维持在 37 °C 的加热板上。将鼻罩置于小鼠鼻部以实现异氟烷持续吸入（维持浓度为 2.5%），并用胶带固定小鼠四肢。
6. 双侧涂抹眼用润滑剂，以防止全身麻醉引起的眼部干燥。剃除下颌下区域毛发，佩戴无菌手套，并用 10% 聚维酮碘溶液及酒精多次擦拭皮肤进行消毒。
7. 按以下步骤进行下颌下皮肤切口：
   1. 使用显微剪刀从下颌角至下颌骨水平支后 1/3 与前 2/3 交界处做皮肤切口。
   2. 分离皮下组织，暴露咬肌。
8. 使用骨膜剥离器从下颌骨下缘处分离咬肌附着点。
9. 沿下颌支在骨膜下平面使用骨膜剥离器将咬肌掀起。
10. 在下颌骨下缘、下颌角前方的下颌凹陷后部，使用压电骨外科设备在生理盐水灌注（最大 10 mL/min）条件下制作一小段骨切开（长度 3 mm）（图 1，图 2）。
11. 定位下颌骨后缘及冠状切迹（使用显微剪刀或镊子），然后沿下颌支插入小型直剪完成骨折，以避免对咬肌造成额外撕裂和损伤。为确保骨折方向正确，应将剪刀垂直于下颌骨下缘放置。
12. 确认骨折完全：使用镊子轻柔移动两个骨段时，应观察到两骨段之间完全分离、无骨性连接。
13. 使用丝线（4/0）间断缝合关闭皮肤切口。骨膜层无需缝合。
    注：也可使用其他非吸收性缝线（如聚丙烯缝线）缝合皮肤切口。
14. 拍摄头颅侧位 X 光片以确认骨折方向（图 3）。
    1. 在拍摄 X 光片前，将小鼠再次放入异氟烷诱导箱中进行短暂再诱导。随后将小鼠置于伸展位，侧卧，头部稍呈过伸位，以便进行 X 光分析。
    2. 若骨折位置过于靠前，累及下颌磨牙区域，或骨折导致下颌角完全游离（图 4），则可观察到骨痂体积异常增大。此类动物应从研究中剔除，以避免分析偏差。
15. 将小鼠留观至恢复意识后，再放回笼中。

3. 术后护理

1. 准备一个不含颗粒饲料和硬质丰容物的小鼠笼，以避免任何咀嚼力。
2. 将手术后的 小鼠 单独隔离在 1 个笼子中^st 术后每周更换一次敷料，直至皮肤完全愈合。术后1周，将同组手术雌性小鼠合并在同一笼中饲养。
3. 术后4小时、24小时、48小时和72小时，通过皮下注射给予布托啡诺（0.1 mg/kg）。
4. 术后从第0天至巩固期结束（即28天）期间，始终为小鼠提供软质饮食凝胶，以避免疼痛及骨折的继发性移位。
5. 从骨折当天（第0天）至第4天，每天早晨在注射布托啡诺前对小鼠进行称重，之后每周称重3次，直至动物处死（骨折后14天）。
6. 评估术后动物福利以优化术后动物护理。使用以下评分标准： 表1 用于评估动物的术后状态并调整随访方案。当评分达到 > 1，给予布托啡诺注射，当评分为 > 3 和/或出现体重减轻时 > 尽管进行了食物强化，术前体重仍减轻了20%，必须讨论实施安乐死表1).

结果

对于体内手术操作而言，为了在小鼠模型中成功实施非固定性下颌骨骨折手术，需要经过专门的学习和培训。

这种用于非固定下颌骨骨折的技术可用于研究软骨内成骨修复过程。在实施安乐死后，采集下颌骨样本并置于4%多聚甲醛中固定24小时。经pH 8的EDTA完全脱钙后，将组织样本包埋于石蜡中。随后进行连续矢状面切片，使用脱蜡液脱蜡，并经再水化处理后，按照标准方案进行茜素红/阿利新蓝染色。组织学图像证实形成了以软骨为模板的软性骨痂（图5）。微计算机断层扫描（micro-CT）分析显示，骨折后4周骨愈合完成。我们建议在骨痂形成开始至骨愈合结束（即第28天）的不同关键时间点（例如每7天，即第7、14、21天，或根据研究目的设定更密集的时间点）对骨修复过程进行研究，并结合组织形态学与micro-CT形态计量学分析。

根据对58只野生型小鼠（C57BL/6J背景）进行该手术操作的回顾性分析，本方案的成功率为86.3%，排除率为13.7%。排除原因包括术后早期因提前自发死亡（3%），因动物出现危重评分而实施安乐死的决定（1%；评分为>3和/或体重减轻>20%），或截骨位置异常导致下颌角异常劈裂（5%），以及骨折发生在磨牙水平的情况（n=1/58）。在后一种情况下观察到感染，即骨折在磨牙水平发生异常劈裂（n=1/58；表2）。

图1：图像 t下颌骨升支的下颌下皮肤入路。 使用压电骨刀插入下颌骨下缘进行截骨，可实现最小程度的骨量损失（箭头所示）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：小鼠下颌骨染色图。 6周龄野生型小鼠下颌骨的侧面观（经茜素红/阿利新蓝染色）：1. 髁突，2. 冠突，3. 冠突切迹，4. 角突，5. 下颌支后缘，6. 下颌基底部（或下缘）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：小鼠颅骨的X光片。 野生型6周龄小鼠颅骨的侧位X光片（矢状面视图），显示未骨折小鼠下颌骨的形态（左图），以及骨折小鼠下颌骨的形态和非稳定型下颌骨骨折的方向（箭头所示），骨折线从下缘延伸至冠状切迹，位于髁突前方（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4．小鼠头骨在非理想条件下的X光成像。 野生型6周龄小鼠头骨的侧位X光片（矢状面视图），显示下颌角异常骨折（箭头所示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：代表性结果。野生型小鼠（C57BL/6J）骨折后第14天的结果。 下颌骨骨折部位重建的µCT扫描的代表性三维冠状面图像，显示骨痂形成（白色箭头）。骨痂软骨的代表性图像（Sirius Red/Alcian Blue染色），证实存在软骨内成骨修复过程。缩写：B = 骨，C = 软骨。比例尺：200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

	0	1	2
动物状态	正常	排便减少	毛发竖立、背部弓起
行为	正常	活动减少	活动减少、摄食量降低、体重下降 > 10 %
临床症状	正常	手术瘢痕炎症	瘢痕裂开、感染

表1. 术后健康状况评分标准。

	n = 58 只小鼠
成功率	86.3 %
排除率：	13.7 %
过早的自发性死亡	3%
严重评分 < 3，和/或体重减轻 > 20 %	1%
骨折裂隙异常延伸至下颌角	5%
磨牙水平处骨折裂隙异常	1.7 %

表2. 实验方案的成功率与排除率。

讨论

该技术可在小鼠模型中通过最小开放入路，在较短的操作时间（约10分钟或更短）内实现非稳定的下颌骨骨折。这种短时操作可降低动物的发病率和死亡风险，尤其适用于小鼠等小型动物。为了在分析软骨内骨愈合过程时获得可比的结果，应特别注意使下颌骨骨折的方向保持一致，避免下颌角出现异常裂开，因为这种不良效应可能导致骨痂体积异常增大并延迟骨愈合时间。本下颌骨骨折方案不会影响术后下颌门齿的生长。为提高本方案的操作效果，建议实验人员首先在同龄的安乐死动物上进行练习，并在造成下颌骨骨折后立即解剖，以必要时直接观察骨折方向。

来自邻近肌肉并迁移至骨痂的间充质前体细胞参与骨修复过程⁶。已有研究表明，骨膜和肌肉损伤会影响骨愈合^5,6。此外，大范围的肌肉切开会增加出血风险，并可能导致术后感染。压电骨切割技术已在颅颌面骨外科领域广泛应用；与传统截骨术相比，该技术被报道具有更低的软组织损伤率和术后疼痛发生率^7,9。为了尽量减少咬肌和骨膜的损伤，我们采用压电骨切割技术在下颌骨下缘起始骨折，然后在下颌支上部使用剪刀完成截骨，以避免对咬肌进行大范围切开。该操作要求在使用剪刀截断下颌支上部之前，准确定位下颌骨后缘和喙突切迹的位置。在下颌骨下缘使用压电骨切割技术起始骨折后，我们使用小型直剪刀顺利完成骨折，未遇到任何困难。我们在不同遗传背景的成年小鼠（C57BL/6J、CD1（结果未显示））中实施了该操作，这些小鼠具有不同的骨密度和下颌骨大小（如颌前突、颌后缩）。然而，我们建议在操作前确认剪刀长度是否合适，以确保仅需一次操作即可完成下颌支上部的截骨，避免出现异常的骨折分叉。

由于采用这种微创开放入路，本操作中出血风险被降至最低。在肌肉剥离过程中如发生大量出血，使用纱布对术区进行短暂加压即可止血。当下颌骨折位置过于靠前，导致磨牙发生骨折时，可能存在手术部位感染的潜在风险；该不良反应可在术后侧位X光片中被发现。在此情况下，动物应被排除出研究。术后手术部位感染也可能由血肿引起；通过实施分层皮肤缝合可预防该情况，以便在术前发生异常出血时实现血液的自发引流。使用异氟烷进行全身麻醉，相较于 腹腔注射，可避免因腹腔注射带来的创伤性不良反应所导致的过高死亡率。根据我们的经验，未观察到任何直接与异氟烷全身麻醉相关的动物死亡病例。

小鼠术后可能出现食物摄入量减少的情况。若食物摄入不足或体重增长不充分，可在凝胶中添加过筛的颗粒饲料粉末。为改善术后进食情况，建议在手术前至少1周开始给予含有颗粒饲料的营养补充凝胶，以适应饮食。我们建议在随访期间（随访期间每周一次）以及处死动物时进行额外的X光检查，以评估是否存在骨折移位。在非病理性条件下，骨折后4周骨愈合即已完成。

多位作者已描述了小鼠下颌骨非固定性骨折的不同实验方案^3,10,11。用于实施截骨的器械可能各不相同，例如钻头、外科镊子等。然而，使用钻头可能导致较大的骨质丢失和软组织损伤。据我们所知，本项非固定性下颌骨骨折操作是首次将压电骨切割术与剪刀结合用于完成截骨。该技术的优势在于可在最大限度减少骨质丢失的同时，实现精确截骨并保护软组织。

与所有技术一样，该方法也存在一些局限性。我们倾向于在使用压电手术刀头初步形成骨折线后，改用剪刀完成骨折，以避免过度切断咬肌及损伤骨膜，从而防止可能的骨愈合延迟和/或假关节形成。然而，该技术需要在无法完全直视下颌支的情况下控制冠状切迹的位置，以确保骨折沿预定方向进行，因此存在一定的学习曲线，其掌握程度取决于术者的手术经验。此外，由于X射线设备的不同，下颌骨骨折在X光片上的方向可能难以清晰显示。我们并未使用 体内 采用微型计算机断层扫描（micro-CT）确认骨折方向，以避免因全身麻醉时间延长而影响小鼠术后恢复。

研究软骨内成骨修复过程需要建立非稳定的骨折模型，从而更深入地理解骨修复的生物学机制。若希望在具有骨修复缺陷的小鼠模型中开展临床前试验，以期开发针对遗传性疾病或创伤后、肿瘤后遗症所致骨修复障碍及假关节形成的新型临床治疗方法，这一环节至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
布托啡诺：Buprecare 0.3 mg/kg	Animalcare
OBWEGESER 型牵开器，宽度 6 mm，长度 17.5 cm	Collin Medical	HA 5905
镊子：MORIA 11 cm 平板镊 N°5	MORIA	9906
加热台 Bioseblab 55 cm × 33 cm	Bioseblab	707
持针器：Micro Halsey 持针器 - 金属	LABODERM	21,100
Neo Clear	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	109843
Ocry Gel 管装 10 g（眼用润滑剂）	tvm lab	3.70045E+12
Piezotome 2 ASS FINAL	ACTEON	X57402
Piezotome 用 Piezocision PZ3 插头	ACTEON	F87574
显微剪刀	MORIA	MC52
丝线缝合线 PERMA HAND SEIDE  / MERSILK	ETHICON	REF 18501G
直剪刀	MORIA	4877A
Vetflurane（异氟烷）250 ml	VIRBAC	VET066 (Centravet)