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使用微移液管引导给药作为啮齿类动物模型中口服灌胃的替代方法

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DOI：

10.3791/66836

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2024年7月26日

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1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种微移液管引导的药物给药方法（MDA），作为口服灌胃的替代方案。该方法可促使实验动物主动摄入药物，显著减少应激与不适。

摘要

使用连接注射器的套管进行口服灌胃（OG）是将化合物精确剂量递送至实验动物胃部的常用方法之一。然而，该方法对操作者和实验动物均存在操作困难。研究表明，OG 可能导致食管炎、食管穿孔以及药物误入气管等并发症。此外，OG 还与血浆和粪便中皮质酮水平升高（由于应激）、血压改变以及心率加快相关，这些因素可能对研究结果产生负面影响或引入偏倚。此前开发的一种替代方法称为微量移液引导给药（MDA），可促使动物主动摄取治疗药物，实现微创给药。本文展示了 MDA 技术在不同溶剂中重构的治疗药物中的应用实例，并证实该方法可有效将多种治疗药物递送至不同品系的小鼠。我们进一步证明，MDA 是一种可缩短给药时间、降低侵入性的技术，且通过核心肠道微生物物种的定量分析评估，该方法不会影响肠道微生物组的组成。总体而言，MDA 可能是比 OG 更低应激且有效的替代方案。

引言

在啮齿类动物模型中，药物给药通常通过口服灌胃（OG）实现，该方法使用连接在含有药液的注射器上的套管，将液体制剂直接送入动物胃内。该技术能够向动物提供稳定且精确的给药剂量，但也存在多种缺点。口服灌胃因无法充分模拟人类的膳食暴露方式而受到质疑1,2。此外，口服灌胃会增加上消化道意外损伤（如食管和胃穿孔）、药物误吸以及呼吸道病变的风险3。该方法还与动物不适4、血压和心率升高5，以及应激反应6,7相关，有时甚至因动物对灌胃耐受性降低而导致死亡8。这些生理变化可能干扰或混淆实验结果；因此，研究人员已探索新的给药方法以避免这些不良反应。已有研究采用多种替代口服灌胃的方法，例如使用明胶作为药物载体9、口服速溶膜（ODS）10、蔗糖包被的灌胃针11、柔性饲管、小麦饼干12、蜂蜜13和花生酱药丸14。然而，这些对口服灌胃技术的改良仍存在局限性，包括与水不溶性药物不相容、药物制备时间延长15、药物适口性和稳定性问题15，以及动物对食物载体产生习惯化。此外，当动物自由摄食时，可能存在给药剂量不够精确的风险。

Scarborough 等人7此前开发了一种小鼠的替代性口服给药方法，称为微量移液器引导给药法（micropipette-guided drug administration, MDA）。该给药方法以甜炼乳溶液作为药理物质的载体，通过单通道移液器和移液器吸头递送溶液，促使实验动物 readily 摄入配制好的载体和/或药物溶液。在实施该技术前，啮齿类动物需经历一个训练阶段（至少2天），以缩短操作时间，并使实验动物熟悉从移液器吸头中饮水的过程4。Scarborough 等人7和 Schalbetter 等人16的初步验证研究表明，MDA 操作简便、成本效益高、侵入性小，且相较于传统的口服灌胃（OG）方法，对动物造成的应激更小。Scarborough 等人首次将 MDA 技术应用于母体免疫激活（maternal immune activation, MIA）所致神经发育障碍的小鼠模型中7。该研究显示，采用 MDA 给予抗精神病药物利培酮的小鼠，其药代动力学特征与使用 OG 方法相当。此外，MDA 未引起小鼠皮质酮（一种应激激素）水平的升高，且通过 MDA 技术进行利培酮的慢性治疗，可剂量依赖性地改善 MIA 所致的社会交互缺陷和安非他明超敏反应7。其他研究也已在小鼠17和大鼠18模型中探讨了 MDA 与 OG 的疗效比较。MDA 还曾与腹腔注射进行对比，结果表明其在向小鼠递送氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide）方面具有同等有效性16。鉴于 MDA 在降低动物应激水平和治疗效果方面的已有成功报道，我们现拟进一步探索 MDA 技术作为药物递送有效手段在更多小鼠模型中的应用。本文中，我们描述了 MDA 方法在不同小鼠品系中的实施过程，包括免疫功能正常的 FVB/NJ 和 C57BL/6J 品系，以及免疫缺陷型 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）品系，并采用多种口服处理方式，包括活菌、溶于水不溶性溶液（玉米油）中的实验化合物以及载体对照。我们检测了不同处理在血清和粪便中的活性与存在情况，并评估了 MDA 方法对核心肠道菌群组成的影响。

方案

所有动物实验均按照机构指南进行，并在约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案 M021M197 和 M023M195 下实施。所使用的实验小鼠品系（雄性小鼠，7 周龄）详见于下文 材料表使用雄性小鼠是因其在前列腺癌的持续研究中的应用。此前已有研究表明，MDA 方法在雌性小鼠中同样有效。7,17小鼠被随机分配至各自的笼具/处理组。小鼠在笼内接受处理，处理顺序无特定规律。实施处理的实验人员对处理分组情况设盲。分配给小鼠的编号代表其个体标识号，而非处理顺序。研究全程收集数据，并在研究结束时进行分析，以避免任何偏倚。在所有数据收集完成前，实验检测均对处理分组设盲。

注意：本方案已根据 Scarborough 等人的研究进行了修改7。

1. 处理液的制备

  1. 使用甜炼乳（成分：牛奶和糖）与分子生物学级水按牛奶:水 = 3:10 的比例配制溶液。由于炼乳具有较高黏度，应使用15 mL锥形管量取甜炼乳。
  2. 在50 mL锥形管中，将分子生物学级水与甜炼乳混合，每次缓慢加入5 mL水，并与炼乳充分混匀。
    注意：此步骤需在生物安全柜中无菌条件下进行。
  3. 将配制好的牛奶溶液分装成若干份（每份500 µL），并于4 °C保存，直至与待测试处理物混合使用。
  4. 根据动物体重，将各处理物用相应的溶剂重悬至正确浓度，再与甜炼乳/水溶液混合。

2. MDA 培训课程

注意：本节描述的是小鼠模型；然而，MDA 技术可根据需要使用更大体积/移液器吸头，以适用于更大的啮齿类动物模型。

  1. 可选：用一只手轻轻抓住实验动物颈背部的皮肤以进行固定。
  2. 使用单通道移液器和200 µL吸头，将100 µL仅含甜炼乳/水溶液（不添加实验处理物质）缓慢导入动物口腔。
  3. 缓慢释放乳/水溶液，避免偏离动物口腔。确保动物在5–15秒内顺利摄入该乳液。
    注意：该训练需连续进行至少2天（每天一次训练），给药体积保持不变。MDA训练期间需要通过抓取颈背部皮肤进行轻度固定。Scarborough等7建议在MDA训练第一天对动物进行完全固定，第二天则仅通过尾巴固定。对于体型较大的啮齿类动物模型，固定方法可能有所不同。相比之下，Vanhecke等17在训练期间仅轻微抓住小鼠尾巴即可。

3. 使用 MDA 方法对小鼠进行处理

  1. 将研究用处理物与甜炼乳/水溶液混合（参见下方第4节和第5节中的验证实验示例）。
  2. 可选：用一只手轻轻抓住实验动物颈背部皮肤以进行轻柔固定。
    注意：Scarborough 等人7报道，小鼠在训练期结束后通常不再需要固定，可主动从移液枪尖端饮水。相比之下，Vanhecke 等人17报道，对于某些可能引起轻微味觉厌恶的处理（例如他莫昔芬），在每次给药时通过轻捏颈背部皮肤固定小鼠更有利于经口微量给药（MDA）的实施。该研究还发现，将动物仰卧位放置并辅以轻柔捏颈固定，可提高处理物摄入的时间效率和有效性。
  3. 使用单通道移液器和200 µL移液枪头，将100 µL处理物缓慢导入动物口腔，操作方式与训练阶段一致。
  4. 每次仅处理一只动物。
  5. 处理完成后，将每只动物放回其对应的笼具中。
    注意：采用MDA方法的处理可每日进行，也可重复多次7,17。

4. 验证实验 #1 —— 使用 MDA 口服递送肠道细菌至小鼠

注意：本节介绍使用 MDA 方法将活菌经口递送，用于小鼠肠道定植研究。在此代表性预实验中，将革兰氏阳性菌 Clostridium scindens 递送至 C57BL/6J 小鼠。在通过 MDA 进行细菌接种前，小鼠在饮水中连续两天接受抗生素（头孢西丁）处理。

  1. 细菌培养
    1. 使用强化梭菌肉汤（RCB）培养 C. scindens 菌株 ATCC 35704，从冻存甘油菌种中取 500 µL 接种至 7 mL RCB 培养管中，于 37 °C 厌氧条件下过夜培养。
    2. 取 500 µL 过夜培养的细菌接种至新的 RCB 培养管中，厌氧孵育 24 小时。将该培养管从厌氧舱中取出，用于制备 MDA 实验用的细菌处理液，并用此培养管计算每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。
  2. 计算 C. scindens 的 CFU/mL
    1. 将 C. scindens 培养物用 3.5 mL 接种至 7 mL RCB 培养基中，制备 1:3 稀释液。取该稀释液样品制备 1 mL 20% 甘油保存液（1:1），于 -80 °C 保存。
    2. 取 100 µL 的 1:3 稀释液涂布于强化梭菌琼脂（RCA）平板上。利用该初始稀释液进一步进行连续梯度稀释，并重复涂布，共进行三次额外的涂布操作。
    3. RCA 平板孵育后，计数菌落并计算 CFU。使用以下公式计算稀释样品及原始样品中的细菌细胞浓度：
      稀释样品中的 CFU（细胞/mL）=（RCA 平板上计数的菌落数）/（接种到 RCA 平板的稀释样品体积，单位为 mL）
      ​原始样品中的 CFU（细胞/mL）=（稀释样品中的 CFU）/（RCA 平板对应的稀释倍数）
  3. 制备用于 MDA 的 C. scindens 处理液
    1. 将 50 µL C. scindens 菌液（本示例中浓度为 1.265 × 106 CFU/mL）与 50 µL 加糖炼乳/水溶液混合。
      注：若需特定 CFU 浓度，可采用其他细菌定量方法，例如通过在 600 nm 处测定光密度（OD）建立标准曲线。
  4. 通过 MDA 对小鼠进行口服 C. scindens 处理
    1. 在第 1–3 天，按照第 2 节所述方法使小鼠适应牛奶溶液（MDA 训练阶段）。
    2. 在第 4 天，通过 MDA 向 C57BL/6J 小鼠给予 100 µL 的 C. scindens + 牛奶溶液或 PBS（对照组）+ 牛奶溶液。在整个研究期间仅处理一次。
  5. 粪便样本采集
    1. 轻轻抓握小鼠颈部皮肤使其固定，等待其排出粪便颗粒。直接从直肠收集粪便颗粒至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。样本保存于 -80 °C 直至使用。
  6. C. scindens 定量 PCR（qPCR）
    1. 采用已发表的方法进行粪便 DNA 提取19,20。
    2. 使用 DNA 荧光计测定 DNA 浓度，以实现高灵敏度检测。将 DNA 样本标准化至 10 ng/µL，并保存于 -20 °C 直至使用。
    3. 使用 qPCR 检测以下目标的丰度：(i) 利用针对 C. scindens 菌株 ATCC 35704 desA 基因的保守引物检测 C. scindens 细菌；(ii) 利用针对细菌 16S rRNA 基因 V6 高变区的引物检测总细菌，引物设计如先前所述20,21。
      注：表 1 中列出了所用 qPCR 条件和引物。使用 C. scindens 菌株 ATCC 35704 DNA 建立标准曲线，用于估算 desA+ 细菌的拷贝数。

5. 验证实验 #2 — 使用 MDA 向小鼠递送实验性药物

注意：本节描述了使用微透析（MDA）方法向小鼠递送实验化合物的过程。在此具有代表性的初步实验中，大豆代谢物雌马酚（S-雌马酚）被递送至NSG和FVB/NJ小鼠体内。

  1. S-雌马酚处理的制备
    注意：S-雌马酚和二甲基亚砜（DMSO）均分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
    1. 将 S-雌马酚用 DMSO 与玉米油（90%）混合复溶。将分装的 S-雌马酚溶于玉米油（220 µL）中，再加入 480 µL 甜炼乳/水溶液。在动物房内混合并搅拌该溶液，以避免油相与乳相分离。
      注意：若观察到溶液出现分层，给药前需重新混匀。给予小鼠的 S-雌马酚剂量为 25 mg/kg/天。本研究中使用的小鼠体重相近，因此给予相同剂量。根据实验动物的实际体重，可能需要调整剂量，并制备多种不同浓度的处理液。
    2. 将 DMSO 溶剂与玉米油（90%）混合。将分装的 DMSO 溶于玉米油（220 µL）中，再加入 480 µL 甜炼乳/水溶液。在动物房内混合并搅拌该溶液，以避免油相与乳相分离。
      注意：若观察到溶液出现分层，给药前需重新混匀。
  2. 使用 MDA 经口给予小鼠 S-雌马酚处理
    1. 在第 1 天和第 2 天，按照第 2 节（MDA 训练阶段）所述方法，使小鼠适应牛奶溶液。
      注意：在验证实验 #1 中，遵循 Scarborough 等人描述的训练时间，建议进行为期 3 天的适应期。本实验测试了较短的训练时间（2 天），发现其并未影响目标处理物的给药效果。
    2. 在第 3 至 43 天，对小鼠分别给予（i）PBS 对照、（ii）DMSO 溶剂或（iii）S-雌马酚，均与甜炼乳/水溶液混合。配制处理液的母液，以确保所有实验动物接受均一的处理溶液。每天每只小鼠给予 100 µL 总体积，每周给药 5 天，持续 43 天。
  3. 血液采集
    1. 通过心脏穿刺法在安乐死后（二氧化碳过量）采集血液。将血液转移至含血清分离胶的微量采血管中，混匀后于室温（RT）保存，待进一步处理。
    2. 以 254 × g 离心 5 分钟，完成血液样品的分离。收集上层血清，并于 -20 °C 保存至使用。
  4. S-雌马酚液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）检测
    1. 参见材料表文件，获取本实验所用的化学品与试剂。
    2. 标准曲线与质控样品制备：将 S-雌马酚和内标物（外消旋 equol-d4）分别用 DMSO 配制成 1 mg/mL 的储备液，并于 -20 °C 保存。
    3. 用乙腈：水（50:50）稀释储备标准品溶液，制备含不同浓度的混合工作液。将内标物用乙酸乙酯配制成 100 ng/mL 的提取液。储备液和工作液均于 4 °C 保存，每日新鲜稀释或直接使用。
    4. 样品提取
      1. 采用蛋白沉淀法进行样品处理，加入提取液（乙酸乙酯加内标物，见第 5.4.3 节），随后离心，并在 50 °C 条件下用干燥氮气蒸发上清液。
      2. 将残余物用 100 µL 50% 乙腈复溶，转移至自动进样瓶中用于 LC/MS/MS 分析。
    5. 样品分离
      1. 采用 C18 柱（2.1×50 mm，1.7 µm）实现分离。流动相 A 为 0.1% 甲酸水溶液，流动相 B 为含 0.1% 甲酸的乙腈溶液。
      2. 采用梯度洗脱程序：起始时流动相 B 保持在 40%，流速为 0.3 mL/min，持续 0.5 分钟；随后在 1 分钟内将 B 相升至 100%，保持 2 分钟，再于 1 分钟内恢复至 40% B。
      3. 使用电喷雾电离源的质谱检测器，在负离子模式下监测柱流出液。设定质谱仪监测以下多反应监测（MRM）离子对：S-雌马酚为 241 → 119.1，内标物 equol-d4 为 245 → 123。
      4. 采用二次方程配合 1/x2 加权函数，基于分析物峰面积与内标峰面积的比值，计算 S-雌马酚的标准曲线，校准范围为 5–500 ng/mL。

6. 测定MDA治疗对核心肠道微生物群的影响

注意：本部分介绍使用qPCR检测MDA处理后核心肠道微生物群的水平。

  1. 按照步骤 4.5.1 和 4.6.1 所述进行粪便样本采集和 DNA 提取。
  2. 使用 DNA 荧光计进行高灵敏度检测以确定 DNA 浓度。将 DNA 样本标准化至 10 ng/µL，并于 -20 °C 保存直至使用。
  3. 采用 qPCR 检测肠道微生物群成员的丰度：(i) Akkermansia muciniphila，(ii) Bifidobacterium spp.，(iii) Streptococcus salivarius，(iv) Lactobacillus spp.，以及 (v) 总细菌，所用引物针对细菌 16S rRNA 基因的 V6 高变区设计，具体方法如前所述20,21,22。
    注意：qPCR 反应条件及所用引物列于 表 2 中。

结果

MDA 可用于在小鼠模型中口服递送细菌菌株。C57BL/6J 小鼠在开始 MDA 训练前，接受为期 2 天的抗生素处理（饮水中添加头孢西丁），以清除共生微生物群。在给药前连续 3 天每天给予一次加糖炼乳/水溶液。在 MDA 处理期间，小鼠通过轻柔抓握颈部皮肤进行短暂固定。第 4 天，小鼠分别接受一次 PBS（阴性对照，n = 4）或C. scindens（desA+ 细菌，n = 4）厌氧培养物处理，该培养物此前已重悬于加糖炼乳/水溶液中。所有小鼠通常在数秒内完成给药，并饮尽全部剂量（100 µL）。为验证厌氧细菌的递送和定植情况，我们比较了抗生素处理后采集的粪便样本与 PBS 或C. scindens 处理后 24 小时采集的粪便样本（图 1）。提取粪便 DNA，定量并归一化至 10 ng/µL，随后使用针对C. scindens ATCC 35704 desA 基因的特异性引物进行 qPCR 检测（Table 1）。结果显示，经抗生素处理的小鼠体内 desA+ 细菌极少或几乎检测不到。与预期一致，C. scindens 处理组小鼠体内 desA+ 细菌数量显著高于 PBS 对照组（p = 0.0286，图 1）。

使用 MDA 方法递送实验性化合物（S-雌马酚）。 NSG（n = 15）和 FVB/NJ（n = 18）小鼠在给药前两天开始接受加糖炼乳/水溶液的训练。NSG 小鼠接受抗生素治疗（饮水中添加头孢西丁），以清除可产生雌马酚的肠道菌群，从而消除内源性雌马酚的生成。FVB/NJ 小鼠则饲喂无大豆饮食，以消除内源性雌马酚的产生。所有小鼠在给药时均通过轻柔抓握背部皮肤进行短暂固定。对照组给予加糖炼乳/水溶液联合玉米油，DMSO 组（S-雌马酚的溶剂对照）给予加糖炼乳/水溶液和溶于玉米油的 DMSO，雌马酚组给予加糖炼乳/水溶液和溶于玉米油的雌马酚。小鼠每周接受五天 MDA 技术给药，持续共 43 天。小鼠通常在数秒内接受处理，并饮尽全部剂量（100 µL）。总体而言，所有小鼠在任一特定日均至少摄入了半量剂量（某日为部分剂量，但在前一天或次日补足完整剂量）。在整个研究过程中，没有任何小鼠完全拒绝接受处理。我们观察到，在抓握固定后，将小鼠置于仰卧位可缩短给药耗时，并确保动物摄入全部剂量。

循环中的赤藓醇水平表明MDA药物递送有效。在研究结束时，对NSG小鼠实施安乐死后采集血液样本，以验证MDA递送赤藓醇可在实验动物体内产生循环中的赤藓醇水平。其中一只接受赤藓醇处理的小鼠未能采集到足量血液，因此无法进行LC/MS/MS检测。血清赤藓醇水平由约翰斯·霍普金斯大学医学院分析药理学共享资源平台通过LC/MS/MS测定。在对照组和DMSO（赤藓醇溶剂）组中未检测到循环赤藓醇，而在赤藓醇处理组小鼠中可检测到循环中的赤藓醇（图2）。值得注意的是，由于本实验中动物处死的时间和日期存在差异，赤藓醇处理组小鼠之间的循环赤藓醇水平可能存在一定变异。

MDA 治疗后肠道微生物群落保持不变。 使用 FVB/NJ 小鼠评估了 MDA 牛奶溶液（含或不含赤藓醇）对肠道菌群的影响。我们定量分析了治疗前（未接受任何处理/未给予 MDA）以及治疗开始后 7 天（包括训练期在内为 MDA 给予后第 9 天）采集样本的微生物组成。通过特异性 qPCR 分析评估发现，总细菌载量或核心肠道微生物群（Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium spp.、Streptococcus salivarius、Lactobacillus spp.）的整体组成均未发生显著变化（图 3），该方法此前已有描述21,22。有一笼小鼠在 MDA 治疗前后显示出 Lactobacillus 的显著差异；然而，该现象出现在 DMSO 溶剂对照组中，且并未在所有笼组中一致出现。

figure-results-1
图 1：MDA 可将厌氧菌递送至小鼠肠道，并可通过粪便 qPCR 进行定量。C57BL/6J 小鼠在饮水中连续两天接受抗生素处理。随后使用 MDA 方法给予厌氧菌 C. scindens。通过针对 desA 基因的 qPCR 检测抗生素处理后以及 MDA 处理后 24 小时（PBS 或 C. scindens）的小鼠粪便中 C. scindens（desA+） 细菌载量。（A）显示了抗生素处理后及 MDA 处理后 24 小时，PBS 处理组与 C. scindens 处理组小鼠之间 C. scindens 特异性的 desA 基因定量结果。 （B）将（A）中 MDA 处理后 24 小时的数据以柱状图形式展示。统计学显著性采用非参数 Mann-Whitney 检验确定。（*）p = 0.0286，误差线 = 标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：通过MDA技术给予雌马酚处理的NSG小鼠体内循环雌马酚水平的分析。 采用LC/MS/MS方法对对照组（n = 5）、DMSO（溶剂对照，n = 5）和雌马酚处理组（n = 4）小鼠的血清雌马酚水平进行定量。其中一只接受雌马酚处理的小鼠因采血量不足，无法完成LC/MS/MS检测。所有处理均通过MDA方法给予。血清雌马酚仅在雌马酚处理组中可被检测到。定量下限 < 5 ng/mL。统计学显著性通过非参数单因素方差分析结合多重比较（Dunn校正）确定。(**) p = 0.0053，误差线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：FVB/NJ小鼠经MDA处理后，核心肠道菌群及总细菌载量水平未发生显著变化。采用MDA方法处理前后，针对特定微生物群落的qPCR Cq值未观察到显著差异。Lactobacillus 仅在3号笼中于基线与MDA处理之间显示出显著差异（*，p = 0.0321），但该结果在各笼之间并不一致。笼号标记为C1-C4。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合多重比较（Tukey校正）确定。误差条表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

引物名称引物序列PCR 条件
DesA_CS_F5’-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3’93°C 3 min，34 个循环（95 °C 30 s，54 °C 30 s） 
DesA_CS_R5’-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3’

表1：解梭菌（C. scindens）的引物及qPCR反应条件。

引物名称引物序列PCR 条件
V6_F
V6_R		5’-CAACGCGWRGAACCTTACC-3’
5’-CRACACGAGCTGACGAC-3’		95 °C, 3 min
36 cycles
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5’-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3’
5’-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3’		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 cycles
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5’-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3’
5’-TGATAGGACGCGACCCCA-3’		95 °C, 3 min
36 cycles
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5’-CACGCCATGCTGGAAGTG-3’
5’-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3’		95 °C, 10 min
44 cycles
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5’-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3’
5’-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3’		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 cycles
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

表2：用于检测MDA对核心肠道菌群影响的引物及qPCR反应条件。

讨论

口服给药（OG）可能对实验动物造成显著的应激反应，从而引入混杂变量，这一点已在多项研究中得到评估7,9,11,12,13,14,15,23。由于OG具有侵入性，研究人员已采用其他替代技术以尽量减少与OG相关的问题9,10,12,13,14,15。微移液管引导的药物给药（MDA）是一种新型技术，可通过单通道移液管将目标药物与甜炼乳溶液混合，以较非侵入性的方式实现药物递送7。该技术的关键步骤是训练期（至少2天），使动物逐渐熟悉移液管尖端和甜炼乳的味道，从而整体缩短操作时间并减轻应激。此训练过程还可使小鼠更快地摄取掺入甜炼乳溶液中的药物，相比其他方法更迅速且剂量精确。

我们的研究严格遵循了Scarborough等人7所述的甜炼乳/水溶液的配制与给药方法。在整个研究过程中，小鼠在给药前未被剥夺饮水或食物。小鼠始终保留在各自的饲养笼中，每次处理时间少于1分钟。我们研究中的一个关键差异在于，可能由于我们所使用的白化品系小鼠存在视觉障碍的潜在可能，以及药物处理可能引起轻微的味觉厌恶，所有小鼠在训练和给药过程中均需要短暂地通过轻柔抓握颈背部皮肤进行固定。Vanhecke等人16也建议在MDA处理过程中采用该改良方法。 轻柔抓握颈背部皮肤并使小鼠呈仰卧位，有助于促使小鼠积极摄入乳液。我们认为，在训练和处理步骤中是否需要轻柔抓握颈背部皮肤是可选的，应根据具体研究而定。给药剂量根据动物体重进行校正（如适用），并以标准化体积给予，小鼠未表现出行为改变。对初始研究7的其他轻微修改包括减少了训练次数以及每次给予的体积。本研究中遇到的一些局限性包括部分小鼠在训练首日及研究过程中的某些时间点拒绝完全摄入全部剂量（100 µL）的乳液。这一问题通过在固定小鼠时使其保持仰卧位得以克服。本研究未评估药物与甜炼乳溶液之间的相互作用、不同性别小鼠在摄入量上的差异（尽管先前已有研究证明MDA在雌性小鼠中同样有效7,17），也未检测与灌胃（OG）相关的应激标志物（如皮质酮水平）的升高情况7,11,14。

在本研究中，我们重点关注了显微注射给药（MDA）技术递送实验性治疗剂精确剂量的能力，并检测了实验动物粪便和/或循环系统中相关治疗剂的水平。我们同样评估了MDA处理是否会影响肠道微生物群，结果观察到实验动物的核心粪便微生物群或总粪便细菌载量仅有轻微或无明显改变。此外，我们未观察到MDA处理对动物造成任何损伤。综上所述，MDA可作为在啮齿类动物模型中进行短期和长期治疗给药的一种替代方法。总体而言，MDA通过降低经口胃管给药（OG）相关损伤的风险，有望对动物福利产生积极影响。MDA克服了其他一些给药技术的部分局限性，我们建议其可在多种不同的啮齿类动物模型中广泛应用于转化医学研究24。

致谢

我们感谢美国国防部前列腺癌研究计划（W81XWH-20-1-0274）和前列腺癌基金会挑战奖（16CHAL13）提供的研究支持。我们谨向约翰斯·霍普金斯大学分析药理学共享资源平台的 Michelle Rudek 博士、Noushin Rastkari 博士、Nicole Anders 博士以及 Linping Xu 致以诚挚谢意，感谢他们在槐黄素 LC/MS/MS 检测方面提供的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
200 µL 移液器吸头Mettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 质谱检测器SciexN/A
Akkermansia muciniphila 菌株 muc 基因组 DNA美国模式培养物集存库BAA-835D-5
乙酸铵Sigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J 小鼠Jackson 实验室品系# 000664
C. scindens 菌株 35704美国模式培养物集存库35704
头孢西丁Sagent NDC25021-109-10
玉米油MedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
乙醇菲舍尔科技AC611050040
甲酸Sigma–Aldrich5.33002
FVB/NJ 小鼠Jackson 实验室品系# 001800
甘油Sigma–AldrichG5516
己烷菲舍尔科技02-002-996
LC-MS 级水菲舍尔科技14-650-357
甲醇菲舍尔科技02-003-340
微量采血管（含血清分离胶）贝克顿·迪金森02-675-185
分子生物学级水康宁46-000-CI
NSG 小鼠Jackson 实验室品系# 005557
PBS康宁21-031-CV
Qubit DNA HS 试剂盒InvitrogenQ32851
外消旋 equol-d4Santa Cruz 生物技术sc-219827
强化梭菌琼脂Anaerobe SystemsAS-6061
强化梭菌肉汤Anaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
用于 LC-MS 的 S-equol 参考标准品Cayman Chemical10010173
单通道移液器Rainin17008652
唾液链球菌基因组 DNA美国模式培养物集存库BAA-1024D-5
加糖炼乳California FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-葡萄糖醛酸酶（来源于 Helix pomatia）Sigma–AldrichG7017

参考文献

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